杜俊杰 劉仕成 江哲龍 潘凡 江藝 呂立志

原發(fā)性肝癌是我國第4位常見惡性腫瘤及第2位腫瘤致死病因，肝細胞癌（肝癌）是其主要病理類型，約占90%[1-2]。肝移植是根治性治療肝癌的方法之一，但肝移植術后5年腫瘤復發(fā)率達20.0%～57.8%，復發(fā)受者的中位生存期僅為7～16個月[3-4]。既往研究表明，肝癌肝移植術后復發(fā)與腫瘤分期、血管侵犯、免疫抑制劑用量等因素相關[5-8]，但仍缺乏有效的基因標志物。

堿性亮氨酸拉鏈和W2結構域2（basic leucine zipper and W2 domain 2，BZW2）是堿性亮氨酸拉鏈（basic leucine zipper，bZIP）轉錄因子超家族成員之一，是一種進化高度保守的蛋白，可通過黏附蛋白參與細胞間的黏附[9-10]。既往研究表明，BZW2在膀胱癌、骨肉瘤、結腸癌、喉乳頭狀瘤中表達上調(diào)且與預后相關[11-14]。異戊酰輔酶A脫氫酶（isovaleryl-CoA dehydrogenase，IVD）催化異戊基輔酶A轉化為3-甲基丙烯酰輔酶A，其表達異常可影響亮氨酸代謝并導致異戊酸血癥[15-18]。然而，筆者查閱文獻，尚未見BZW2和IVD對肝癌肝移植術后的腫瘤復發(fā)和預后影響的研究報道。本研究旨在探討肝癌組織中BZW2和IVD的表達及其與肝癌肝移植術后腫瘤復發(fā)和預后的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

回顧性分析87例于2015年1月至2018年12月在中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第九〇〇醫(yī)院肝膽外科行同種異體原位肝移植受者的臨床資料及病理標本，包括肝癌組織和正常肝組織。其中男76例，女11例，年齡20～73歲。納入標準：（1）術后病理確診為肝細胞癌；（2）術前病歷資料及術后隨訪資料完整；（3）病理標本保存齊全；（4）符合美國加州大學舊金山分校（University of California, San Francisco，UCSF）標準。排除標準：（1）圍手術期死亡；（2）合并嚴重基礎疾??；（3）失訪；（4）非腫瘤相關性死亡。

所有受者通過門診復查、住院治療及電話進行隨訪，術后2年內(nèi)每3個月復查1次，術后2年后每半年復查1次。隨訪至術后60個月或受者死亡。隨訪內(nèi)容包括血常規(guī)、肝功能、甲胎蛋白（alpha-fetoprotein，AFP）水平及影像學檢查等。

供者來源均為心臟死亡器官捐獻（donation after cardiac death，DCD）。術后免疫抑制方案為糖皮質(zhì)激素+他克莫司+嗎替麥考酚酯。抗乙型病毒性肝炎（乙肝）復發(fā)方案為恩替卡韋+乙肝人免疫球蛋白。本研究經(jīng)中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第九〇〇醫(yī)院倫理委員會批準。

1.2 實驗方法

采用免疫組織化學染色檢測BZW2和IVD的表達。肝組織石蠟切片經(jīng)二甲苯脫蠟，乙醇梯度洗滌后進行抗原修復。3%過氧化氫溶液孵育10 min，二抗來源羊血清封閉液室溫孵育30 min。滴加抗BZW2抗體（1∶200）、抗IVD抗體（1∶200）（抗體均購自英國Abcam公司），4 ℃孵育過夜。次日37 ℃復溫，滴加增強劑，室溫孵育20 min后，滴加100 μL增強酶標山羊抗兔IgG聚合物，室溫孵育20 min。3，3'-二氨基聯(lián)苯胺（3,3'-diaminobenzidine，DAB）染色1 min，顯微鏡下觀察顏色反應，自來水沖洗10 min，蘇木素復染40 s，再用自來水沖洗10 min，烘干后中性樹脂封片。在顯微鏡下觀察染色情況，BZW2和IVD在細胞質(zhì)中呈現(xiàn)淡黃、棕黃或褐色顆粒。根據(jù)陽性細胞著色強度和陽性細胞比例進行評分：無染色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，褐色為3分；陽性細胞數(shù)<10%為0分，10%～25%為1分，26%～50%為2分，>50%為3分。兩項得分相乘，≤4分為低表達，>4分為高表達。

1.3 研究內(nèi)容

分析肝癌肝移植受者術后腫瘤復發(fā)轉移情況。檢測肝癌組織和正常肝臟組織中BZW2和IVD的表達情況，分析肝癌肝移植受者術前原發(fā)腫瘤病灶BZW2和IVD的表達與臨床病理參數(shù)[年齡，性別，腫瘤直徑，AFP水平，腫瘤、淋巴結、轉移（tumor，node，metastasis，TNM）分期[19]，有否血管侵犯，有否腫瘤包膜，腫瘤數(shù)量]之間的關系；分析肝癌肝移植受者BZW2和IVD的表達情況與術后復發(fā)及生存情況的關系。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 23.0軟件進行統(tǒng)計學分析。計數(shù)資料以率表示，比較采用χ2檢驗或Fisher確切概率檢驗。采用Kaplan-Meier繪制生存曲線，采用log-rank檢驗進行生存分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 肝癌肝移植受者術后腫瘤復發(fā)轉移情況

截止至2021年3月，87例肝癌肝移植受者隨訪時間3～68個月，中位隨訪時間33個月。隨訪期間共有31例腫瘤復發(fā)，復發(fā)率為36%，復發(fā)時間為術后2～49個月，復發(fā)時間中位數(shù)為7個月。復發(fā)轉移部位包括肺20例（65%）、肝11例（35%）、骨9例（29%）、腹腔3例（10%）、腎上腺l例（3%）。

2.2 BZW2和IVD在肝癌組織和肝組織中的表達情況

免疫組織化學染色結果顯示，陽性染色部位主要在細胞漿（圖1）。肝癌組織的BZW2陽性表達率為76%（66/87），高于正常肝組織的30%（26/87），差異有統(tǒng)計學意義（χ2=26.903，P<0.01）；肝癌組織的IVD陽性表達率為51%（44/87），低于正常肝組織的69%（60/87），差異有統(tǒng)計學意義（χ2=13.167，P<0.01）。

圖1 BZW2和IVD在肝癌組織和肝組織中的表達Figure 1 Expression of BZW2 and IVD in hepatocellular carcinoma tissues and liver tissues

2.3 BZW2和IVD與肝癌臨床病理參數(shù)的關系

BZW2、IVD與肝癌臨床病理參數(shù)關系的分析結果見表1。BZW2的表達水平與腫瘤直徑、有否腫瘤包膜有關（均為P<0.05），與其他臨床病理參數(shù)無關（均為P>0.05）。IVD的表達水平與腫瘤直徑、AFP水平、TNM分期、有否血管侵犯有關（均為P<0.05），與其他臨床病理參數(shù)無關（均為P>0.05）。

表1 BZW2和IVD與肝癌肝移植臨床病理參數(shù)的關系Table 1 Relationship between BZW2 and IVD and clinicopathological parameters of liver transplantation for hepatocellular carcinoma [n (%)]

2.4 BZW2和IVD表達與肝癌肝移植受者術后復發(fā)和生存的關系

87例肝癌肝移植受者術后1、3、5年累積復發(fā)率分別為27.6%、36.9%、40.2%；l、3、5年累積生存率分別為80.5%、47.7%、34.7%。各組肝移植受者的生存曲線見圖2，BZW2高表達組受者腫瘤累積復發(fā)率高于BZW2低表達組（χ2=4.938，P<0.05），累積生存率低于BZW2低表達組（χ2=4.464，P<0.05），IVD低表達組受者腫瘤累積復發(fā)率高于IVD高表達組（χ2=5.606，P<0.05），累積生存率低于IVD高表達組（χ2=5.703，P<0.05）。

圖2 BZW2和IVD的表達與肝癌肝移植受者預后的關系Figure 2 Relationship between the expression of BZW2 and IVD and the prognosis of liver transplant recipients with hepatocellular carcinoma

3 討 論

肝移植是肝癌的根治性治療手段之一，腫瘤復發(fā)是肝癌肝移植術后面臨的主要問題[4,20-25]。肝癌肝移植術后有無腫瘤復發(fā)則是受者術后能否長期生存的關鍵，但目前仍缺乏有效評估預測肝癌肝移植術后腫瘤復發(fā)和轉移的方法。

BZW2是一種進化上高度保守的蛋白，與翻譯起始因子eIF2和eIF3相互作用，進而調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)合成[26]。Huang等[13]認為，BZW2在大多數(shù)實體腫瘤中作為一種致癌基因，涉及多種信號通路，他們發(fā)現(xiàn)BZW2可通過激活細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）/絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號通路，促進結直腸癌的細胞增殖、侵襲和遷移。Jin等[27]研究表明，BZW2過表達顯著激活肝癌細胞的磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）信號通路，促進腫瘤細胞增殖，同時降低PI3K抑制劑的抑制效率，導致腫瘤發(fā)生和進展。而下調(diào)BZW2的表達，可以導致G1期細胞周期停滯[11]，并通過抑制Akt/mTOR信號通路，進而抑制骨肉瘤細胞的生長[12]。近年來，也有關于BZW2表達在肝癌細胞侵襲轉移過程中的研究[26,28-29]，但缺乏臨床資料驗證且未應用于肝移植術后復發(fā)的預測中。IVD催化異戊基輔酶A轉化為3-甲基丙烯酰輔酶A，既往研究表明其表達與某些微生物能量代謝相關[30-32]，在人體中IVD的表達異常可影響亮氨酸代謝并導致異戊酸血癥，Lee等[33]發(fā)現(xiàn)肝癌門靜脈血栓形成中代謝蛋白水平下調(diào)，但未進行更深入研究。

本研究結果表明BZW2的表達在肝癌組織中上調(diào)，IVD的表達在肝癌組織中下調(diào)，且BZW2高表達與肝癌直徑較大、無腫瘤包膜有關，IVD低表達與腫瘤直徑較大、AFP水平較高、腫瘤TNM分期Ⅲ～Ⅳ期、有血管侵犯有關。生存分析結果顯示BZW2高表達組和IVD低表達組受者腫瘤復發(fā)率較高， 生存率較低，提示肝癌組織BZW2高表達和IVD低表達的受者可能存在腫瘤復發(fā)轉移的潛在風險。

綜上所述，BZW2和IVD有可能成為預測肝癌肝移植受者預后的潛在指標。但由于本研究樣本量較小，且為單中心回顧性研究，上述研究結果仍需進一步證實。后續(xù)研究中將對供肝中BZW2和IVD的表達情況進行檢測，排除相關干擾。關于BZW2和IVD如何調(diào)控腫瘤增殖和轉移，也有待進一步深入研究。