蔡桂萍，黃旭升，史先飛，李潤(rùn)植，張 莉

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，山西 太谷 030801）

大豆（Glycine max）是世界主要的糧油作物之一，為人類(lèi)提供豐富的蛋白質(zhì)和食用油，亦是畜禽飼料的優(yōu)質(zhì)資源[1-2]。但在我國(guó)大豆種植面積小，并且在整個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中經(jīng)常受到各種逆境因素的影響，目前大豆油的主要來(lái)源仍然依靠進(jìn)口[3]，提高大豆產(chǎn)量成為了一項(xiàng)艱巨的任務(wù)[4]。因此，挖掘大豆抗逆基因和解析其作用的分子機(jī)制具有重要意義，可為培育高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)和多重抗逆性的優(yōu)良大豆品種奠定基礎(chǔ)。

已有研究表明，基因的啟動(dòng)子是一段能被RNA聚合酶識(shí)別與結(jié)合，并啟動(dòng)基因表達(dá)的DNA序列。啟動(dòng)子含有多種順式作用元件，可調(diào)控非生物脅迫、光照、植物激素等信號(hào)通路。例如，彭亞男[5]在大豆中發(fā)現(xiàn)，GmCBL7基因啟動(dòng)子參與調(diào)控大豆對(duì)高鹽和干旱脅迫的應(yīng)答。馮志娟等[6]研究發(fā)現(xiàn)，大豆GmTIP2：6基因啟動(dòng)子促使低溫、高鹽脅迫下GUS酶活性上調(diào)表達(dá)。因此，啟動(dòng)子核心順式元件的鑒定有助于研究靶基因介導(dǎo)植物抗逆性機(jī)制。

轉(zhuǎn)錄因子作為一種DNA結(jié)合蛋白，可與啟動(dòng)子順式作用元件相互作用，激活或抑制目標(biāo)基因轉(zhuǎn)錄。轉(zhuǎn)錄因子WAX INDUCER1/SHINE1（WIN1/SHN 1）是AP2/ERF（APETALA 2/ethyleneresponse factor）超家族的ERF-B6亞家族[7]，已發(fā)現(xiàn)在擬南芥（Arabidopsis thaliana）[8]、水 稻（Oryza sativa）[9]、小麥（Triticumaestivum）[10]、大麥（Hordeumvulgare）[11]、番 茄（Lycopersiconesculentum）[12]、蘋(píng) 果（Malus pumila）[13]和甘藍(lán)型油菜（Brassica napus）[14]等高等植物中介導(dǎo)蠟質(zhì)生物合成調(diào)控。其中，在擬南芥中過(guò)表達(dá)AtWIN 1導(dǎo)致葉和莖表皮蠟質(zhì)積累以及擬南芥耐旱性的顯著增加[15]。在鹽脅迫條件下，過(guò)表達(dá)BnWIN 1導(dǎo)致甘藍(lán)型油菜蠟積累增加了20%~22%，并促進(jìn)了生長(zhǎng)，而油脂積累未有明顯變化[14]。在硬粒小麥中Td SHN1的過(guò)表達(dá)增加了酵母對(duì)多種非生物脅迫的耐受性[10]。目前，還未發(fā)現(xiàn)關(guān)于大豆WIN1家族成員介導(dǎo)大豆油脂生物合成和脅迫應(yīng)答及其他生物學(xué)過(guò)程的調(diào)控。

為深入了解轉(zhuǎn)錄因子GmWIN1-1是否介導(dǎo)大豆油脂合成和非生物脅迫響應(yīng)的調(diào)控，本研究依據(jù)已有的大豆轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，以擬南芥AtWIN1蛋白序列為索引，同源比對(duì)鑒定獲得1個(gè)具有完整開(kāi)放閱讀框（ORF）的大豆GmWIN1-1；使用生物信息學(xué)軟件分析其編碼蛋白理化性質(zhì)、蛋白結(jié)構(gòu)和基因啟動(dòng)子順式元件等，并采用qRT-PCR分析轉(zhuǎn)錄因子GmWIN 1-1在大豆不同組織中的表達(dá)量以及對(duì)干旱脅迫的響應(yīng)，為深入研究大豆GmWIN1家族成員生物學(xué)功能和大豆抗逆性遺傳改良提供新見(jiàn)解。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

以生長(zhǎng)周期較短的大豆優(yōu)選品種Jack為試驗(yàn)材料。

1.2 材料處理

選取長(zhǎng)出第1片真葉的大豆幼苗，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%的PEG6000溶液進(jìn)行干旱脅迫處理[16]，共設(shè)置7個(gè)處理時(shí)間，即0、2、4、6、9、12、24 h，每個(gè)處理時(shí)間取材3株。

1.3 Gm WIN1-1蛋白的生物信息學(xué)分析

以擬南芥AtWIN1編碼序列為索引，在山西農(nóng)業(yè)大學(xué)分子農(nóng)業(yè)與生物能源研究所實(shí)驗(yàn)室已有的大豆轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中Blast比對(duì)，獲得轉(zhuǎn)錄因子GmWIN1的cDNA序列信息。使用NCBI-ORF分析cDNA序列是否具有完整的開(kāi)放閱讀框（ORF），經(jīng)比對(duì)分析獲得1條具有完整開(kāi)放閱讀框的大豆GmWIN1 cDNA序列，命名為GmWIN 1-1。通過(guò)NCBI中CDD數(shù)據(jù)庫(kù)分析GmWIN1-1的保守結(jié)構(gòu)域。利用Gene Structure Disply Server網(wǎng)站分析GmWIN1-1的基因結(jié)構(gòu)[17]。

利用在線網(wǎng)站ProtParam分析大豆GmWIN1-1蛋白理化性質(zhì)；利用Ex PASy數(shù)據(jù)庫(kù)中的ProtScale預(yù)測(cè)疏水性；利用在線網(wǎng)站SOPMA預(yù)測(cè)GmWIN1-1蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)構(gòu)成；在線網(wǎng)站SWISSMODEL對(duì)GmWIN1-1蛋白進(jìn)行三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析并建模[18]；在線軟件PlantCARE預(yù)測(cè)GmWIN1-1起始密碼子前2 000 bp序列的核心作用元件。所有生物信息學(xué)工具網(wǎng)址如表1所示。

表1 生物信息學(xué)工具Tab.1 Bioinformatics tools

1.4 GmWIN1-1蛋白的多序列比對(duì)和系統(tǒng)發(fā)育分析

從NCBI中調(diào)取水稻、紫花苜蓿、大麥、擬南芥的WIN 1蛋白序列，使用DNAMAN軟件比對(duì)不同物種WIN1蛋白序列相似性。使用在線軟件MEME（https：//meme-suite.org/meme/tools/meme）分析不同物種WIN 1蛋白序列的基序。運(yùn)用MEGA 7.0軟件，采用鄰接法（Neighbor-joining）對(duì)GmWIN1-1蛋白構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，設(shè)定Bootstrap值為1 000[19]。

1.5 RNA提取及實(shí)時(shí)熒光定量PCR

用植物Transzoltm試劑（Transgen Biotech，北京）提取了大豆的總RNA，用gDNA remover（GenStar，中國(guó)）去除基因組DNA污染。用StarScriptⅡRT Mix（GenStar，中國(guó)）將第一鏈互補(bǔ)DNA（cDNA）在20μL體積的總RNA（2μg）合成。

以上述的cDNA為模板，擴(kuò)增引物序列如表2所示。依照TB Green?Premix Ex Taq?II（北京TaKaRa）說(shuō)明方法進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)，設(shè)置6個(gè)生物重復(fù)。

表2 熒光定量PCR所用引物Tab.2 Primers used in fluorescence quantitative PCR

1.6 數(shù)據(jù)處理

采用Bio-Rad CFX Manager和IBM SPSS Statistics 20軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用單因素（One-way ANOVA）和Duncan法進(jìn)行方差分析和多重比較（α=0.05）。利用Excel 2003和Adobe Illustrator CS6軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 大豆Gm WIN1-1轉(zhuǎn)錄因子的鑒定

依據(jù)模式植物擬南芥AtWIN1的編碼序列，在山西農(nóng)業(yè)大學(xué)分子農(nóng)業(yè)與生物能源研究所實(shí)驗(yàn)室已有的大豆轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)Blast比對(duì)，獲得幾個(gè)候選GmWIN1成員。經(jīng)比對(duì)分析獲得1條具有完整開(kāi)放閱讀框（ORF）的候選GmWIN 1，命名為GmWIN1-1。該cDNA閱讀框全長(zhǎng)570 bp，編碼189個(gè)氨基酸（圖1）。結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)結(jié)果如圖2所示，AtWIN 1和GmWIN1-1分別具有1個(gè)AP2保守結(jié)構(gòu)域?；蚪Y(jié)構(gòu)結(jié)果如圖3所示，AtWIN 1和GmWIN1-1均含2個(gè)外顯子和1個(gè)內(nèi)含子，且具有5′和3′非翻譯區(qū)。

2.2 大豆Gm WIN1-1蛋白的基本理化性質(zhì)分析

利用ProtParam工具分析大豆GmWIN1-1蛋白基本理化性質(zhì)，結(jié)果如表3所示。該蛋白長(zhǎng)度為189個(gè)氨基酸；理論等電點(diǎn)為8.45，屬于堿性蛋白；蛋白的分子質(zhì)量為21.2 ku；該蛋白的不穩(wěn)定性指數(shù)為68.34，屬于不穩(wěn)定蛋白；脂肪系數(shù)為69.63；總平均親水系數(shù)為-0.694，為親水性蛋白。疏水性結(jié)果如圖4所示，在0以下的峰居多，與基本理化性質(zhì)預(yù)測(cè)結(jié)果一致，屬于親水性蛋白。

表3 GmWIN1-1蛋白理化性質(zhì)Tab.3 Physical and chemical properties of GmWIN1-1 protein

2.3 大豆Gm WIN1-1蛋白的高級(jí)結(jié)構(gòu)分析

利用在線軟件SOPMA預(yù)測(cè)GmWIN1-1蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果如圖5所示，無(wú)規(guī)則卷曲所占的比例最高，為50.79%，α-螺旋所占的比例為30.69%，延伸鏈和β-轉(zhuǎn)角所占的比例分別為13.23%和5.29%。分析結(jié)果表明，大豆GmWIN1-1蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要由α-螺旋和無(wú)規(guī)卷曲構(gòu)成，該蛋白為混合型蛋白。

用SWISS-MODEL軟件分析GmWIN 1-1蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果如圖6所示，使用模板蛋白5wx9.1對(duì)GmWIN1-1蛋白進(jìn)行同源建模，模板蛋白與GmWIN1-1蛋白氨基酸序列相似性為45%，覆蓋率為34%，GmWIN 1-1的保守序列范圍為4-68位氨基酸。

2.4 大豆GmWIN1-1蛋白的序列比對(duì)及系統(tǒng)進(jìn)化分析

通過(guò)DNAMAN軟件對(duì)GmWIN1-1、AtWIN 1、OsSHN1、MtWIN1、HvWIN1蛋白進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)，結(jié)果如圖7所示，GmWIN1-1與其他物種WIN 1蛋白序列長(zhǎng)度為189~213個(gè)氨基酸，GmWIN1-1與AtWIN1的相似度最高（63.32%）。基序分析結(jié)果如圖8所示，在N端有一段AP2保守基序（AP2 Domain），此外，還發(fā)現(xiàn)中間基序（Middle motif，mm）和C端基序（C-terminus motif，cm）。

通過(guò)MEGA 7.0軟件對(duì)GmWIN1-1和其他植物WIN 1蛋白進(jìn)行多序列系統(tǒng)進(jìn)化分析，結(jié)果如圖9所示，HvWIN1與OsSHN1具有較高的親緣關(guān)系，其次是GmWIN1-1與MtWIN1具有較高的親緣關(guān)系，這些成對(duì)的蛋白可能具有共同的祖先和相似的生物學(xué)功能。

2.5 大豆GmWIN1-1啟動(dòng)子順式元件分析

通過(guò)在線軟件PlantCARE預(yù)測(cè)GmWIN1-1起始密碼子前2 000 bp序列的順式作用元件，結(jié)果如表4所示，GmWIN 1-1啟動(dòng)子中含有4個(gè)脫落酸元件、6個(gè)厭氧誘導(dǎo)元件、2個(gè)干旱響應(yīng)元件、4個(gè)光反應(yīng)元件、1個(gè)赤霉素反應(yīng)元件、1個(gè)myb結(jié)合位點(diǎn)，推測(cè)GmWIN1-1可能受干旱脅迫的調(diào)控。

表4 GmWIN1-1啟動(dòng)子核心元件預(yù)測(cè)Tab.4 Prediction of GmWIN1-1 promoter core elements

2.6 大豆Gm WIN1-1在不同組織中的表達(dá)模式分析

選取大豆不同器官和不同時(shí)期的種子為試驗(yàn)材料，檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子GmWIN 1-1的表達(dá)譜。qRTPCR結(jié)果如圖10所示，GmWIN1-1表達(dá)量最高的器官是花，分別是莖和根中表達(dá)量的1.7倍和5倍，而在其他組織中的表達(dá)量極低。

2.7 干旱脅迫下大豆幼苗表型和GmWIN1-1表達(dá)模式分析

根據(jù)啟動(dòng)子核心作用元件預(yù)測(cè)，推測(cè)GmWIN1-1可能受干旱脅迫誘導(dǎo)。由圖11-A可知，干旱脅迫處理導(dǎo)致大豆幼苗發(fā)生嚴(yán)重萎蔫。qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果表明（圖11-B），與未處理對(duì)照株相比，GmWIN1-1的表達(dá)量有明顯的變化，表現(xiàn)為小幅度先下降再上升又下降的趨勢(shì)，在6 h達(dá)到最高值。這些結(jié)果顯示，GmWIN1-1可能參與大豆幼苗干旱脅迫應(yīng)答。

3 結(jié)論與討論

分析大豆脂質(zhì)合成、代謝和逆境調(diào)控機(jī)制將為提高大豆產(chǎn)量提供新的理論依據(jù)。鑒于油脂生物合成、代謝和逆境調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜性質(zhì)，已有研究發(fā)現(xiàn)，WRI1、WRKY和MYB等轉(zhuǎn)錄因子通過(guò)同時(shí)調(diào)節(jié)眾多基因發(fā)揮重要作用[20-22]。本試驗(yàn)所研究的轉(zhuǎn)錄因子WIN1是蠟生物合成過(guò)程中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，該轉(zhuǎn)錄因子與甘藍(lán)型油菜中的油積累和鹽脅迫有關(guān)，但在大豆脂質(zhì)積累和非生物脅迫響應(yīng)中的作用尚不明確。

本研究通過(guò)Blast比對(duì)，獲得轉(zhuǎn)錄因子GmWIN 1-1，由189個(gè)氨基酸構(gòu)成，是一個(gè)單體蛋白。蛋白高級(jí)結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，GmWIN1-1蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)中無(wú)規(guī)則卷曲所占比例最多，推測(cè)其可能連接其他二級(jí)結(jié)構(gòu)元件；蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)與模板蛋白5wx9.1相似性為45%；多序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，大豆GmWIN 1-1與其他物種WIN1不僅在N端具有1個(gè)AP2功能結(jié)構(gòu)域，還分別具有1個(gè)中間基序和C端基序；系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析發(fā)現(xiàn)，GmWIN1-1與MtWIN 1的親緣關(guān)系較近，可能是由于它們屬于同一亞科（蝶形花亞科）。通過(guò)以上生物信息學(xué)分析，推測(cè)大豆GmWIN 1-1蛋白應(yīng)具有與其他物種一樣的WIN1活性。

本研究發(fā)現(xiàn)，GmWIN 1-1在花中的表達(dá)量最高。類(lèi)似地，在許多高等植物的花蕾中也檢測(cè)到WIN1具有高表達(dá)。已發(fā)現(xiàn)TAG占花粉質(zhì)量的30%~40%，因此，推測(cè)TAG參與的有性生殖可能與WIN1有關(guān)，但是WIN1轉(zhuǎn)錄因子在花粉中的具體作用尚不清楚，仍需進(jìn)一步試驗(yàn)研究[23-24]。在本研究中發(fā)現(xiàn)，GmWIN1-1參與大豆幼苗的干旱脅迫響應(yīng)。此前，已有研究發(fā)現(xiàn)，BnWIN1過(guò)表達(dá)增加了油菜種子的油含量，同時(shí)轉(zhuǎn)基因植物的鹽脅迫耐受性增強(qiáng)[13]。盡管AtWIN1過(guò)表達(dá)導(dǎo)致了擬南芥的生長(zhǎng)遲緩和種子油變化，但它導(dǎo)致蠟質(zhì)生物合成和耐旱性增強(qiáng)[15]，顯然，不同植物物種在各種生物過(guò)程中的功能存在差異?；?qū)Ψ巧锩{迫的響應(yīng)可能是由啟動(dòng)子本身引起，也可能與啟動(dòng)子相互作用的轉(zhuǎn)錄因子有關(guān)[25-26]。已有研究表明，在擬南芥中MYB106調(diào)控WIN1基因表達(dá)，轉(zhuǎn)錄因子MYB家族主要參與植物逆境脅迫，這也可能是GmWIN1-1響應(yīng)干旱脅迫的原因之一[22]。在大豆中轉(zhuǎn)錄因子MYB是否調(diào)控基因GmWIN 1-1有待進(jìn)一步的試驗(yàn)驗(yàn)證。

本研究鑒定獲得1個(gè)大豆GmWIN1-1轉(zhuǎn)錄因子，通過(guò)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)了GmWIN1-1蛋白理化性質(zhì)及功能。GmWIN1-1在花中表達(dá)最高，其基因啟動(dòng)子含有多個(gè)逆境響應(yīng)順式元件。GmWIN1-1顯著響應(yīng)干旱脅迫，可能介導(dǎo)大豆幼苗脅迫應(yīng)答調(diào)控。