趙冰

“我們總是低估五或十年中能夠做到的。技術的力量正呈指數(shù)級增長，而非線性?！薄葼枴どw茨。在2021年同濟移植論壇上，題為“類器官：疾病模擬與再生展望”的學術報告，引發(fā)了多位器官移植領域?qū)＜覍︻惼鞴僭偕t(yī)學的熱烈討論和思考。本文就類器官的出現(xiàn)、發(fā)展和應用進行綜述，總結(jié)類器官技術的主要應用場景，重點突出其在再生醫(yī)學領域中的重要價值。隨后以腸道類器官和膽道類器官為代表，具體闡述了人源類器官在器官移植中的應用，并就類器官移植應用的瓶頸和未來發(fā)展方向展開討論。

1 類器官技術的出現(xiàn)、發(fā)展和應用

1.1 類器官出現(xiàn)的背景

2009年，腸道類器官培養(yǎng)技術的出現(xiàn)是器官發(fā)育領域的一項重大進步[1]?；趯δc上皮細胞行為和信號調(diào)控機制的充分認識，荷蘭科學家以小鼠小腸隱窩底部快速增殖的、Lgr5標記的成體組織干細胞為種子，使用基質(zhì)膠和多種生長因子營造了模擬體內(nèi)微環(huán)境的體外三維培養(yǎng)體系，最終構(gòu)建出與體內(nèi)小腸上皮“絨毛-陷窩”結(jié)構(gòu)高度一致、包含所有細胞類型的“迷你腸道”（圖1）。

圖1 體外構(gòu)建小腸類器官示意圖Figure 1 Schematic diagram of in vitro construction of small intestinal organoids

1.2 類器官技術的發(fā)展

在小鼠小腸類器官培養(yǎng)基礎上，科學家通過方法優(yōu)化，逐步實現(xiàn)了小鼠結(jié)腸、人小腸、人結(jié)腸、人結(jié)腸腫瘤的類器官培養(yǎng)體系[2]。隨后，各種衍生自小鼠和人的其他消化道器官上皮的類器官如雨后春筍般大量涌現(xiàn)，包括食道、膽囊、肝臟、胰腺和胃等。使用類似的方法，也可以從其他非消化道上皮組織如乳腺、肺臟、輸卵管、前列腺、膀胱等的成體組織干細胞中構(gòu)建出相應的類器官[3]（圖2）。此外，腫瘤組織來源的類器官，包括結(jié)腸癌、胃癌、肝癌、肺癌、食管癌、宮頸癌、甲狀腺癌、前列腺癌、膀胱癌、胰腺癌、腎癌等類器官，在腫瘤基礎研究、藥物研發(fā)和精準醫(yī)學中彰顯了重要作用[4]。

圖2 不同正常組織來源的類器官Figure 2 Organoids derived from different normal tissues

類器官不僅可以從成體組織干細胞培養(yǎng)得到，還可以從胚胎干細胞或誘導多能干細胞定向分化得到，它們都利用了干細胞在合適組織微環(huán)境中無限擴增的潛力。相較于胚胎干細胞或誘導多能干細胞，成體組織干細胞長期以來被認為不能在體外二維培養(yǎng)條件下有效擴增，而類器官培養(yǎng)技術的完善已使成體組織干細胞在體外長期穩(wěn)定擴增成為可能。此外，許多已建立的生物學前沿技術，如CRISPR/Cas9基因編輯、多組學、單細胞測序、冷凍電子顯微鏡和高分辨率顯微鏡等技術均可以應用于類器官，這些技術的日益完善進一步放大了類器官在生物學和醫(yī)學研究中的應用價值[5]。

1.3 類器官的定義與特性

“類器官”（organoid）一詞最初用于腫瘤學，早在1946年，Smith和Cochrae就用“類器官”來描述囊性畸胎瘤。在隨后的幾年里，培養(yǎng)系統(tǒng)中的器官型結(jié)構(gòu)被看作是“類器官”。因此，在經(jīng)典的發(fā)育生物學研究中，雖然三維細胞聚集物并不能完全代表體內(nèi)組織結(jié)構(gòu)，但依然被稱為“類器官”。直到2009年腸道類器官誕生，“類器官”一詞才獲得了明確的含義——由干細胞經(jīng)體外三維培養(yǎng)產(chǎn)生的“類似”器官樣、具有自我更新和自我組織能力、結(jié)構(gòu)和功能與來源組織或器官高度相似的微型器官[6]。

類器官最重要的特性是在體外培養(yǎng)環(huán)境中干細胞具有高度組織記憶和自我組裝能力，能夠自己長成類似于體內(nèi)組織的結(jié)構(gòu)，高度還原體內(nèi)器官的細胞構(gòu)成和功能，并且在長期擴增的同時保持遺傳和表型穩(wěn)定，解決了傳統(tǒng)研究模型無法實現(xiàn)人源化和組織模擬的痛點，為基礎研究和醫(yī)學轉(zhuǎn)化提供了一個很好的模型系統(tǒng)[7]。

1.4 類器官技術的應用場景

類器官技術的發(fā)展促進了人們對疾病模型、藥物研發(fā)、精準醫(yī)學、發(fā)育生物學、病原微生物宿主相互作用、毒理學、基因編輯以及再生醫(yī)學的深入研究[8-26]（圖3）。下面，我們將舉例說明類器官的主要應用場景。

圖3 類器官技術的主要應用場景Figure 3 Main application scenarios of organoid technology

1.4.1 疾病模型 類器官非常適合用于傳染病研究，特別是局限于人類并且依賴于特定細胞類型的病原體的研究。比如，利用腸道類器官模擬隱孢子蟲的體內(nèi)感染，發(fā)現(xiàn)隱孢子蟲可以在腸道類器官中大量復制并完成其生命周期，充分說明腸道類器官細胞適合其生長和繁殖[27]。在傳染病的研究中最引人注目的便是利用類器官研究新型冠狀病毒SARS-CoV-2對人體的致病機制。2020年初，我國國民健康受到新型冠狀病毒肺炎（新冠肺炎）的嚴重威脅，但新冠肺炎致病機制研究和藥物開發(fā)缺乏人體組織模型。我們團隊依靠自身成熟的人源類器官技術，構(gòu)建了人源類器官新型冠狀病毒感染模型，發(fā)現(xiàn)新型冠狀病毒可以高效侵染并損傷人體肝臟組織，揭示了臨床新冠肺炎患者肝損傷出現(xiàn)的誘因[28]。這是在國際范圍內(nèi)首次為新型冠狀病毒呼吸系統(tǒng)以外的器官侵染和損傷提供直接實驗證據(jù)，也引領了國際多個獨立研究組利用腸道、腎臟、血管、肺臟、大腦等人源類器官探究新型冠狀病毒的嗜性和致病機制?！禢ature News》于2020年6月進行了專題新聞報道《微型器官揭示新型冠狀病毒如何破壞機體》，并在《Nature》官網(wǎng)主頁高亮我們的工作。這些工作凸顯了類器官技術在應對人類突發(fā)重大感染性疾病時的重要價值。

1.4.2 藥物開發(fā) 腸道、肝臟、腎臟等器官對藥物或環(huán)境改變較為敏感，易受到藥物毒性作用發(fā)生應激和損傷。培養(yǎng)成體組織干細胞或者多能干細胞來源的腸道、肝臟、腎臟等類器官，能夠為新藥進入臨床前的毒性評價提供體外人源化模型[29]。

此外，多種疾病、腫瘤類器官大規(guī)模生物樣本庫的建立將加快藥物開發(fā)的進展，使得能夠針對特定疾病來篩選大量藥物，或者使用特定藥物針對特定疾病的不同亞型進行篩選。尤其對于因患者數(shù)量少而無法進行大規(guī)模臨床試驗的罕見遺傳疾病，類器官技術可為藥物開發(fā)提供解決方案[30]。

1.4.3 精準醫(yī)療 類器官技術能夠在體外快速地測試特定患病組織對不同藥物的反應。腫瘤的治療一直是全球的重大健康科學問題。利用類器官培養(yǎng)技術，可以從患者來源的腫瘤組織樣本中建立腫瘤類器官，并在體外測試腫瘤對于放射治療或者化學藥物治療、靶向藥物治療、免疫細胞治療等的有效性。另外，建立腫瘤類器官樣本庫，通過基因組測序聯(lián)合藥物敏感性測試的大數(shù)據(jù)分析，可使得將腫瘤的遺傳背景與藥物反應聯(lián)系在一起成為可能[31]。研究人員構(gòu)建了結(jié)腸癌患者不同位置腫瘤的類器官，發(fā)現(xiàn)各個區(qū)位腫瘤所突變都不同，且轉(zhuǎn)錄組和甲基化水平也存在差異，而腫瘤類器官可以很好地保留這些腫瘤異質(zhì)性[32]。

1.4.4 再生醫(yī)學 類器官在再生醫(yī)學領域中的應用是將成體組織干細胞培養(yǎng)得到的類器官移植回體內(nèi)，修復受損組織[26]。目前成體組織干細胞在臨床上的移植應用僅限于利用造血干細胞移植來治療自身免疫性疾病、白血病和淋巴瘤，這主要得益于造血干細胞的自身特性，造血干細胞在骨髓中以單個懸浮狀態(tài)生長，其體外培養(yǎng)、移植都很容易實現(xiàn)。但是其他成體組織干細胞，包括腸道、肝臟、肺臟、腎臟等成體組織干細胞的生長需要非常緊密的細胞連接和微環(huán)境支持，將這些細胞分離培養(yǎng)本身就很難，移植就更無法實現(xiàn)。而類器官可作為這些細胞在體外存活、高效擴增和移植的載體，為成體組織干細胞再生醫(yī)學應用注入強心劑。國家重點研發(fā)計劃已從“十三五”的“干細胞及轉(zhuǎn)化研究”發(fā)展為“十四五”的“干細胞研究與器官修復”，重要變化之一就是將類器官列為主要研究和發(fā)展方向，進一步提示類器官有可能成為器官修復取得重大突破的關鍵。

2 類器官在器官移植領域的應用前景

2.1 類器官與再生醫(yī)學

類器官技術與再生醫(yī)學淵源頗深。事實上，類器官在誕生之初就將再生醫(yī)學作為它的愿景，將類器官應用于器官移植領域的嘗試從未間斷。早在類器官技術開發(fā)的早期，研究人員便在小鼠模型中嘗試使用腸道類器官修復受損的組織[33]。通過將體外培養(yǎng)的類器官直接灌注到結(jié)腸炎小鼠腸內(nèi)，研究人員發(fā)現(xiàn)類器官能夠修復受損的腸上皮，外源的類器官修補了隱窩結(jié)構(gòu)，其結(jié)構(gòu)和細胞組成均與小鼠自身腸道相同，經(jīng)過類器官治療的小鼠健康狀況也逐漸恢復，這充分展現(xiàn)了類器官在再生醫(yī)學領域的巨大潛力。

理論和實踐總是結(jié)伴而行，在腸道類器官成功治療了結(jié)腸炎小鼠后，科學家們意識到體內(nèi)移植實驗不僅僅是檢驗類器官分化能力的方法，更是通向組織再生的光明道路。隨著各種新型類器官的開發(fā)，類器官移植也在肝臟、肝外膽道、肺臟、胰島、大腦、皮膚等系列組織器官中得到實踐[34-39]，得益于其獨特的增殖能力和組織特異性，類器官移植能夠很好地還原和修補體內(nèi)的結(jié)構(gòu)而不發(fā)生畸形或腫瘤[40]。更振奮人心的是，在1型糖尿病模型中，使用胰島類器官的治療效果優(yōu)于直接使用組織分離的新鮮胰島細胞[41]，這進一步表明類器官在再生醫(yī)學中的前景和獨特優(yōu)勢。

2.2 人源類器官移植探索

目前已有多種不同類型的類器官被報道用于移植，但僅限于原位或異位移植到小鼠、大鼠或雞胚上，包括腎臟、腸道、肝臟、胰腺、大腦、心臟、肺臟、視網(wǎng)膜等，可實現(xiàn)類器官在體內(nèi)的生長和一定時期的維持。

2.2.1 腸道類器官移植治療短腸綜合征 小腸是吸收營養(yǎng)的主要器官，大規(guī)模切除小腸會導致短腸綜合征（short bowel syndrome，SBS），這是一種嚴重的吸收障礙，以腹瀉、脫水和體質(zhì)量減輕為特征?；颊叱３Ｐ枰邮苋c外營養(yǎng)以彌補營養(yǎng)不足，或使用腸激素類似物或進行外科手術。當以上策略都失效或出現(xiàn)了嚴重腸外營養(yǎng)支持并發(fā)癥時，腸道移植成為了治療SBS最后的選擇。

自2009年Hans Clevers團隊首次建立小腸類器官以來，類器官技術已經(jīng)可以實現(xiàn)人腸上皮組織在體外的無限擴增，這使腸道類器官成為再生醫(yī)學中極具潛力的移植物。但由于小腸是一個高度血管化并依賴肌肉組織和神經(jīng)系統(tǒng)以發(fā)揮正常功能的器官，體外構(gòu)建包含復雜間質(zhì)支持系統(tǒng)的小腸類器官仍是一個挑戰(zhàn)。

2021年年初Toshiro Sato團隊在《Nature》上報道了大鼠中移植小腸類器官可改善嚴重的SBS[42]。基于小腸和結(jié)腸上皮下結(jié)構(gòu)的相似性，作者使用回腸類器官替代天然結(jié)腸上皮，可以生成一個高度血管化且具備功能的小腸化結(jié)腸，其能夠形成包含脈管系統(tǒng)和神經(jīng)支配、絨毛結(jié)構(gòu)和乳糜管在內(nèi)的完整的小腸結(jié)構(gòu)。將小腸化結(jié)腸移植到SBS大鼠中，可恢復其吸收功能并顯著改善腸衰竭，同時對腸道菌群的重塑有一定作用。因類器官可以由單個干細胞生長而成，即使是SBS患者短殘小腸的活組織檢查標本也足以提供適合自體移植的干細胞資源。該研究證實了利用腸道類器官實現(xiàn)再生的可行性，對大型動物和人類也具有治療潛力，為其他管腔器官的再生移植提供了新策略。

2.2.2 膽道類器官移植修復受損膽道 目前能夠?qū)崿F(xiàn)類器官移植并在體內(nèi)存活的研究僅局限于動物模型，關于類器官在人體中的安全性和有效性一直未見報道。2021年2月，《Science》首次報道了在人體器官上進行類器官移植的成果，通過將體外培養(yǎng)的膽道類器官移植到離體條件下的人類肝臟中，可實現(xiàn)受損膽道的修復和再生[43]。該研究首先將膽囊來源的膽道上皮細胞在體外培養(yǎng)成類器官，并移植到肝臟膽道疾病的小鼠模型中，發(fā)現(xiàn)受損的肝內(nèi)膽道的確能夠被修復，這意味著肝外細胞可用于修復急性肝內(nèi)膽道損傷。隨后研究人員對因膽道損傷而被放棄用于移植的人類供者肝臟使用了常溫灌注系統(tǒng)，使肝臟在長時間離體條件下維持其生理功能，將其作為人體模型評估膽道類器官修復人類膽道的治療潛力。作者將膽囊類器官移植到肝內(nèi)膽道中，發(fā)現(xiàn)移植物可保留在膽道腔室內(nèi)并與受者形成連接，并實現(xiàn)膽道的再生和膽汁性質(zhì)的改善，與小鼠模型中的數(shù)據(jù)相互印證。該研究的卓越之處在于首次證實了利用實驗室中培養(yǎng)的類器官可以在人體器官上實現(xiàn)移植并發(fā)揮作用，開辟了人源類器官移植的新道路，為類器官移植應用于臨床奠定了基礎。

2.3 類器官移植應用的瓶頸與未來發(fā)展方向

2.3.1 倫理法規(guī)、臨床試驗 細胞治療指的是將從患者體內(nèi)獲得的正常細胞或具有特定功能的細胞在體外擴增或生物改造后重新輸入患者體內(nèi)，修復其受損的組織器官或增強免疫反應，從而實現(xiàn)疾病的治療。細胞治療主要包括干細胞治療和免疫細胞治療兩種，已在器官移植、腫瘤治療、免疫性疾病治療等領域展現(xiàn)出了獨特魅力。

自20世紀90年代以來，我國出臺了多項政策和法規(guī)以規(guī)范化細胞治療的研究和轉(zhuǎn)化，如《基因修飾細胞治療產(chǎn)品非臨床研究與評價技術指導原則》《人源性干細胞及其衍生細胞治療產(chǎn)品臨床試驗技術指導原則》《免疫細胞治療產(chǎn)品臨床試驗技術指導原則》等。由于細胞治療所使用的對象和方法過于多樣，相關的標準和指南需要不斷更新，也就導致了細胞治療的審批往往比較細致和復雜。類器官作為多種細胞類群的集合體，其相關研究和轉(zhuǎn)化的審批與細胞治療相同，但由于其細胞類群更加多樣性也更加復雜，對其進行標準化和審批也更加困難。我們正在與華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院團隊合作，開展類器官修復缺血-再灌注損傷的臨床前研究，嘗試建立移植用類器官的精細評價。

2.3.2 類器官技術標準化及人源類器官培育規(guī)?；?由于細胞來源和個體來源的多樣性，世界上不存在兩個完全相同的類器官，而干細胞的多向分化能力也導致一個類器官內(nèi)部存在較大異質(zhì)性，這種復雜性可能會為類器官應用于人體帶來一定風險。GMP（good manufacturing practice）意為“良好生產(chǎn)規(guī)范”，是一套適用于食品、藥品和醫(yī)療產(chǎn)品的強制性標準。產(chǎn)品生產(chǎn)必須符合GMP要求，產(chǎn)品質(zhì)量必須達到法定標準，因此產(chǎn)品生產(chǎn)過程中的方方面面都需要被評估和規(guī)范化，最終確保產(chǎn)品質(zhì)量的穩(wěn)定性、安全性和有效性。類器官技術最終轉(zhuǎn)化到臨床應用成為一種醫(yī)療產(chǎn)品，也必須實現(xiàn)GMP標準化。

血清是體外細胞培養(yǎng)中最常見的添加物之一，其中所包含的各種血漿蛋白、生長因子等能夠為細胞生長提供良好的條件，但血清中尚有部分成分未知，且質(zhì)量不夠穩(wěn)定，因此使用類器官培養(yǎng)體系的最大優(yōu)勢就是去除血清，以此規(guī)避一切可能因血清質(zhì)量不佳或不穩(wěn)定而帶來的負面影響。在缺乏血清的培養(yǎng)環(huán)境中，類器官的生長不得不依賴額外添加的生長因子，而不同細胞所需要的生長因子種類、濃度及添加順序也不同，因此對生長因子進行GMP標準化并不容易。此外，類器官三維結(jié)構(gòu)的形成離不開基質(zhì)膠為其提供空間支持，目前最常用的基質(zhì)膠來源于小鼠肉瘤的基底膜基質(zhì)，將這種動物腫瘤來源的物質(zhì)用在人體中必須考慮安全問題，這也成為了類器官技術應用于人體的最大安全評價障礙。

為支撐推進類器官移植應用，我們團隊在生長因子GMP標準化、基質(zhì)膠取代和類器官大規(guī)模培育方面進行了諸多努力，尤其是實現(xiàn)了在膽道類器官培養(yǎng)中使用小分子藥物組合完全代替4種生長因子[44]，而開發(fā)不依賴基質(zhì)膠的類器官發(fā)酵工藝也在順利推進中。

2.3.3 基于類器官的復雜人工器官構(gòu)建 體外培育器官一直是科學家的夢想，而類器官僅僅是邁出的第一步。構(gòu)建更接近體內(nèi)器官高級結(jié)構(gòu)的復雜人工器官是前沿科研的需要。在腸道研究中已有使用3D打印技術或脫細胞骨架的方法來構(gòu)建人工腸道的案例[17，45]，通過為類器官提供接近體內(nèi)組織空間結(jié)構(gòu)的培養(yǎng)環(huán)境，研究人員打破了傳統(tǒng)培養(yǎng)皿培養(yǎng)的束縛，突破性地產(chǎn)生了具有腸道宏觀解剖結(jié)構(gòu)的人工腸道，并能夠還原腸道的微生物環(huán)境。在類器官基本單元基礎上，融合多種組織工程策略，構(gòu)建高級復雜人工器官將得到更多關注。但值得注意的是類器官技術本身標準化還有諸多工作要做，且高級復雜人工器官未來應用于再生醫(yī)學，更多期待是解決全局性器官缺陷，在修復局部組織損傷上，類器官或許具有更好的移植相容性，這些也需要認真評價。

3 小 結(jié)

類器官具有在體外模擬真實器官三維結(jié)構(gòu)、細胞組成和功能的特性，使其在生物醫(yī)學和再生醫(yī)學領域擁有廣闊的應用前景。作為突破性前沿技術，類器官在器官移植領域的應用仍處于初步的、待研究開發(fā)的狀態(tài)，雖已有諸多類器官移植的積極數(shù)據(jù)，但距離大規(guī)模臨床應用仍較遠，需要整個領域的不斷努力探索。如何推進類器官再生醫(yī)學健康、快速發(fā)展，使器官移植借力生命科技迅猛發(fā)展的東風進入新的時代，始終保持我國器官移植走在國際最前沿，是我們共同的期待和使命。