張彥青，劉娜，張麗，付鳳艷，張彥，陳靈智，王曉紅

(衡水學(xué)院 應(yīng)用化學(xué)系，河北 衡水 053000)

赤蘚紅(erythrosine，簡稱ETS)是一種人工合成色素，因外觀鮮艷、人工成本低、穩(wěn)定性好的優(yōu)點，故常被用于食品及調(diào)味品的加工與生產(chǎn)，以提高其感官性。但有數(shù)據(jù)表明，赤蘚紅色素被大量攝入人體后會危害人體健康[1-2]，聯(lián)合國糧農(nóng)組織和世界衛(wèi)生組織規(guī)定，人均日允許攝取量不能超過1.25 mg/kg[3]。溶菌酶(lysozyme，簡稱LYSO)是一種堿性蛋白，由129個氨基酸殘基構(gòu)成，包含6個色氨酸(Trp)殘基和3個酪氨酸(Tyr)殘基。而食用色素赤蘚紅經(jīng)食用后，會與人體中蛋白質(zhì)結(jié)合，將影響LYSO的結(jié)構(gòu)和性能。近年來，趙剛等[4]研究了赤蘚紅與牛血清白蛋白的相互作用機制及金屬離子Cu2+和Zn2+對其的影響。湯小玉等[5]利用同步熒光光譜法對日落黃與人血清蛋白的相互作用機制進行了研究。王新等[6]采用熒光發(fā)射光譜與紫外-可見分光光度法等多重光譜技術(shù)在模擬條件下研究燦爛甲酚藍與人血清白蛋白的結(jié)合對構(gòu)象的影響。本文通過光譜法和分子對接技術(shù)研究了ETS與 LYSO之間的作用機制，獲得了結(jié)合參數(shù)和熱力學(xué)參數(shù)，為食用合成色素在食品和調(diào)味品科學(xué)方面的應(yīng)用提供了一些有價值的信息。因此，研究色素對生物大分子的作用機制，從分子水平上闡明其效應(yīng)，有助于評價人工合成色素在食品及調(diào)味品行業(yè)的安全性[7]。

1 實驗部分

1.1 儀器

F-7000熒光儀 日本日立公司；HWSY11-K恒溫水浴鍋 北京市長風(fēng)儀器儀表公司；SZ-93純水蒸餾器 上海亞榮生化儀器廠。

1.2 試劑

LYSO濃度配成2.0×10-5mol/L的溶液，純度≥99%；ETS濃度配成1.0×10-4mol/L的溶液；為維持生理條件下的離子強度，在pH為7.40的Tris-HCl緩沖溶液中添加濃度0.15 mol/L 的NaCl溶液；實驗用水為雙蒸水。儲備液的保存條件：277 K，避光保存。

1.3 實驗方法

1.3.1 熒光猝滅法

在一定溫度(294，304，308 K)下向10.0 mL比色管中按順序加入1.0 mL Tris-HCl緩沖溶液、1.0 mL 2.0×10-5mol/L LYSO溶液和不同體積的濃度為1.0×10-4mol/L的ETS溶液后定容，搖勻并恒溫30 min。在激發(fā)波長為280 nm時，掃描ETS-LYSO體系的熒光光譜圖。

1.3.2 三維熒光光譜法

在294 K溫度下，取10 mL的比色管2支，均加入1.0 mL 2.0×10-5mol/L的LYSO溶液，加入1.0 mL pH為7.4的Tris-HCl緩沖溶液，向2支比色管中分別加入0，1.0 mL 1.0×10-4mol/L的ETS溶液后定容，2支比色管同時置于294 K溫度梯度下30 min，掃描三維熒光光譜。

1.3.3 分子對接

通過搜索蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中的蛋白晶體結(jié)構(gòu)，溶菌酶PDB代碼為132L，對溶菌酶的晶體結(jié)構(gòu)進行處理，刪除多余的水分子并進行分子力學(xué)優(yōu)化，作為分子對接的受體。獲取化合物ETS的分子結(jié)構(gòu)，加氫處理，并采用MOPAC程序[8]優(yōu)化結(jié)構(gòu)，計算PM3原子電荷。最后，采用AutoDock Tools 1.5.6[9]分別處理ETS和LYSO的結(jié)構(gòu)，然后對接模擬實驗利用AutoDock 4.2.6軟件處理，得到作用體系的最佳結(jié)合構(gòu)象[10]。

2 結(jié)果與討論

2.1 ETS-LYSO體系的熒光猝滅光譜

激發(fā)波長為280 nm時，固定LYSO的濃度，改變ETS的濃度，ETS與LYSO作用的熒光光譜圖見圖1。

圖1 ETS-LYSO的熒光發(fā)射光譜(T=294 K)Fig.1 The fluorescence emission spectra of ETS-LYSO system (T=294 K)

由圖1可知，隨著ETS濃度的增加，LYSO在343 nm處呈現(xiàn)有規(guī)律的降低，可見ETS對LYSO有熒光猝滅的作用并生成了穩(wěn)定的復(fù)合物。

通過Stern-Volmer[11]方程，猝滅常數(shù)Ksv、猝滅速率常數(shù)Kq與溫度的相關(guān)性判斷作用機制：

F0/F=1+Kqτ0[L]=1+Ksv[L]。

(1)

式中：F0、F分別為未加入ETS前和加入ETS后測出的熒光強度；τ0為分子熒光平均壽命,約為10-8s；[L]為加入ETS的濃度。根據(jù)[L]與F0/F的數(shù)據(jù)分別為橫、縱坐標作圖得到3個溫度下的3條直線，直線斜率為Ksv，得到數(shù)據(jù)結(jié)果見表1。

表1 不同溫度下ETS-LYSO體系的猝滅反應(yīng)參數(shù)Table 1 The quenching reactive parameters of ETS-LYSO system at different temperatures

由表1可知，3個溫度下的線性相關(guān)系數(shù)r1均大于0.99，說明3個溫度下的直線呈良好的線性關(guān)系，即ETS-LYSO體系相互作用是單一猝滅；3個溫度下的Kq值均大于2×1010L/(mol·s)(最大擴散碰撞猝滅常數(shù))，并且ETS-LYSO體系的Kq和Ksv值均隨著溫度的升高而降低，因此可確定ETS與LYSO體系的猝滅方式為靜態(tài)猝滅[12]。

用靜態(tài)猝滅公式lg[(F0-F)/F]=n·lg[L]+lgKa(2)，處理計算ETS與LYSO體系的結(jié)合常數(shù)Ka和結(jié)合位點數(shù)n，數(shù)據(jù)見表1。由表1可得n值約為1，說明ETS在與LYSO結(jié)合時只有一個結(jié)合位點[13]，即ETS-LYSO體系形成了1∶1的復(fù)合物；Ka值隨著溫度的上升而趨向減小，即該體系的結(jié)合能力降低，且都在104數(shù)量級，即該體系的結(jié)合能力降低，再一次說明ETS與LYSO相互作用方式為靜態(tài)猝滅。

2.2 ETS-LYSO 體系的作用力類型

根據(jù)Van't Hoff方程，公式RlnK=ΔS-ΔH/T(3)，ΔG=-RTlnK=ΔH-TΔS(4)，通過計算得到ETS與LYSO體系的熱力學(xué)參數(shù)，結(jié)果見表2。

表2 不同溫度下ETS-LYSO體系的熱力學(xué)參數(shù)

由表2可知，ΔG<0表明該體系的作用是自發(fā)進行的；ΔH<0表明體系復(fù)合物的形成過程是放熱反應(yīng)，作用過程存在氫鍵[14]；色素分子與蛋白分子之間存在疏水作用力的論據(jù)[15]是ΔS>0，由此推斷ETS與LYSO之間作用有氫鍵和疏水作用力存在。

有文獻報道當ΔH<0、ΔS>0時，認為體系間主要作用力類型為靜電作用力[16],因此試驗了離子強度因素對體系相互作用的影響。即ETS和LYSO的濃度為定值，改變NaCl的濃度，以NaCl的濃度CNaCl、F/F0為橫、縱坐標作圖，見圖2。

圖2 ETS-LYSO體系熒光強度隨NaCl濃度的變化(T=294 K)Fig.2 The changes in fluorescence intensity of ETS-LYSO system with NaCl concentration (T=294 K)

由圖2可知，NaCl的濃度增大時，F(xiàn)/F0的值幾乎沒有發(fā)生變化，證明離子強度的因素對ETS與LYSO的結(jié)合無影響，可推斷出ETS-LYSO體系在相互作用過程中的靜電作用力不是主要作用力[17]，再一次說明該體系的結(jié)合主要靠氫鍵和疏水作用力。

2.3 ETS-LYSO體系的三維熒光光譜圖

試驗考察了LYSO加入ETS前后的三維熒光光譜圖，見圖3。

(a)LYSO

由圖3可知,(a)圖為未加入ETS前LYSO在發(fā)射波長343 nm處的熒光強度，明顯高于(b)圖加入ETS后的熒光強度，即加入ETS后，LYSO的熒光強度明顯降低，說明ETS對LYSO發(fā)生熒光猝滅且程度較大，兩者產(chǎn)生了相互作用。

2.4 分子對接

通過分子對接模擬了ETS與LYSO作用的結(jié)合模型，結(jié)果顯示：結(jié)合體系的最低結(jié)合能ΔG0為-23.19 kJ/mol和通過實驗計算得到ΔG=-29.20 kJ/mol之間存在一定誤差，原因可能是ETS與LYSO模擬對接過程中排除了溶劑或除氨基酸殘基Trp、Tyr之外的受體的剛性[18]。分子對接的能量數(shù)據(jù)見表3，其中靜電能(ΔE3)在分子間相互作用中能占據(jù)的比例很小，因此再一次說明結(jié)合體系間主要作用力類型不是靜電作用。

表3 ETS-LYSO體系的對接能量Table 3 The docking energy of ETS-LYSO system kJ/mol

ETS與LYSO的最佳結(jié)合模式見圖4中(a)，ETS與溶菌酶的二維相互作用見圖4中(b)，顯示了ETS結(jié)構(gòu)中的羧基和羰基分別與Arg112和Trg63形成了氫鍵相互作用，結(jié)果表明ETS與LYSO的結(jié)合有氫鍵參與。ETS在LYSO中的結(jié)合位置見圖4中(c)，圖4中(d)進一步顯示結(jié)合位置周圍的氨基酸殘基，從結(jié)果來看，ETS還可以與周圍的疏水性氨基酸(Trp62、Ala107、Trp108和Val109)形成疏水作用，增強了分子與分子間的親和力。根據(jù)ETS與溶菌酶的結(jié)合模式可以發(fā)現(xiàn)，氫鍵和疏水作用是二者分子識別的關(guān)鍵作用力。Trp62、Trp63和Trp108等氨基酸殘基在ETS結(jié)合位點附近，可以一定程度上改變?nèi)芫钢猩彼岣浇h(huán)境的極性，進而導(dǎo)致溶菌酶的熒光猝滅，與熒光實驗所得結(jié)論一致。Asp52殘基和Glu35殘基是LYSO的催化位點，由圖4中(d)可以觀察到結(jié)合位置在催化位點附近，表明ETS與LYSO的結(jié)合會影響LYSO的催化位點附近氨基酸殘基的微環(huán)境，從而對LYSO催化活性產(chǎn)生影響。

圖4 ETS與LYSO的結(jié)合模式圖Fig.4 The binding pattern diagrams of ETS and LYSO

2.5 ETS-LYSO體系的結(jié)合率

為了更深入研究食用色素與蛋白質(zhì)體系的結(jié)合作用，進而通過理論計算體系的色素結(jié)合率和蛋白結(jié)合率，可以簡單預(yù)測食用色素進入人體與蛋白質(zhì)結(jié)合后，對蛋白質(zhì)自身的性能及對人體健康的影響。ETS-LYSO體系的結(jié)合率(W)公式如下[19]：

(5)

式中：Q為ETS的總濃度，B為LYSO的總濃度。

蛋白結(jié)合率為:

(6)

在溫度294，304，308 K下，實驗所用LYSO濃度為2.0×10-6mol/L，ETS的濃度在4.0×10-7～10×10-6mol/L范圍內(nèi)，利用表1的Ka值并結(jié)合公式(5)和(6)，計算不同溫度下ETS-LYSO體系的蛋白結(jié)合率W(B)分別為57.95%～93.02%(294 K)、40.25%～82.5%(304 K)、13.6%～45.35%(308 K)，蛋白游離率分別為42.05%～6.98%(294 K)、59.75%～17.5%(304 K)、86.4%～54.65%(308 K)。ETS-LYSO體系的色素結(jié)合率W(Q)為57.95%～18.6%(294 K)、40.25%～16.5%(304 K)、13.6%～9.07%(308 K)，色素游離率為42.05%～81.4%(294 K)、59.75%～83.5%(304 K)、86.4%～90.93%(308 K)。以接近人體溫度的308 K為例，可以看出在ETS-LYSO體系中隨著ETS濃度的增大，色素結(jié)合率隨之減少，而游離色素含量增加但變化程度不大。這是由于ETS濃度較高時，LYSO與ETS結(jié)合沒有足夠的結(jié)合位點，所以游離色素濃度幾乎不受結(jié)合作用的影響。

結(jié)合率研究的結(jié)果顯示在實驗條件下，游離的ETS濃度含量變化較小，說明攝入體內(nèi)的ETS受到ETS與LYSO結(jié)合作用的影響很小，但是游離的LYSO含量會隨著結(jié)合作用顯著降低，同時結(jié)合分子對接實驗的結(jié)論可知ETS與LYSO結(jié)合之后會對酶活性產(chǎn)生影響，因此可推測人們攝入ETS之后，會對LYSO的抗炎殺菌功能產(chǎn)生一定影響。因此，在ETS的實際應(yīng)用中要嚴格控制攝入劑量，ETS在食品中的合理食用提供了理論指導(dǎo)。

3 結(jié)論

本文采用光譜法和分子模擬對接研究了ETS與LYSO之間的相互作用，建立了ETS與LYSO的結(jié)合率模型。該方法探究了ETS與LYSO體系的結(jié)合率，并且利用結(jié)合率模型對LYSO本身抗炎殺菌功能提出了簡單的預(yù)測，在某些結(jié)合參數(shù)上可能會有誤差，但是該方法簡便快速，適用范圍較廣，為研究食用合成色素類小分子物質(zhì)對蛋白質(zhì)分子的性能及人體健康的影響提供了一條新的思路和在食品及調(diào)味品中的合理應(yīng)用提供了理論指導(dǎo)[20]。