孫卓楠，付振鑫，孫玉榮，劉 旭，張寶俊

（山西農業(yè)大學 植物保護學院，山西 太谷 030801）

聚酮合成酶（Polyketide Synthase，PKS）可催化聚酮類化合物形成芪類、黃酮類化合物、抗生素及真菌毒素等多種物質，在防御UV、植物體營養(yǎng)生長及響應病原菌侵染等方面具有至關重要的作用[1-2]。根據蛋白結構可將PKS分為I、II和III型，其中III型PKS即查爾酮合酶（Chalcone synthase，CHs），包括Cys164、Phe215、His303和Asn336等4個保守殘基，可催化生成一系列結構各異、具有不同生理活性、含CHs基本骨架的植物次生代謝產物[3]。CHs是植物類黃酮生物合成途徑中的第1個關鍵酶，催化一分子香豆酰-CoA和三分子丙二酰-CoA生成四酮中間體，再進一步環(huán)化為查爾酮[4-5]。研究表明，CHs不僅催化類黃酮的合成而且在花青素合成、植物根瘤形成、抵抗生物脅迫和預防紫外線損傷中發(fā)揮重要作用[6-7]。

CHs基因是多基因家族，保守性較強，蛋白序列長度約400個氨基酸，在水稻、玉米、煙草及擬南芥等植物中已有研究[8]。典型的CHs家族成員參與花色素合成途徑，還有部分成員與植物抗真菌病害有關[9]，比如矮牽牛CHs突變體的花冠與花藥顏色變淺且雄性不育，而這種表型可被CHs轉基因互補[10]；高粱接種炭疽菌（Colletotrichum sublineolum）后，CHs活性升高，花青素、芹菜素大量積累，從而使高粱對炭疽菌侵染的抗性提高[11]；棉花受枯萎病菌（Fusarium oxysporumf.sp.Vasinfectum）侵染時，棉花CHs家族基因通過苯丙氨酸代謝途徑合成大量類黃酮物質，防御病原菌侵染[12]；黃瓜中CHs基因上調表達，黃酮類物質大量合成，誘導黃瓜產生抗性抵抗白粉病菌（Sphaerotheca fuliginea）的侵染[13]；紫甘薯中編碼CHs的基因發(fā)生突變后更容易被立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）侵染，當轉入CHs基因后紫甘薯合成大量類黃酮物質抵抗病原菌的侵染[14]。可見，CHs基因催化合成類黃酮等抗病類物質，調控水楊酸防御途徑，在植物響應生物與非生物脅迫的過程中有著極其重要的作用。

谷子（Sitaria italica）是我國重要的糧食作物，具有基因組小、生命周期短、抗旱抗貧瘠等特點，是C4植物抗逆基因挖掘的模式植物[15]。近年來，谷子種植面積擴大，谷子白發(fā)病、谷子銹病及谷瘟病等病害加重，嚴重影響谷子的生長及品質[16]。

本研究通過對谷子CHs家族基因成員的鑒定及同源進化分析，結合其組織特異性表達分析以及在響應禾生指梗霉菌（Sclerospora graminicola）侵染的差異表達分析，以明確CHs家族基因在谷子生長發(fā)育及抗病其他代謝通路中的作用，為谷子抗病育種奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 SiCHs基因家族數據獲取及鑒定

從Multi—omics Database for Setaria italica數據 庫（http://foxtail—millet.biocloud.net/home）獲取xiaomi全基因組數據，利用Pfam數據庫（http://pfam.xfam.org/）構建的Chal_sti_synt_C（PF00195）和Chal_sti_synt_N（PF02797）結構域的HMM模型，在TBtools[17]中利用Simple HMM Search程序，在xiaomi全基因組蛋白序列中選取比對值E—value<0.01的同源序列。

1.2 SiCHs基因蛋白特性分析、亞細胞預測及基因定位

利 用ExPASy—ProtParam tool（https://web.expasy.org/protparam/）預測谷子CHs家族蛋白序列的氨基酸數目、分子量及等電點。通過在線網站（http://psort1.hgc.jp/form.html）進行亞細胞定位。通過谷子的基因組注釋gff3文件，利用TBtools（http://dx.doi.org/10.1101/289660）對基因定位的結果進行可視化。

1.3 SiCHs基因同源進化分析及motif分析

通過MEGA 7.0[18]對篩選到的玉米、水稻和谷子的CHs家族蛋白序列進行比對后，再用最大似然法（Maximum Likelihood Estimate，MLE）構建系統(tǒng)發(fā)育樹，iTOL（https://itol.embl.de/）優(yōu)化進化樹，利用MEME（http://meme—suite.org/tools/meme）分析保守motif，并用TBtools可視化作圖。

1.4 SiCHs啟動子順式作用元件分析

提取起始密碼子上游2 000 bp的基因組序列為啟動子序列，在Plant CARE數據庫（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）預測其順式作用元件，并用TBtools進行可視化作圖。

1.5 SiCHs基因家族特異性表達分析

從Multi—omics Database for Setaria italica數據 庫(http://foxtail—millet.biocloud.net/home)中獲得谷子種子、根、莖、穗、葉等不同組織的基因表達量數據，通過R3.4.4繪制谷子CHs基因組織差異表達熱圖，進行可視化分析。

1.6 SiCHs基因家族響應禾生指梗霉菌侵染的轉錄表達分析

處理組（TG）將種子與2020年禾生指梗霉菌卵孢子按照10∶1比例混勻后種植，將耕層土壤與卵孢子按500∶1（0.2%）比例充分混勻覆蓋于種子上，菌土覆蓋2~3 cm。對照組（CK）種子采用75%無水乙醇消毒，種植于山西農業(yè)大學雜糧基地。自谷子雌雄蕊分化期至開花期間，谷穗受禾生指梗霉菌侵染刺激后，谷子穎花結構中俘片顯著伸長，引起花變葉形成“刺猬頭”。本試驗在雌雄蕊分化期至開花期每隔3 d剪取谷穗中上部，共取5次，對照組編號為CK1~CK5，處理組編號為TG1~TG5，液氮速凍，-80℃保存，3次生物學重復。將上述樣品進行轉錄組測序建庫，利用轉錄組數據中FPKM值，通過R 3.4.4繪制谷子CHs基因響應禾生指梗霉菌侵染的表達熱圖，進行可視化分析，通過Gene Ontology（GO）數據庫（http://geneontology.org）對差異表達基因進行GO富集分析。

2 結果與分析

2.1 SiCHs基因家族的鑒定、理化性質和基因定位

通過Pfam數據庫篩選得到同時含有Chal_sti_synt_C和Chal_sti_synt_N等2個結構域的SiCHs家族基因共33個（圖1），按照其在染色體上的位置（圖2），命名為SiCHs1~SiCHs33，其中，SiCHs1~SiCHs33分布于谷子1、2、4、5、7、8、9號染色體，其中在8號染色體上分布最多為11個（SiCHs17~SiCHs27）。對SiCHs蛋白進行理化性質和亞細胞定位預測結果顯示（表1），除SiCHs19僅編碼156個氨基酸外，其余SiCHs基因編碼氨基酸序列長度在331~530 bp，平均氨基酸數目423個；蛋白分子質量為16.74~57.50 ku；SiCHs家族33個成員的總平均親水性（GRAVY）為負值，為疏水性蛋白；亞細胞定位多在細胞質，為一類調控酶合成的蛋白。

2.2 SiCHs家族蛋白序列同源進化分析及保守基序分析

對玉米、水稻與谷子的98個CHs蛋白進行比對，結果顯示，CHs基因被分為5大類（圖3）。class1含有15個CHs同源基因，包括6個谷子CHs、6個玉米CHs和3個水稻CHs；class2含有16個CHs同源基因，包括5個谷子CHs、7個水稻CHs和4個玉米CHs；class3含有13個CHs同源基因，包括7個谷子CHs、3個水稻CHs和3個玉米CHs；class4含有24個CHs同源基因，包括3個谷子CHs、17個水稻CHs和4個玉米CHs；class5含有30個CHs同源基因，包括12個谷子CHs、13個玉米CHs和5個水稻CHs。其 中，SiCHs13、SiCHs14、SiCHs25和SiCHs27這4個基因單獨分支，推測不同物種在進化過程中部分基因功能不同。

SiCHs基因家族成員的保守序列基序分析顯示（圖4），33個SiCHs蛋白序列共鑒定到8個保守序列基序，命名為motif1～motif8。33個SiCHs蛋白序列中均存在motif3、motif8和motif6，motif3中較為保守的序列為DLRLASLLGLRPSVRRTMLYG MGCSAGLAALRLAKDLAE，motif8中較為保守的序列為NNRGARVLVVCSEIT，motif6中較為保守的序列為MLVGQALFGDGAAAVIVGADP。class1~class5中，class2中的SiCHs24、SiCHs17不包含motif2；class3中的SiCHs19不包含motif1、motif2、motif4、motif5；class4中的SiCHs31不包含motif4、motif2、motif7；class5中SiCHs30、SiCHs1不包含motif2，且SiCHs2、SiCHs9、SiCHs10、SiCHs11、SiCHs15、SiCHs32、SiCHs33不包含motif2、motif4，其余class1~class5中SiCHs基因均含有motif1~motif8，且排布基本一致。說明CHs蛋白家族成員基本結構相對保守。

2.3 SiCHs基因家族啟動子順式作用元件

對SiCHs基因上游2 000 bp的序列進行順式作用元件預測，結果共鑒定了20種順式作用元件（圖5）。SiCHs12、SiCHs26包含的順式調控元件最多為12種；SiCHs15包含的順式調控元件最少僅3種。該家族中具有防御和應激響應元件的基因有16個，8個基因具有玉米醇溶蛋白代謝調節(jié)響應元件，3個基因具有類黃酮生物合成基因調控響應元件，表明谷子CHs基因家族可能參與調控谷子響應病菌侵染的過程；31個基因具有MeJA響應元件，29個基因具有脫落酸響應元件，具有赤霉素響應元件的基因數目達18個，具有生長素響應元件的基因為12個，具有水楊酸響應元件的基因為7個，表明谷子CHs基因家族可能參與調控激素合成信號。此外，SiCHs家族基因還包括低溫響應、干旱脅迫、光響應、分生組織表達、胚乳表達等順式作用元件。

2.4 SiCHs基因家族特異表達分析

SiCHs基因在Xiaomi不同組織中的表達結果表明（圖6），在莖中，SiCHs2、SiCHs27、SiCHs32基因表達量高于其他基因，其中SiCHs27表達量高達377.31，SiCHs2、SiCHs32基因表達量分別為86.57和86.92，其余基因低表達或不表達。在根中，SiCHs18基因表達量為89.74，其余基因低表達或不表達。在種子、葉和穗中SiCHs家族基因低表達或不表達。測定結果表明，谷子CHs家族基因的表達存在組織特異性表達。

2.5 SiCHs基因家族響應禾生指梗霉菌侵染的轉錄表達分析

在CK 1~CK 5、TG1~TG5這10個樣本中，去除表達量為0的5個基因（SiCHs3、SiCHs5、SiCHs16、SiCHs18、SiCHs19）。對樣本中其余28個共有的差異表達基因進行聚類分析，根據表達模式的不同，可將這些差異表達基因聚為2類（圖7）。聚類1（Cluster1）中有6個基因，與CK組比較，TG組表達下調，GO功能富集在脂肪酸的生物合成過程（GO:006633）、四酮α—吡喃酮合酶活性（GO:0090439）、花粉外壁形成（GO:0010584）、苯丙烷生物合成（GO:0009699）、聚酮生物合成（GO:0030639）、孢粉素生物合成（GO:0080110）等通路。聚類2（Cluster2）中有22個基因，與CK組比較，TG組表達上調，且在TG4、TG5時期顯著上調，GO功能富集在類黃酮物質合成（GO:0009813）、查耳酮生物合成（GO:0009715）、花青素生物合成（GO:0031540）、蠟質合成（GO:0010025）、防御反應（GO:0009611）、生長素運輸（GO:0009926）、茉莉酸抗病性（GO:0009753）、花粉管發(fā)育（GO:0048868）等通路。說明谷子受禾生指梗霉侵染后，CHs家族基因通過合成抗病類次生代謝產物及調控激素來防御病原菌侵染。

3 結論與討論

本研究利用生物信息學方法對Xiaomi中的33個CHs基因進行分析發(fā)現，SiCHs基因與玉米、擬南芥、水稻等同源性較高，可能與同屬禾本科單子葉植物有關，CHs家族在進化過程中相對保守。SiCHs家族成員多分布于8號染色體上，這與擬南芥中鑒定的聚類和分布情況相似[19]。亞麻中疏水性氨基酸占比較高，與本研究中SiCHs家族基因結果一致[20]。亞細胞定位預測表明，SiCHs蛋白多在細胞質，為一類調控酶合成的蛋白。林玲等[21]研究發(fā)現，辣木CHs基因在細胞質形成結合位點，與酶合成相關。SiCHs基因家族在Xiaomi不同組織中特異表達，在多種植物中也觀察到類似的現象，如擬南芥、苦蕎、辣椒等[22]。SiCHs2、SiCHs27和SiCHs32基因的表達主要集中在莖部，與茶樹CHs基因在莖中表達量最高的結果相一致[23]。SiCHs18基因的表達主要集中在根部，與桑樹CHs4基因在根皮中顯著表達的結果一致[24]。

對SiCHs啟動子順式作用元件預測分析，發(fā)現SiCHs啟動子區(qū)含有茉莉酸甲酯、水楊酸、生長素、赤霉素、脫落酸反應等激素響應元件，推測SiCHs的表達可能受激素影響。這與在煙草中CHs基因NTCHs啟動子區(qū)也含有茉莉酸甲酯、水楊酸、生長素等激素響應元件一致[25]。其次，SiCHs啟動子區(qū)含有類黃酮合成基因調控、玉米醇溶蛋白代謝、低溫反應、干旱脅迫等防御應激響應元件，預測SiCHs可提高谷子抵抗逆境脅迫和病原菌侵染的能力。水稻CHs啟動子區(qū)包含類黃酮物質合成、干旱誘導、缺氧誘導等防御和脅迫響應的作用元件[26]。再者，SiCHs啟動子區(qū)含有分生組織表達、胚乳表達等順式作用元件，與蕎麥中CHs基因的部分啟動子元件功能一致[27]，推測SiCHs可能參與谷子生長發(fā)育調控。

本研究發(fā)現，受禾生指梗霉菌侵染，SiCHs家族中22個基因在穗部誘導高表達，類黃酮、花青素等抗病類次生代謝物質合成及水楊酸、茉莉酸、生長素等激素合成途徑顯著富集。芒果CHs基因表達量與查爾酮含量協同增減，查爾酮對11種芒果病原菌均具有明顯抑制活性，MiCHs參與了植物自身防御反應[28]。大麗輪枝菌侵染擬南芥后，AtCHs基因上調表達，并合成花青素、類黃酮等抵抗病原菌的侵染[29]。推測谷子受禾生指梗霉菌侵染后，SiCHs家族基因通過合成抗病類次生代謝產物及調控激素來防御病原菌侵染及擴展。

本研究基于Xiaomi基因組和轉錄組數據，鑒定了33個SiCHs基因。通過染色體定位分析，發(fā)現8號染色體上基因最多，且位于8號染色體的SiCHs27在莖部特異表達，SiCHs18在根部特異表達。SiCHs啟動子序列包含與激素響應相關、抗病類次生代謝、生長發(fā)育調控及逆境響應等順式作用元件。SiCHs家族基因通過調控激素、類黃酮物質合成等途徑抵抗禾生指梗霉菌的侵染。本研究結果可為進一步分析谷子CHs基因家族的功能及在谷子生長過程中的調控機制提供參考。