張順， 莊君龍， 邱雪峰， 金晶， 郭宏騫

前列腺癌是世界范圍內男性發(fā)病率第二，病死率第五的癌種[1]。2015年我國腫瘤登記地區(qū)前列腺癌新發(fā)患者數超過6萬人，位列男性惡性腫瘤發(fā)病人數的第6位[2]。一項北上廣等地的調查研究顯示，我國54%前列腺癌初診患者有骨轉移或內臟轉移[3]，發(fā)現即晚期因此錯過根治手術時間[4-5]。最初的轉移性患者在初始治療階段都屬于轉移性激素敏感性前列腺癌(metastatic hormone sensitive prostate cancer, mHSPC)，但在內分泌治療一段時間發(fā)生進展后將轉變?yōu)檗D移性去勢抵抗性前列腺癌(metastatic castration-resistant prostate cancer, mCRPC)?；颊咭坏┻M入mCRPC階段，預后一般較差。因此，及時篩選出mHSPC階段不良預后患者，并采取更積極的治療，將有助于延長患者生存期。

隨著腫瘤分子生物學的發(fā)展，現已揭示了部分前列腺癌預后相關基因，如CDK12[6]、PTEN[7]、TP53[8]等。CDK12屬于細胞周期依賴性蛋白，可通過調節(jié)DNA損傷反應相關基因來控制基因組穩(wěn)定性[6]。有研究發(fā)現中國人CDK12突變的比例為15.4%[9]，顯著高于先前報道的高加索人的突變頻率5%～7%[10-12]。另外，相較于mHSPC，CDK12突變頻率在mCRPC患者當中比例更高[6]。目前針對CDK12突變的研究大多屬于mCRPC階段。因此，探索中國人群中mHSPC患者的CDK12突變頻率，有助于明確其對mHSPC階段的預后作用。

本研究收集了91例mHSPC階段的患者，通過第二代測序NGS檢測技術，同時分析患者的胚系和體系突變情況，篩選出有CDK12胚系或體系有害突變的患者，并對患者進行長期隨訪，通過患者進展至mCRPC階段的時間分析CDK12突變的預后作用。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇南京大學醫(yī)學院附屬鼓樓醫(yī)院泌尿外科2019年1月至2020年11月間臨床資料齊全且病理組織石蠟標本能滿足基因檢測要求的91例病例，均為行前列腺癌穿刺活檢初診為mHSPC。患者確診時年齡42～86歲，平均(68.35±6.80)歲。按照國際泌尿病理協會(ISUP)分級分組1組1例，2組3例，3組8例，4組41例，5組38例。臨床病理分期按照美國癌癥分期聯合委員會(AJCC)制定的TNM分期標準確定，遠處轉移M分期中M1a期22例， M1b期60例，M1c期9例。臨床治療方案以雄激素剝奪治療(androgen-deprivation therapy，ADT)為基礎的聯合治療方案為主，主要包括ADT聯合比卡魯胺、ADT聯合醋酸阿比特龍及ADT聯合多西他賽。依據前列腺癌臨床試驗工作組3(the Prostate Cancer Clinical Trials Working Group 3,PCWG3)的標準，收集患者從mHSPC進展至mCRPC階段時間。

1.2 組織、血液樣本采集 組織樣本采集：收集mHSPC患者腫瘤穿刺組織1～2條或白片10～15片。血液標本采集：使用 Streck采血管采集治療前≥10 ml外周血，采血后立即輕柔顛倒 10 次使血液與管內成分混勻。

1.3 NGS測序法 采用Nanodrop 檢測 DNA 的純度(OD260/280比值)；DNA的降解程度用瓊脂糖凝膠電泳進行分析，并用該電泳同時判斷是否有蛋白質以及RNA的污染；通過Qubit熒光計對DNA濃度進行高靈敏度、高特異性以及高精確度的定量分析；利用破碎儀將基因組DNA進行隨機打斷，打斷后的片段長度在180～280 bp之間， 隨后對打斷的片段進行末端修復以及加A尾，處理完畢后通過在片段的兩端連上接頭，進而制備DNA文庫。構建好文庫后，基因片段便帶有特異性標簽。將生物素標記的探針與index文庫進行液相雜交，再加入帶鏈霉素的磁珠抓取雜交復合狀態(tài)的DNA，在洗脫緩沖液中洗脫目標文庫，并得到基因組中的外顯子片段，通過PCR進行線性擴增，擴增后再對文庫進行質檢，以確保結果的準確性，檢測合格后上機測序。通過對測序數據量、比對率、錯誤率等進行統(tǒng)計，進而評估測序數據的質量，判斷建庫測序是否達到了標準，如果符合標準則進行后續(xù)的分析，不符合標準者重新建庫或加測。將高質量的序列與人參考基因組進行比對，檢測樣本中的變異信息，包括點突變、插入/刪除、拷貝數變異，并對檢出的變異進行分析解讀。通過血液中白細胞的對照，同時分析胚系和體系突變情況。

1.4 統(tǒng)計學方法 使用IBM SPSS Statistics 22.0統(tǒng)計軟件進行相應的統(tǒng)計分析。其中正態(tài)分布的計量資料以平均數±標準差表示，采用獨立樣本t檢驗分析組間差異。非正態(tài)分布的計量資料以四分位數表示，采用秩和檢驗分析組間差異。計數資料以例(%)表示，采用χ2檢驗分析組間差異。P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

因有研究顯示CDK12突變型患者進展至mCRPC的中位時間在9～10個月，而CDK12野生型患者進展至mCRPC的中位時間在13～18個月[6，13-14]。因此本研究將mHSPC患者初始治療后12個月內是否進展作為預后觀察指標。CDK12是否突變與mHSPC患者是否在12月內進展為mCRPC的關系采用連續(xù)性校正χ2檢驗分析。對mHSPC患者在12個月內進展至mCRPC的相關危險因素進行單因素及多因素Logistic回歸分析。

2 結果

2.1 NGS測序結果及CDK12突變型或野生型兩組患者基線資料 91例mHSPC患者中存在有害突變或臨床意義未明突變頻率排名前五的分別是FOXA1(31例，34.06%)，SPOP(19例，20.89%)，CDK12(19例，20.89%)，BRCA2(18例，19.78%)，TP53(16例，17.58%)(圖1)。19例CDK12突變患者中有11例檢測出胚系或體系的有害突變，突變頻率為12.09%。

注：圖中左側條狀列出了檢測到的所有突變基因及對應的突變頻率，該頻率包括有害突變或臨床意義未明突變；圖中右側彩色方格代表突變形式，每例患者每個基因的突變形式都縱向體現在圖中的方格中；圖中上方對應的是每例患者的突變密度圖1 91例 mHSPC患者的突變圖譜

兩組患者確診時候的年齡、前列腺特異性抗原(PSA)、ISUP分組、遠處轉移M分期情況、隨訪時間及mHSPC期間治療情況比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(表1)。

表1 91例mHSPC患者的臨床信息

2.2 CDK12突變狀態(tài)與mHSPC患者進展至mCRPC階段時間的關系 對91例mHSPC患者進行隨訪，發(fā)現CDK12突變型患者在12個月內進展至mCRPC的有7例，進展率為63.64%(7/11)；CDK12野生型患者在12個月內進展至mCRPC的有18例，進展率為22.50%(18/80)。CDK12突變狀態(tài)與mHSPC患者進展至mCRPC階段的時間差異具有統(tǒng)計學意義(χ2=6.278，P=0.012)。

2.3 其他臨床特點與進展至mCRPC階段時間相關因素單因素和多因素分析 將表1中相關因素作為協變量，以mHSPC在12個月內是否發(fā)生進展作為因變量進行Logistic回歸分析：CDK12突變型(OR=6.03，95%CI：1.59～22.93，P=0.015)及ISUP分組(OR=2.81，95%CI：1.23～6.92，P=0.013)是mHSPC患者在12個月內發(fā)生進展的獨立影響因素，具體參數見表2。

表2 mHSPC進展至mCRPC階段時間相關因素的Logistic回歸分析

3 討論

周期蛋白依賴性激酶(cyclin-dependent kinase，CDK)是調節(jié)幾個關鍵細胞過程的重要激酶，可調控細胞周期進展和調控基因轉錄[6]。其中細胞周期依賴性蛋白12(cyclin-dependent kinase 12，CDK12)是轉錄相關基因，由不同的功能結構域組成：一個位于中心位置的結構域，N-末端附近的幾個精氨酸/絲氨酸序列，以及一個富含脯氨酸的序列[15]。CDK12可以調節(jié)DNA損傷修復基因在內的基因轉錄，當CDK12蛋白功能失活時，DNA損傷修復基因表達缺陷，易引起基因融合增加和基因表達顯著差異，導致腫瘤的發(fā)生與發(fā)展，其變異頻率在CDK家族中是最高的[6]。實體瘤中，前列腺癌發(fā)生CDK12基因變異的頻率最高[6]，3%～7%的mCRPC患者存在CDK12基因突變[16]。本研究結果顯示，在中國人群mHSPC患者中，CDK12有害突變的頻率為12.09%。而高加索人在mCRPC階段CDK12的突變頻率僅為5～7%[10-12]。中國人群CDK12突變頻率是高加索人的1.7～2.4倍。另外，CDK12突變頻率在mCRPC患者中的比例要比mHSPC階段更高[6]。中國人群在CDK12突變頻率偏低的mHSPC階段的數據，都已遠遠超過了高加索人在mCRPC階段的數據。由此可見，中國人群和高加索人在基因組學上存在較大差異，CDK12基因在中國人群中的突變頻率遠高于外國人群。

目前CDK12在細胞中的具體作用機制還不完全清楚，但它在DDR通路中有著不可替代的作用[17]。據報道，CDK12 在維持同源重組修復轉錄活性、保持基因組穩(wěn)定性以及促進DNA損傷修復過程中起著重要的調節(jié)作用。DNA 損傷累積和DDR破壞是惡性腫瘤的典型特征之一[18]，因此CDK12突變與腫瘤發(fā)生和進展緊密相關。目前已有不少研究顯示，CDK12突變與前列腺癌的不良預后相關。Nguyen等[6]將CDK12突變組患者與CDK12野生型患者相比，發(fā)現CDK12突變組患者從診斷轉移性前列腺癌開始的總生存期較短，并且進展至CRPC的時間較短。Warner等[13]將12例CDK12缺陷的患者與187例未檢測到胚系/體系CDK12缺陷的轉移性前列腺癌患者相比，發(fā)現CDK12缺陷的患者從ADT開始到CRPC進展的時間顯著縮短，且在mCRPC一線新型內分泌治療后的PSA進展時間較短。且CDK12突變的患者進展至mCRPC的中位時間在9～10個月，而CDK12野生型患者進展至mCRPC的中位時間在13～18個月[6，13-14]。因此，本研究將mHSPC患者初始治療后在12個月內是否進展作為預后觀察指標?；谥袊巳?，對mHSPC階段CDK12基因突變患者進行了臨床特征分析。通過χ2檢驗以及Logistic回歸多因素分析的研究結果顯示，CDK12突變與mHSPC患者進展至mCRPC階段的時間差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，具有CDK12突變的mHSPC患者的預后情況普遍較差，與先前的報道結果一致。在Logistic回歸的多因素分析中，除了CDK12突變以外，ISUP分組也是mHSPC患者在12個月內發(fā)生進展的獨立影響因素。

CDK12突變的mHSPC表現出更強的侵襲性行為，患者預后較差，且前列腺癌中CDK12的突變又在中國人群中有較高的比例，因此，CDK12值得引起泌尿外科的高度重視。對CDK12突變的前列腺癌患者，使用新型內分泌治療的療效往往不佳[9，13]。本研究結果也提示CDK12突變型mHSPC患者一線標準治療方案包括ADT聯合比卡魯胺或醋酸阿比特龍或多西他賽均療效欠佳。但CDK12會影響DNA損傷修復，表現為“類同源重組修復缺陷”作用，從而增加新抗原負荷和T細胞浸潤，引起免疫應答[19]。CDK12 基因影響DNA 的修復包括同源重組修復和炎癥相關表型。因此，有研究報道有CDK12突變的前列腺癌患者對鉑類化療和免疫治療有較好的響應[9，20]。那么后續(xù)對有CDK12突變的mHSPC患者，是否可以使用鉑類或免疫等更加積極的治療方式，進而延長患者生存期，值得進一步研究和探討。

本研究仍存在一些不足，因目前基因檢測費用較高，收集樣本量有限且非連續(xù)人群，存在一定的選擇偏倚。另外因隨訪時間偏短，無法得到所有患者進展至mCRPC的具體時間，所以采用治療12個月內是否進展作為療效觀察指標也存在一定的偏差。這需要在后續(xù)收集更多的樣本和更長的隨訪時間，為指導中國人群中mHSPC患者的CDK12突變頻率及臨床意義提供更詳實、可靠的依據。