劉 倩, 羅 迪, Roman JASHENKO, 季 榮,*

(1. 新疆師范大學生命科學學院, 中亞區(qū)域跨境有害生物聯(lián)合控制國際研究中心,新疆特殊環(huán)境物種保護與調(diào)控生物學自治區(qū)重點實驗室, 新疆特殊環(huán)境物種多樣性應用與調(diào)控教育廳重點實驗室,烏魯木齊 830054; 2. 哈薩克斯坦阿勒法拉比國立大學, 阿拉木圖 050038)

海藻糖作為二糖類碳水化合物不僅可以在各種環(huán)境脅迫條件下保護蛋白和細胞分子結(jié)構(gòu)，抵抗不良環(huán)境(Tangetal., 2008)，還可作為能量物質(zhì)和碳源參與生物體的代謝過程(Argüelles, 2000)。海藻糖酶是昆蟲體內(nèi)唯一水解海藻糖的酶，將海藻糖水解形成葡萄糖為昆蟲的生長發(fā)育提供能量(唐斌等, 2012)，海藻糖酶可分為可溶型海藻糖酶(TreS或Tre1)和膜結(jié)合型海藻糖酶(TreM或Tre2)，前者主要存在于消化系統(tǒng)和循環(huán)系統(tǒng)，后者主要存在于肌肉中，飛行類昆蟲體內(nèi)的TreM活性相對較高(Derr and Randall, 1966)。海藻糖酶是由海藻糖酶基因(Treh)編碼，最先從昆蟲中克隆出的海藻糖酶基因是可溶型海藻糖酶基因Treh1(Takiguchietal., 1992)，2005年膜結(jié)合型海藻糖酶基因在家蠶Bombyxmori中被發(fā)現(xiàn)并成功克隆(Mitsumasuetal., 2005)，隨后在多種昆蟲體內(nèi)都發(fā)現(xiàn)了兩種海藻糖酶基因(田宇等, 2016; 王德意等, 2018)。研究表明，海藻糖酶是昆蟲體內(nèi)調(diào)節(jié)滯育激素和保幼激素及幾丁質(zhì)合成途徑中的關(guān)鍵酶(Ogiso and Takahashi, 1984; Kameietal., 2011; Shuklaetal., 2016)，海藻糖酶基因受到干擾后不僅會阻斷有機體能量代謝，還會影響昆蟲正常的生長發(fā)育(Chenetal., 2010)，張倩等(2012)利用RNAi技術(shù)干擾海藻糖酶基因后，幾丁質(zhì)合成受到影響，致使昆蟲生長發(fā)育受阻，死亡率增加。

昆蟲屬于變溫動物，極端低溫或高溫都會影響昆蟲生存和生長發(fā)育(Boaedmanetal., 2015; Maetal., 2021)，低溫馴化(cold acclimation)可顯著提高昆蟲在低溫下的存活率(Lee, 1989)。將綠盲蝽Apolyguslucorum越冬卵經(jīng)過0℃下40 min處理后，其在-20℃下的死亡率顯著降低(卓德干等, 2012)；其次，低溫馴化可通過調(diào)節(jié)相關(guān)耐寒基因的表達提高昆蟲的抗寒能力(Fuetal., 2020)。一定范圍內(nèi)溫度越低亞洲玉米螟Ostriniafurnacalis越冬滯育幼蟲AK,Tpi和Gst基因表達量越高(劉寧, 2017)。在低溫脅迫處理下，假眼小綠葉蟬Empoascavitis的Tre2表達量增加(汪曉茜, 2018)。異色瓢蟲Harmoniaaxyridis經(jīng)過不同低溫處理后，Trehl-1基因表達量顯著增加，說明昆蟲在受到低溫脅迫時，會通過調(diào)動海藻糖的利用和加強海藻糖的代謝等方式進行御寒(秦資, 2012)。

意大利蝗Calliptamusitalicus是新疆草原的重要害蟲(張泉等, 1995)，以滯育卵在土壤中越冬，越冬卵發(fā)育經(jīng)歷早期、滯育、滯育解除3個階段(王香香等, 2019)。新疆冬季寒冷，倒春寒現(xiàn)象時有發(fā)生，蝗卵耐寒能力是其能否順利越冬以維持種群數(shù)量的關(guān)鍵(葛婧等, 2014)，探討越冬卵耐寒能力對害蟲種群預報和防治具有重要意義。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，自然條件下，隨著蝗卵發(fā)育進程，意大利蝗卵的血藍蛋白基因Hc2表達呈現(xiàn)出先增加后減少的變化趨勢，并在滯育階段Hc2表達量最高(王香香等, 2019)。Hc2基因與氧氣運載有關(guān)(Terwilliger, 1998)，氧氣運載需要消耗能量，而能量供給則主要來自海藻糖酶分解海藻糖?；诖颂岢黾僭O，低溫脅迫下蝗卵海藻糖酶基因與Hc2的表達變化趨勢相同，以滿足蝗卵不同發(fā)育階段的能量供給。本研究通過克隆海藻糖酶基因，進行生物信息學分析，對其在意大利蝗卵不同發(fā)育階段低溫馴化前后的表達譜進行測定，旨在進一步探討蝗卵抵御冬季低溫的分子生物學機制。

1 材料與方法

1.1 試蟲來源與處理

于2019年7月初赴新疆維吾爾自治區(qū)昌吉瑪納斯南山蝗區(qū)實驗站(43°54′ N, 86°7′ E; 海拔1 310 m)捕捉意大利蝗雌、雄成蟲，并混合飼養(yǎng)于室外的蟲籠(1 m×1 m×1 m)中?；\內(nèi)的地面上放置4個直徑相同、深度為12 cm的塑料花盆，花盆里裝滿砂壤土，供意大利蝗產(chǎn)卵?；\內(nèi)飼養(yǎng)密度為500頭/m2以獲得群居型意大利蝗(張洋, 2011)。每日飼喂新鮮冷蒿Artemisiafrigida、紫花苜蓿Medicagosativa直至交配產(chǎn)卵。每日定時更換花盆，并通過篩土法收集卵囊。

卵囊?guī)Щ貙嶒炇液蠓旁谑⒂序问乃芰虾?30 cm×20 cm×9.6 cm)中，深度約為5 cm，塑料盒用封口膜密封并扎有小孔以保濕和透氣。預實驗將不同發(fā)育階段的蝗卵于0℃和4℃下分別處理5, 10和15 d。結(jié)果顯示，0℃處理15 d后蝗卵早期(8月中旬-9月初)、滯育階段(12月底-1月中旬)、滯育解除階段(翌年3月底-5月初)3個發(fā)育階段的過冷卻點與對照組常溫(27℃)有顯著差異(P<0.05)，其他處理條件下無顯著差異，故將0℃低溫處理15 d的蝗卵作為實驗組，以置于人工培養(yǎng)箱(RTOP-430B1, 浙江托普儀器有限公司)27℃(任金龍等, 2015b)、處于相同發(fā)育階段的蝗卵作為對照組。兩組同時在意大利蝗卵早期、滯育、滯育解除階段分別取樣，每組30粒卵，重復3組。意大利蝗越冬卵不同發(fā)育階段劃分采用王香香等(2019)方法，因產(chǎn)卵時間、當年的氣溫變化或存放蝗卵的溫度不同，都會對意大利蝗卵發(fā)育時間造成影響(任金龍等, 2015a)，故本實驗依據(jù)發(fā)育階段進行實驗而非發(fā)育時間。人工培養(yǎng)箱溫度為27±1℃，相對濕度為45%±5%，光周期為14L∶10D(任金龍等, 2015b)。

1.2 總RNA提取及cDNA合成

取1.1節(jié)不同發(fā)育階段的實驗組和對照組意大利蝗卵各100 mg，液氮研磨后，參照TRIzol試劑說明書進行總RNA提取。以1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA提取質(zhì)量，采用超微量生物檢測儀(NanoDrop2000, 美國Thermo公司)進行RNA濃度和純度的測定。以提取的總RNA作為模板，按照PrimeScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa, 大連)操作說明合成cDNA的第1鏈，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 意大利蝗卵海藻糖酶基因片段擴增

從課題組前期注釋的意大利蝗卵轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中(未發(fā)表)獲得意大利蝗卵海藻糖酶基因的序列信息，并在NCBI blast中進行比對。利用Primer Premier 6.0軟件設計序列全長的擴增引物(表1)。以1.2節(jié)合成的cDNA為模板進行PCR擴增，PCR反應體系(30 μL): cDNA模板1 μL，上下游引物(0.2 μmol/L)各1.5 μL, PCR Master Mix 15 μL及ddH2O 11 μL。PCR反應條件: 94℃預變性4 min; 94℃變性30 s, 56℃退火30 s, 72℃延伸2 min, 30個循環(huán)；最后72℃延伸10 min; 4℃條件下保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，使用EZ-10柱式DNA膠回收試劑盒進行DNA的電泳后回收，將回收的目的片段與pMD19-T載體連接，轉(zhuǎn)入大腸桿菌EscherichiacoliDH5α感受態(tài)細胞中轉(zhuǎn)化，經(jīng)藍白斑篩選后，進行菌液PCR陽性克隆檢測，選取檢測合格的3個菌液樣品送至上海生工進行測序。

1.4 意大利蝗卵海藻糖酶基因的生物信息學分析

利用NCBI中的ORF Finder(http:∥www. ncbi. nlm. nih. Gov/gorf/gorf. html)工具對獲得的序列進行開放閱讀框預測，并將其核苷酸序列翻譯成氨基酸序列；用在線網(wǎng)站ProtParam (http:∥web. Expasy. org/protparam/)進行等電點、分子質(zhì)量、氨基酸組成和理化性質(zhì)預測；分別使用SignalP 4.1(http:∥www. cbs. dtu. dk/services/Si GnalP/)與TMHMM(http:∥www. Cbs. Dtu. dk/services/TMHMM/)進行信號肽和跨膜區(qū)的預測；通過在線分析工具PBIL(https:∥prabi. ibcp. fr/htm/site/web/home)和SWISS-MODEL(https:∥swissmodel. expasy. org)預測其二、三級結(jié)構(gòu)。序列同源性比對采用在線Blast程序(https:∥blast. ncbi. nlm. nih. gov/Blast. cgi)；用MEGA7.0中的鄰接法(neighbor-joining, NJ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，重復運行1 000次。

1.5 意大利蝗卵海藻糖酶基因的表達譜分析

應用RT-qPCR技術(shù)分析意大利蝗卵不同發(fā)育階段和低溫馴化后的海藻糖酶基因mRNA的表達情況。以β-actin為內(nèi)參基因，引物序列見表1，以1.2節(jié)合成的cDNA為模板，使用SYBR?Premix Ex TaqTMGreen Ⅱ試劑盒進行熒光實時定量PCR反應。反應體系(20 μL): cDNA模板1 μL, 上下游引物(0.2 μmol/L)各1 μL, ddH2O 7 μL, SYBR Green Supermix 10 μL。反應程序: 95℃ 10 min; 95℃ 10 s, 58℃ 15 s, 72℃ 15 s, 40個循環(huán); 95℃ 10 s, 65℃ 60 s, 97℃ 1 s。生成溶解曲線。每組蝗卵樣品3次技術(shù)重復。

表1 引物信息Table 1 Primer information

1.6 數(shù)據(jù)分析

采用2-ΔΔCt法(Livak and Schmittgen, 2001)計算分析對照組和實驗組意大利蝗卵不同發(fā)育階段海藻糖酶基因的相對表達量。采用SPSS方差分析(ANOVA)最小顯著性差異法(LSD)進行多重比較檢驗，分析不同發(fā)育階段蝗卵的基因表達量差異；低溫馴化后蝗卵不同發(fā)育階段海藻糖酶基因表達量與對照組(27℃)的差異采用獨立樣本T檢驗，顯著性檢驗水平P<0.05。

2 結(jié)果

2.1 意大利蝗卵海藻糖酶基因的克隆與序列特征

克隆共獲得4個具有完整開放閱讀框(ORF)的海藻酶基因序列，依次命名為CiTreM1,CiTreM2,CiTreS1和CiTreS2(GenBank登錄號分別為MZ669810, MZ669811, MZ669812和MZ669813)，其編碼蛋白中CiTreM1和CiTreM2為膜結(jié)合型海藻糖酶，CiTreS1和CiTreS2為可溶型海藻糖酶。其中CiTreM1的ORF全長為1 797 bp，編碼598個氨基酸，預測的蛋白分子質(zhì)量為69.53 kD，理論等電點為5.30，包含83個帶負電荷氨基酸殘基，68個帶正電荷氨基酸殘基，無信號肽序列，有一段約為22個氨基酸的跨膜區(qū)，跨膜結(jié)構(gòu)域的位置在第539-561位氨基酸；CiTreM2的ORF全長為1 797 bp，編碼598個氨基酸，預測的蛋白分子質(zhì)量為69.24 kD，理論等電點為5.02，包含82個帶負電荷氨基酸殘基，56個帶正電荷氨基酸殘基，具有長為18個氨基酸殘基(MFHGSEVVLCIALVSIVS)的信號肽序列，有一段約為22個氨基酸的跨膜區(qū)，跨膜結(jié)構(gòu)域的位置在第574-596位氨基酸；CiTreS1的ORF全長為1 653 bp，編碼550個氨基酸，預測的蛋白分子質(zhì)量為62.70 kD，理論等電點為5.68，包含65個帶負電荷氨基酸殘基，57個帶正電荷氨基酸殘基，無信號肽序列，無跨膜結(jié)構(gòu)域；CiTreS2的ORF全長為1 194 bp，編碼397個氨基酸，預測的蛋白分子質(zhì)量為46.13 kD，理論等電點為8.10，包含46個帶負電荷氨基酸殘基，48個帶正電荷氨基酸殘基，無信號肽序列，無跨膜結(jié)構(gòu)域。4個蛋白都具有2個海藻糖酶特有的標簽序列“QWDFPNVWPP”和“PGGRFREFYYWDSY”和1個甘氨酸富集區(qū)“GGGGEY”(圖1)。

圖1 意大利蝗與飛蝗海藻糖酶的氨基酸序列比對Fig. 1 Multiple alignment of amino acid sequences of trehalase from Calliptamus italicus and Locusta migratoria飛蝗海藻糖酶蛋白序列的GenBank登錄號GenBank accession numbers of trehalase proteins from L. migratoria: LmTre-M1: AQV08185.1; LmTre-M2: AQV08187.1; LmTre-S1: AQV08186.1; LmTre-S2: ACP28173.1. 海藻糖酶特有的序列標簽“QWDYPNAWPP”和“PGGRFREFYYWDSY”用下劃線表示，甘氨酸富集區(qū)“GGGGEY”用波浪線表示，相同的氨基酸殘基以紅色背景表示，相似的氨基酸殘基以藍色框表示。Typical sequence tags “QWDYPNAWPP”and“PGGRFREFYYWDSY”in trehalase proteins are underlined, glycine enrichment area “GGGGEY” is underlined with wavy lines, identical amino acid residues are indicated by a red background, and similar amino acid residues are indicated by a blue box.

2.2 預測的意大利蝗卵海藻糖酶基因編碼蛋白二級和三級結(jié)構(gòu)

CiTreM1, CiTreM2, CiTreS1和CiTreS2的二級結(jié)構(gòu)均由α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角、延伸鏈和無規(guī)卷曲組成，其中，α-螺旋占比最高，分別為45.15%, 48.16%, 45.27%和48.87%；β-轉(zhuǎn)角占比最少，分別為4.85%, 4.68%, 5.27%和5.04%；延伸鏈和無規(guī)卷曲分別占10.70%和39.30%, 11.04%和36.12%, 11.64%和37.82%, 10.83%和35.26%。蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)是α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲等二級結(jié)構(gòu)通過側(cè)鏈基團的相互作用進一步卷曲、折疊，借助次級鍵的維系形成的。通過在線軟件SWISS-MODE對意大利蝗卵海藻糖酶基因蛋白三級結(jié)構(gòu)預測的結(jié)果顯示，4個蛋白三級結(jié)構(gòu)較為相似，都是主要由螺旋和卷曲構(gòu)成，轉(zhuǎn)角和線圈占比較少，α-螺旋包圍著無規(guī)卷曲形成類似球形的蛋白質(zhì)分子，二級結(jié)構(gòu)預測與三級結(jié)構(gòu)預測相吻合。

2.3 意大利蝗卵海藻糖酶基因的序列同源性和進化樹

將克隆得到的意大利蝗卵海藻糖酶基因與其他昆蟲的進行同源性分析，發(fā)現(xiàn)CiTreM1與飛蝗Locustamigratoria和蚜蟲Siphaflava海藻糖酶氨基酸序列一致性分別達到88.98%和61.53%，CiTreM2與飛蝗和灰飛虱Laodelphaxstriatellus海藻糖酶氨基酸序列一致性分別為94.86%和67.01%；CiTreS1與飛蝗和人體虱Pediculushumanuscorporis的海藻糖酶氨基酸序列一致性分別為83.95%和54.26%，CiTreS2與東亞飛蝗L.m.manilensis和桃蚜Myzuspersicae的海藻糖酶氨基酸序列一致性分別為84.26%和54.43%。

系統(tǒng)發(fā)育樹顯示，CiTreM1和CiTreM2與其他昆蟲膜結(jié)合型海藻糖酶聚為一支，與飛蝗的親緣關(guān)系最近，與其他直翅目和半翅目昆蟲膜結(jié)合型海藻糖酶的親緣關(guān)系較近(圖2)；CiTreS1和CiTreS2與其他昆蟲可溶型海藻糖酶構(gòu)成一個分支，與東亞飛蝗的親緣關(guān)系最近，置信度為100%(圖2)。

圖2 鄰接法構(gòu)建的基于氨基酸序列的意大利蝗和其他物種海藻糖酶的系統(tǒng)進化樹(1 000次重復)Fig. 2 Phylogenetic tree based on amino acid sequences of trehalases from Calliptamus italicus andother species constructed by neighbor-joining method (1 000 replicates)

2.4 意大利蝗卵不同發(fā)育階段海藻糖酶基因表達及低溫馴化后表達量的變化

結(jié)果顯示，常溫27℃下意大利蝗卵3個發(fā)育階段中CiTreM1,CiTreM2,CiTreS1和CiTreS2均有表達，但變化趨勢不同(圖3)。CiTreM1在滯育解除階段表達水平最高，在滯育階段表達水平最低，3個階段的表達水平有顯著差異(P<0.05)；CiTreM2在滯育階段的表達水平最高，在滯育解除階段表達水平最低，滯育階段與早期和滯育解除階段間的表達水平差異顯著(P<0.05)。CiTreS1和CiTreS2均在早期階段表達量最高，隨后下降，CiTreS2整體表達水平低于CiTreS1表達水平(圖3)。

圖3 意大利蝗卵不同發(fā)育階段海藻糖酶基因的相對表達量Fig. 3 Relative expression levels of CiTre genes in differentdevelopmental stages of Calliptamus italicus eggs圖中數(shù)據(jù)為平均值±標準差，柱上不同字母表示基因表達量在不同發(fā)育階段間差異顯著(P<0.05，方差分析中的LSD檢驗)。Data in the figure are mean±SD. Different letters above bars indicate significant difference in the gene expression level among different developmental stages (P<0.05, LSD in ANOVA).

在卵發(fā)育的同一階段，4個基因的表達量也明顯不同，早期階段表達量的高低順序為CiTreS1>CiTreS2>CiTreM2>CiTreM1；滯育階段為CiTreM2>CiTreS2>CiTreS1>CiTreM1；滯育解除階段為CiTreM1>CiTreS1=CiTreM2=CiTreS2(圖3)。

低溫(0℃)馴化15 d后，與對照組(27℃)比較，CiTreM1表達量增加，且在早期階段差異極顯著(P<0.01)，在滯育階段和滯育解除階段差異不顯著(P>0.05)(圖4: A)；CiTreM2表達量在3個階段均顯著提高(P<0.05)(圖4: B)；CiTreS1表達量在早期階段極顯著下降(P<0.01)，在滯育解除階段極顯著提高(P<0.01)，在滯育階段無顯著差異(P>0.05)(圖4: C)；CiTreS2表達量在早期階段顯著下降(P<0.05)，在滯育和滯育解除階段顯著提高(P<0.05)(圖4: D)。

低溫(0℃)馴化15 d后4個基因在同一發(fā)育階段的變化也不同，在早期階段表達量高低順序為CiTreM2>CiTreM1>CiTreS2>CiTreS1，在滯育階段為CiTreM2>CiTreS2>CiTreM1>CiTreS1，在滯育解除階段為CiTreS1>CiTreS2>CiTreM2>CiTreM1(圖4)。

圖4 低溫(0℃)馴化15 d后意大利蝗卵不同發(fā)育階段海藻糖酶基因的相對表達量Fig. 4 Relative expression levels of CiTre genes in Calliptamus italicus eggs at different developmental stagesafter acclimation to low temperature (0℃) for 15 dA: CiTreM1; B: CiTreM2; C: CiTreS1; D: CiTreS2. 對照組(CK)： 以27℃下的表達量為基準1。圖中數(shù)值為平均值±標準差，柱上星號和雙星號分別代表與對照組差異顯著(P<0.05)和極顯著(P<0.01)(T檢驗)。The control group (CK): the expression level at 27℃ was taken as the benchmark 1. Data in the figure are means±SD. Asterisk and double asterisk above bars indicate significant difference (P<0.05) and extremely significant difference (P<0.01), respectively, from the control group by T-test.

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，意大利蝗卵海藻糖酶基因有4個拷貝，從其結(jié)構(gòu)和功能分析推測是由兩種基因復制而得，4個拷貝具有完整的編碼序列和僅存在于海藻糖酶蛋白中的特異性標簽及一個保守的海藻糖酶超家族結(jié)構(gòu)域，表明復制基因仍具有海藻糖酶功能，共同參與調(diào)控了蝗卵越冬過程中的海藻糖代謝。CiTreS1和CiTreS2蛋白結(jié)構(gòu)不含跨膜結(jié)構(gòu)域，與飛蝗TreS同源性最高，置信度可達100%，說明海藻糖酶基因具有高度保守的進化特征；CiTreM1和CiTreM2在C端含有跨膜結(jié)構(gòu)域，表明其可以跨越細胞質(zhì)膜進入到細胞周質(zhì)和細胞內(nèi)質(zhì)中發(fā)揮作用。CiTre蛋白相似性較高，功能相似，具有類似比例的α-螺旋、β-折疊和無規(guī)卷曲，4個基因中僅CiTreM2的編碼蛋白在N端含有信號肽，推測該蛋白可能為分泌型蛋白，可進行跨膜轉(zhuǎn)運到其他組織或細胞中去發(fā)揮作用(應喜娟等, 2007)。

昆蟲體內(nèi)海藻糖酶基因表達在不同發(fā)育階段差異較大(Guoetal., 2015)。BtTre2在煙粉虱Bemisiatabaci卵和成蟲階段表達水平高于在若蟲中的(Wangetal., 2014)；LdTre基因在馬鈴薯甲蟲Leptinotarsadecemlineata1-3齡幼蟲蛻皮期間表達量較低，蛻皮前后表達量較高，以滿足幾丁質(zhì)合成的需求(Shietal., 2017)。本研究表明，對照組(27℃)海藻糖酶基因在意大利蝗卵各發(fā)育階段中均有表達(圖3)，這與大多數(shù)研究結(jié)果(劉曉健等, 2012; 田宇等, 2016; 陳龍等, 2018)一致，但4個海藻糖酶基因在意大利蝗卵不同發(fā)育階段的表達各有特點，CiTreM1表達量先下降后上升，在滯育解除階段達到最高(圖3)，推測其參與分解海藻糖、為蝗卵孵化及幾丁質(zhì)合成提供能量有關(guān)。4個海藻糖酶基因中，CiTreM2在滯育階段的表達量最高(圖3)，這與滯育激素可增強家蠶卵海藻糖酶活性的研究結(jié)果(Kameietal., 2011)相似。滯育階段蟲體內(nèi)的滯育激素水平較高(Fukuda and Takeuchi, 1967)，滯育激素可提高海藻糖酶活性(王洪亮等, 2008)，致使蝗卵滯育階段CiTreM2表達量增加，為維持蝗卵滯育階段的基礎代謝提供能量。4個海藻糖酶基因中，CiTreS1和CiTreM1分別在意大利蝗卵早期和滯育解除階段的表達量最高(圖3)，分析這是由于在早期階段胚胎需要消耗大量能量快速發(fā)育進入滯育狀態(tài)以順利越冬，滯育解除后胚胎發(fā)育恢復到滯育前的活躍狀態(tài)(閆蒙云等, 2018)，蝗卵孵化和1齡若蟲幾丁質(zhì)外骨骼合成(劉曉健等, 2012)均需能量，它們的高表達可產(chǎn)生更多海藻糖酶誘導海藻糖水解為葡萄糖以補給所需能量。

已有研究報道，越冬期間意大利蝗卵通過積累與抗寒相關(guān)的多種游離氨基酸(葛婧等, 2014)，降低過冷卻點和呼吸代謝水平(閆蒙云等, 2018; 任金龍等, 2021)及高表達與氧氣運載有關(guān)的血藍蛋白基因(王香香等, 2019)等方式應對冬季低溫。本研究發(fā)現(xiàn)，第一，低溫馴化后蝗卵不同發(fā)育階段膜結(jié)合型海藻糖酶基因表達量增加，與低溫下血藍蛋白基因Hc2的變化趨勢(王香香等, 2019)相同，而可溶型海藻糖酶基因變化與其不一致，研究結(jié)果部分驗證了提出的假設，分析原因與兩類不同的海藻糖酶基因的功能不同有關(guān)?？扇苄秃Ｔ逄敲富?qū)τ诶ハx表皮中幾丁質(zhì)合成、碳水化合物攝取以及體內(nèi)營養(yǎng)動態(tài)平衡具有重要意義，膜結(jié)合型海藻糖酶基因則主要影響中腸幾丁質(zhì)合成和生長發(fā)育過程(張文慶等, 2011)。Chen等(2010)的研究也證實了用Treh-1和Treh-2的dsRNA干擾甜菜夜蛾Spodopteraexigua的幼蟲和蛹，結(jié)果產(chǎn)生了不同的異常表型。其二，與對照組(27℃)相比，低溫馴化后CiTreM基因表達量在3個階段均增加，CiTreS基因僅在早期階段表達量下降，其他階段表達量增加(圖4)，說明海藻糖酶基因參與了蝗卵對低溫脅迫的應答，這與其他昆蟲的研究結(jié)果(Shietal., 2016; 汪曉茜, 2018; Lüetal., 2020)相似。其三，低溫對海藻糖酶基因的影響與蝗卵發(fā)育階段有關(guān)，CiTreM1在蝗卵發(fā)育早期階段存在明顯的低溫馴化現(xiàn)象，表明蝗卵通過提高CiTreM1表達量分解海藻糖，提高蝗卵對低溫脅迫的適應力。CiTreM2在3個發(fā)育階段的表達量均顯著高于對照組，并在早期階段的增幅最大，說明不同發(fā)育階段CiTre基因?qū)囟鹊拿舾行源嬖诓町悾爽F(xiàn)象在其他昆蟲中也有類似發(fā)現(xiàn)，如Lü等(2020)發(fā)現(xiàn)松毛蟲赤眼蜂Trichogrammadendrolimi在低溫脅迫后成蟲階段TdTre基因的表達較幼蟲更敏感。Kamei等(2011)研究發(fā)現(xiàn)家蠶膜結(jié)合型海藻糖酶活性的增強能夠有效促進滯育激素誘導滯育卵進入深度滯育，利于提高抗寒能力，因此，推測CiTreM2在蝗卵應對低溫脅迫時發(fā)揮著重要作用。0℃低溫馴化15 d后，CiTreS1表達量在意大利蝗卵滯育解除階段增幅最大(圖4)，基于低溫馴化前后CiTreS1表達水平和變化幅度最大的事實判斷，其在蝗卵滯育解除后快速發(fā)育的能量供給和應對低溫脅迫如倒春寒天氣中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。

蝗卵發(fā)育階段因產(chǎn)卵時間不同，甚至同一個卵囊內(nèi)不同卵粒都會不同(任金龍等, 2015a)，為避免因蝗卵不同發(fā)育階段對實驗結(jié)果產(chǎn)生影響，本研究按照意大利蝗卵發(fā)育階段劃分依據(jù)，隨機選取一定量的蝗卵解剖，當超過90%的卵發(fā)育至某一階段時方進行取樣，以確保實驗所用蝗卵發(fā)育階段的一致性。不同類型的海藻糖酶基因在應對昆蟲所受脅迫中具有一定的協(xié)同作用(Shietal., 2019)，同理，蝗卵應對低溫脅迫亦并非某一海藻糖酶基因起作用，但不同海藻糖酶基因之間的協(xié)作還需進一步探討，另一方面，本研究僅對海藻糖酶基因進行克隆及低溫馴化后基因的表達變化分析，后續(xù)還需對基因進行RNA干擾，對其功能進行驗證，以進一步揭示海藻糖酶基因在意大利蝗卵越冬中的作用機制。