任曉慶，王 波，歐陽(yáng)春平，丁鑫炎，樊潔晶，高建華

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西 太谷 030801；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院/雜糧種質(zhì)創(chuàng)新與分子育種山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山西太谷 030801）

木質(zhì)素是一種復(fù)雜且具有芳香特性的三維高分子酚類聚合物，在自然界中分布廣泛，約占生物圈有機(jī)碳的30%[1-2]。木質(zhì)素主要存在于所有維管植物的次生細(xì)胞壁中，有著諸多功能，比如，與細(xì)胞壁的組成物質(zhì)交聯(lián)，可以形成有效的對(duì)抗病原體的物理屏障[3]；木質(zhì)素填充于纖維素構(gòu)架中還可以增強(qiáng)植物細(xì)胞壁強(qiáng)度和莖稈抗彎折力，從而提高植物體的機(jī)械強(qiáng)度和抗倒伏能力[4-5]。因此，木質(zhì)素含量也是評(píng)價(jià)抗倒伏性的有效指標(biāo)[6]。

木質(zhì)素合成通常從苯丙氨酸開始，多種酶參與反應(yīng)，形成 香豆醇（p-coumaryl alcohol）、芥子 醇（Sinapyl alcohol）和松柏醇（Coniferyl alcohol）3種單體[7]，然后在過氧化物酶或漆酶等的幫助下發(fā)生復(fù)雜的聚合反應(yīng)[8-13]。其中，香豆醇聚合形成對(duì)-羥基苯基木質(zhì)素（Hydroxy-phenyl lignin，H-木質(zhì)素），芥子醇聚合形成紫丁香基木質(zhì)素（Syringyl lignin，S-木質(zhì)素），松柏醇聚合形成愈創(chuàng)木基木質(zhì)素（Guajacyl lignin，G-木 質(zhì) 素）[9]。肉 桂 醇 脫 氫 酶（Cinnamyl Alcohol Dehydrogenase，CAD）是整個(gè)合成途徑的限速酶之一[14-15]，通過催化香豆醛、芥子醛或松柏醛等加氫，相應(yīng)地生成木質(zhì)素單體。此外，CAD還具有調(diào)節(jié)木質(zhì)素單體組成形式的作用，比如，平衡G-木質(zhì)素和S-木質(zhì)素的含量，若S-木質(zhì)素缺乏，松柏醛可經(jīng)由阿魏酸-5-羥化酶（Ferulic acid-5-hydroxylase，F(xiàn)5H）和CAD的作用生成5-羥基松柏醇（5-hydroxy-coniferyl alcohol），進(jìn)而在咖啡酸-O-甲基轉(zhuǎn)移酶（Caffeic acid O-methyl transferase，COMT）的作用下轉(zhuǎn)化為芥子醇，最后生成S-木質(zhì)素[5]。

目前，在水稻（OryzasativaL.）、擬南芥（Arabidopsis thaliana）和煙草（Nicotiana tabacumL.）等植物中的CAD基因家族研究較為詳細(xì)[16]，而C4模式作物谷子（Setaria italica(L.)Beauv.）中的研究相對(duì)較少。谷子屬禾本科狗尾草屬，具有抗旱、耐貧瘠、耐鹽堿等多種優(yōu)良特性[17]。其籽粒小米營(yíng)養(yǎng)豐富，脂肪、粗纖維和維生素B1含量明顯高于大米和小麥[18]，消費(fèi)總量位居我國(guó)雜糧類食物第2。

本研究基于擬南芥、水稻已知的CAD基因，以已經(jīng)公布全基因組數(shù)據(jù)的山西省名優(yōu)谷子品種晉谷21號(hào)的超早熟突變體xiaomi為研究對(duì)象[19-20]，采用生物信息學(xué)的方法篩選和鑒定谷子CAD基因（SiCAD），并進(jìn)行了初步預(yù)測(cè)和分析，旨在為谷子木質(zhì)素代謝的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 谷子CAD基因家族成員的鑒定

本研究利用擬南芥、水稻以及狗尾草的CAD基因家族成員，在Pfam（http://pfam.xfam.org/）數(shù)據(jù)庫(kù)的Sequence Search功能中下載符合CAD基因家族的隱馬爾可夫模型（Hidden Markov Model,HMM）[21]。從Phytozome V 13數(shù) 據(jù) 庫(kù)（https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html）[22]獲 取 水 稻（Osativa_323_v7.0.protein.fa）、谷子（豫谷1號(hào)，Sitalica_312_v2.2.protein.fa）、擬 南 芥（Athaliana_167_TAIR10.protein.fa）和狗尾草（Sviridis_500_v2.1.protein.fa）的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)。從山西農(nóng)業(yè)大學(xué)MDSi谷子多組學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)（http://sky.sxau.edu.cn/MDSi.htm）獲取晉谷21號(hào)突變體xiaomi的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)（Peptids.fa）。在Tbtools軟件中利用上述CAD蛋白的HMM模型篩選2種谷子材料相關(guān)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)；利用MEGA 7軟件對(duì)4個(gè)不同物種中CAD蛋白進(jìn)行多序列比對(duì)（Clustal W法），并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（Neighbour Joining Tree，Bootstrap=1 000，其他參數(shù)設(shè)為默認(rèn)）。利用MDSi數(shù)據(jù)庫(kù)提取xiaomi CAD基因的位置信息，利用在線工具M(jìn)apGene2Chromosome V 2（http://mg2c.iask.in/mg2c_v2.1/）對(duì)基因定位的結(jié)果進(jìn)行分析并繪制染色體定位圖。

1.2 谷子CAD蛋白質(zhì)理化性質(zhì)和亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)分析

本研究利用ExPASy（https://web.expasy.org/protparam/）分析CAD蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量、氨基酸數(shù)目、等電點(diǎn)、平均親水性、不穩(wěn)定指數(shù)等指標(biāo)；利 用Softberry（http://linux1.softberry.com/）在線網(wǎng)站對(duì)谷子CAD蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)。

1.3 谷子CAD基因家族啟動(dòng)子順式作用元件分析

利用TBtools中Gtf/gff3 Sequences Extractor選項(xiàng)，將Up Stream Bases設(shè)置為2 000，進(jìn)而獲取CAD基因上游2 000 bp的序列，將所獲取的序列提交至PlantCARE（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）進(jìn)行啟動(dòng)子順式作用元件分析，最后通過TBtools對(duì)常見的功能元件進(jìn)行可視化展示。

1.4 谷子CAD基因家族motif及基因結(jié)構(gòu)分析

通過MEME（https://meme-suite.org/meme/）預(yù)測(cè)谷子CAD基因家族成員的保守基序（基序數(shù)目設(shè)置為10），同時(shí)從MDSi數(shù)據(jù)庫(kù)獲取xiaomi基因組注釋文件。

利用TBtools繪制谷子CAD基因家族成員的基因結(jié)構(gòu)和保守基序示意圖。

1.5 谷子CAD基因表達(dá)譜分析

從MDSi谷子多組學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)獲取CAD基因在不同時(shí)期不同組織中的表達(dá)量數(shù)據(jù)，通過Tbtools繪制熱圖進(jìn)行可視化展示。

2 結(jié)果與分析

2.1 谷子CAD基因家族成員的鑒定及命名

本研究基于HMM模型的篩選，在xiaomi和豫谷1號(hào)（Yugu 1）中均鑒定到13個(gè)CAD基因。依據(jù)染色體位置命名為SiCAD1~SiCAD 13，其中SiCAD2、SiCAD3、SiCAD4、SiCAD5緊密串聯(lián)形成基因簇（圖1）。

與狗尾草（11個(gè)）、擬南芥（9個(gè)）、水稻（12個(gè)）CAD蛋白的進(jìn)化關(guān)系分析顯示（圖2），谷子CAD蛋白與狗尾草的親緣關(guān)系最近，且2種谷子中的CAD蛋白同源性極高（多數(shù)>99%），僅SiCAD8、SiCAD12和SiCAD13與Yugu 1蛋白同源性較低，分別為66%、66.30%和73.20%。值得注意的是，谷子CAD基因被分為3個(gè)亞類，第1亞類包括SiCAD1、SiCAD6這2個(gè)基因；第2亞類包括8個(gè)基因：SiCAD2、SiCAD3、SiCAD 4、SiCAD5、SiCAD7、SiCAD8、SiCAD11、SiCAD12；第3亞類包括3個(gè)基因：SiCAD9、SiCAD10、SiCAD13（圖2）。

2.2 谷子CAD蛋白質(zhì)理化性質(zhì)及亞細(xì)胞定位分析

對(duì)xiaomiCAD蛋白進(jìn)行理化性質(zhì)及亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示，13個(gè)基因所編碼蛋白氨基酸數(shù)目均在300個(gè)左右，相對(duì)分子質(zhì)量接近，亞細(xì)胞定位在細(xì)胞質(zhì)中。通過預(yù)測(cè)可知，13個(gè)蛋白的等電點(diǎn)為4.91～8.99，包含4個(gè)堿性蛋白和9個(gè)酸性蛋白；平均親水性為-0.245～0.159，其中，SiCAD1、SiCAD2、SiCAD 3、SiCAD4、SiCAD5、SiCAD6、SiCAD7、SiCAD8、SiCAD10為正值，屬親水蛋白；其余基因?yàn)樨?fù)值，表明為疏水蛋白。此外，SiCAD13編碼蛋白的不穩(wěn)定系數(shù)為41.98，暗示其穩(wěn)定性較差（表1）。

表1 xiaomi CAD蛋白理化性質(zhì)及亞細(xì)胞定位Tab.1 Physicochemical properties and subcellular localization of CAD protein in xiaomi

2.3 谷子CAD基因家族啟動(dòng)子順式作用元件分析

通過對(duì)xiaomi CAD家族基因CDS上游2 000 bp的序列進(jìn)行分析，預(yù)測(cè)到12種涉及低溫響應(yīng)、激素響應(yīng)（茉莉酸甲酯、脫落酸、水楊酸和赤霉素）、光響應(yīng)以及防御和應(yīng)激響應(yīng)的順式作用元件。預(yù)測(cè)結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，啟動(dòng)子序列中含有參與干旱誘導(dǎo)和光響應(yīng)的MYB結(jié)合位點(diǎn)；13個(gè)基因上游啟動(dòng)序列所包含的順式作用元件個(gè)數(shù)、種類及排列順序沒有明顯規(guī)律（圖3）。

2.4 谷子CAD基因家族Motif及基因結(jié)構(gòu)分析

對(duì)xiaomi CAD基因家族的保守基序（motif）以及基因結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析，結(jié)果如圖4-A所示，13個(gè)SiCAD蛋白共有10個(gè)保守基序，均包含Motif 1、Motif 2、Motif 4、Motif 7和Motif 9。SiCAD12缺少M(fèi)otif 2和Motif 5；SiCAD13缺少M(fèi)otif 3、Motif 5、Motif 6、Motif 8；SiCAD8缺少M(fèi)otif 3、Motif 8；相比之下，Motif 10僅出現(xiàn)在SiCAD13中。在基因結(jié)構(gòu)方面，13個(gè)基因均為斷裂基因，包含外顯子數(shù)目為3~8個(gè)。SiCAD9和SiCAD10這2個(gè)基因最為相似（圖4-B）。

2.5 谷子CAD基因表達(dá)譜分析

利用MDSi數(shù)據(jù)庫(kù)中的轉(zhuǎn)錄組信息，對(duì)晉谷21號(hào)和xiaomi的13個(gè)SiCAD基因在不同時(shí)期的組織表達(dá)譜進(jìn)行分析，結(jié)果如圖5所示，圖中從左往右依次為晉谷21號(hào)（JG21）發(fā)芽3 d的種子、兩葉一心期植株、抽穗后2 d頂端2、3片葉、灌漿期頸穗莖節(jié)、灌漿期旗葉、灌漿期旗葉鞘、灌漿期頂端第2節(jié)莖、灌漿期頂端第4片葉、灌漿期頂端第4個(gè)葉鞘、灌漿期根、幼穗初次分化時(shí)期的穗、幼穗再次分化時(shí)期的穗、S2時(shí)期未成熟的穗碼、S4時(shí)期未成熟的穗碼、S1時(shí)期未成熟的種子、S2時(shí)期未成熟的種子、S3時(shí)期未成熟的種子、S4時(shí)期未成熟的種子、S5時(shí)期未成熟的種子、成熟后30 d種子、成熟后60 d種子、S3時(shí)期葉脈、S3時(shí)期葉肉；之后為xiaomi3周葉、孕穗期頂端第2片葉、抽穗后2 d穗、授粉期穗、灌漿期穗、灌漿期莖。第1亞類中，SiCAD6的表達(dá)量均低；而SiCAD1存在時(shí)空表達(dá)特異性，在晉谷21號(hào)灌漿期頸穗莖節(jié)和灌漿期頂端第2節(jié)莖均有可觀表達(dá)，在xiaomi灌漿期莖部的表達(dá)量也相對(duì)較高。第2亞類中，SiCAD5在xiaomi的6個(gè)部位均有表達(dá)，尤其在灌漿期莖中表達(dá)最高，在晉谷21號(hào)的灌漿期頂端第2節(jié)莖中也有較高表達(dá)；SiCAD2、SiCAD3、SiCAD4、SiCAD12在29個(gè)部位中大部分表達(dá)量較低甚至不表達(dá)；SiCAD7、SiCAD8、SiCAD11表達(dá)量較高，其中SiCAD8在晉谷21號(hào)灌漿期頂端第2節(jié)莖的表達(dá)量最高。第3亞類中，SiCAD13在xiaomi中均不表達(dá)，在晉谷21號(hào)個(gè)別部位有少量表達(dá)；SiCAD9、SiCAD10在29個(gè)部位的表達(dá)量均相對(duì)較低。

綜上可見，第1亞類SiCAD1、第2亞類SiCAD5和SiCAD 8在谷子莖稈中有較為可觀的表達(dá)，這些基因的表達(dá)可能與谷子莖稈中存在大量木質(zhì)素有關(guān)。

3 結(jié)論與討論

自1992年第1個(gè)CAD基因在煙草[16]中被發(fā)現(xiàn)以來，小麥、棉花等CAD研究也逐漸開展[23-24]，目前，谷子CAD的研究還相對(duì)較少。本研究基于名優(yōu)品種晉谷21號(hào)超早熟突變體xiaomi和豫谷1號(hào)的基因組信息，利用生物信息學(xué)的方法，篩選到13個(gè)SiCAD基因。根據(jù)進(jìn)化關(guān)系可知，SiCAD基因與狗尾草CAD基因親緣關(guān)系最近。不同谷子材料間的CAD基因數(shù)量相同，基因在染色體分布相似，除SiCAD8和Seita.6G026500同源性為66%，SiCAD12和Seita.9G156900同源性為66.3%，SiCAD13和Seita.9G292500同源性為73.2%，其余蛋白質(zhì)同源性整體極高（＞99%），說明其功能可能仍存在差異，但有待于進(jìn)一步研究確定。

CAD基因家族依據(jù)同源性以及對(duì)底物的親和力可分為3個(gè)亞類[25]，第1亞類主要在木質(zhì)素生物合成中發(fā)揮重要作用，而第2、3亞類具有多種生理作用。前人研究發(fā)現(xiàn)，第1亞類CAD基因與木質(zhì)素生物合成相關(guān)性最高[26-27]。其中水稻LOC_Os02g09490基因編碼第1亞類CAD蛋白，在木質(zhì)素單體生物合成中發(fā)揮重要作用[28]；狗尾草中Sevir.1G056800（第1亞類）是該物種木質(zhì)素合成時(shí)最主要的CAD基因[26]。通過進(jìn)化關(guān)系分析可得，基因SiCAD1和SiCAD6與Sevir.1G056800和LOC_Os02g09490在系統(tǒng)進(jìn)化樹中屬于同一分支，表明這些基因蛋白序列相似，具有相似的基因結(jié)構(gòu)，同時(shí)也可能具有相似的基因功能。由此可知，xiaomi第1亞類基因有2個(gè)（SiCAD1和SiCAD6），但是鑒于SiCAD6在xiaomi和晉谷21號(hào)2個(gè)材料共29個(gè)部位中表達(dá)量均較低甚至不表達(dá)，而SiCAD1在多組織中尤其是2個(gè)谷子材料的莖中有較高表達(dá)，因此推測(cè)SiCAD1為參與谷子木質(zhì)素合成的主要基因。

相比之下，第2、3亞類的CAD蛋白數(shù)量較多，但這些酶屬于多底物醇脫氫酶，通常具有多種生理活性[26-27]，至今尚未發(fā)現(xiàn)這2類CAD蛋白在木質(zhì)素生物合成過程中的作用[28]。狗尾草Sevir.2G207500（第2亞類）和Sevir.7G014100（第3亞類）的表達(dá)量遠(yuǎn)低于Sevir.1G056800（第1亞類），但其表達(dá)模式與木質(zhì)素沉積相關(guān)[25]。本研究發(fā)現(xiàn)，第2亞類中與Sevir.2G207500同源性最高的SiCAD 5以及Sevir.6G025000的同源基因SiCAD8在2種谷子材料不同時(shí)期莖中的表達(dá)較高。因此，推測(cè)這2個(gè)基因可能參與木質(zhì)素沉積，但是仍缺乏對(duì)莖稈木質(zhì)素含量與SiCAD基因表達(dá)量的關(guān)聯(lián)性分析，SiCAD的功能有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

本研究以晉谷21號(hào)突變體xiaomi為研究對(duì)象，以水稻、擬南芥和狗尾草的CAD基因家族為同源序列，通過序列比對(duì)，共鑒定到13個(gè)SiCAD基因，分布于谷子的1、2、4、6、7、9號(hào)染色體。結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，13個(gè)SiCAD基因均含有多個(gè)不同的啟動(dòng)子順式作用元件，它們涉及低溫響應(yīng)、激素響應(yīng)、光響應(yīng)以及防御和應(yīng)激響應(yīng)，且在啟動(dòng)子序列中發(fā)現(xiàn)了含有參與干旱誘導(dǎo)和光響應(yīng)的MYB結(jié)合位點(diǎn)，此外，還發(fā)現(xiàn)13個(gè)基因均為斷裂基因且包含多個(gè)不同的保守基序。通過基因表達(dá)譜發(fā)現(xiàn)，SiCAD1、SiCAD5、SiCAD8在谷子莖中表達(dá)量高，預(yù)測(cè)可能在木質(zhì)素合成過程中發(fā)揮作用，該研究為C4植物CAD基因家族的研究提供一定的參考。本研究明確了基因在木質(zhì)素合成過程中發(fā)揮作用的重要方法，即通過基因的表達(dá)位置及表達(dá)量確定其是否參與木質(zhì)素合成過程，而不能將基因所屬亞類作為唯一的評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)。