崔莉莉 梅曉峰 盧瑞龍 徐可心 田燕歌

(1.河南中醫(yī)藥大學(xué)呼吸疾病中醫(yī)藥防治省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心,河南省中醫(yī)藥防治呼吸病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,鄭州 450046;2.河南中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥科學(xué)院,鄭州 450046)

肺血管結(jié)構(gòu)和功能的改變是慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease,COPD)的主要病理特征,可損害氣體交換功能、引起肺動(dòng)脈高壓,影響患者預(yù)后[1]。研究發(fā)現(xiàn),在輕度COPD患者或肺氣腫易感的吸煙人群中即出現(xiàn)肺小血管血流異常,且隨疾病進(jìn)展而惡化[2]。香煙煙霧、細(xì)菌等有害物質(zhì)進(jìn)入機(jī)體,細(xì)小顆粒隨氣體交換進(jìn)入肺小血管,促進(jìn)炎癥細(xì)胞的募集及血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的釋放,引起內(nèi)皮和血管平滑肌增殖,形成肺血管重塑,終致肺動(dòng)脈高壓、肺源性心臟病[3-6]。通過CT 觀察發(fā)現(xiàn),肺小血管的改變能反映患者肺氣腫程度及是否存在肺動(dòng)脈高壓,且對(duì)于判斷患者預(yù)后具有重要意義[7]?？梢?肺小血管改變發(fā)生較早,并與COPD疾病進(jìn)展及預(yù)后關(guān)系密切。本研究在前期研究基礎(chǔ)上[8],比較了在香煙煙霧、細(xì)菌及其聯(lián)合的刺激因素下,不同時(shí)間點(diǎn)肺小血管重塑情況,以期為深入研究COPD 合并肺血管病變機(jī)制及相關(guān)治療提供模型依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF 級(jí)BALB/c 小鼠72 只,雄性,體重為20～22 g,購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司[SCXK(京)2021-0006],并飼養(yǎng)于河南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心[SYXK(豫)2021-0015]。本實(shí)驗(yàn)均通過河南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理審查委員會(huì)審查(DWLL202003210),并按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R 原則給予人道的關(guān)懷。

1.1.2 細(xì)菌

肺炎克雷伯桿菌(46114)由中國(guó)生物制品檢驗(yàn)鑒定所提供,使用前將細(xì)菌濃度調(diào)整為5×109CFU/L。

1.2 主要試劑與儀器

紅旗渠牌過濾嘴香煙,由河南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司生產(chǎn),焦油量10 mg,煙氣煙堿量0.8 mg,煙氣一氧化碳量12 mg。

SABC 免疫組化試劑盒(Boster,批號(hào):16K13E28J0922);DAB 顯色試劑盒(Boster,批號(hào):16K04A27);VEGF 抗體 (proteintech,批號(hào):00062384)。動(dòng)物肺功能檢測(cè)系統(tǒng)(FinePointe,美國(guó));Leica-DM6000B 光學(xué)顯微鏡及LAS V4.7 照相系統(tǒng)(Leica,德國(guó));Image-Pro Plus(IPP)6.0 專業(yè)圖像分析系統(tǒng)(Cybernetics,美國(guó));CaseViewer(C.V)2.4 切片瀏覽分析系統(tǒng)(3D histech,匈牙利)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 動(dòng)物分組及小鼠模型制備

72 只SPF 級(jí)BALB/c 雄性小鼠,適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d 后,通過隨機(jī)數(shù)字法分為4 組:正常組(Normal組)、細(xì)菌組(KP 組)、香煙煙霧組(CS 組)、香煙煙霧聯(lián)合細(xì)菌組(CS+KP 組),每組18 只。CS 暴露方法:使用煙熏系統(tǒng)裝置進(jìn)行煙霧暴露,使煙霧濃度達(dá)到(3000±500)ppm,每次40 min,每天2 次(早晚各1 次);KP 感染方法:每只小鼠鼻腔滴入20 μL KP 稀釋液,每7 d 一次。正常組給予過濾空氣加生理鹽水滴鼻,CS 組給予香煙煙霧暴露及生理鹽水滴鼻,KP 組給予過濾空氣和KP 稀釋液滴鼻,香煙煙霧聯(lián)合細(xì)菌組,采用上述CS 暴露和反復(fù)KP 感染法聯(lián)合處理。第1～8 周造模,觀察至第16 周。分別于第4、8、16 周結(jié)束后各組隨機(jī)選取6 只,進(jìn)行分批取材。

1.3.2 肺功能測(cè)定

第0、4、8、12、16 周末采用全身體積描記系統(tǒng),檢測(cè)小鼠肺功能,觀察呼氣中期流速(50% expiratory flow,EF50)和潮氣量(tidal volume,TV)指標(biāo)。

1.3.3 肺組織病理改變

左肺經(jīng)10%中性甲醛固定,石蠟包埋切片并采用HE 染色。光學(xué)顯微鏡下觀察100 μm≤直徑≤300 μm 肺小動(dòng)脈的形態(tài)變化,測(cè)量肺血管直徑(vessel diameter,VD)、管壁厚度(wall thickens,WT),血管總面積(total area,TA)、管壁面積(wall area,WA=TA-LA)、管腔面積(luminal area,LA),計(jì)算管壁厚度占血管直徑百分比(WT%=WT/VD×100%)、管壁面積占血管總面積百分比(WA%=WA/TA×100%)及管腔面積占血管總面積百分比(LA%=LA/TA×100%)進(jìn)行量化分析。

1.3.4 免疫組化學(xué)檢測(cè)血管VEGF 的蛋白表達(dá)

肺組織石蠟包埋切片后,進(jìn)行烤片、脫臘、抗原修復(fù)、血清封閉后,加VEGF 一抗(1 ∶5000)4℃過夜,次日滴加二抗、DAB 顯色液、蘇木素復(fù)染后,采用Leica-DM6000B 光學(xué)顯微鏡及LAS V4.7 照相系統(tǒng)進(jìn)行觀察VEGF 血管陽性表達(dá)并拍照記錄。Image-Pro-Plus6.0 軟件計(jì)算光密度并量化比較。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行各組數(shù)據(jù)分析。數(shù)據(jù)處理結(jié)果以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示;不同組間采用單因素方差分析,符合正態(tài)分布且方差齊者采用LSD 分析,方差不齊者采用Dunnett’sT3 進(jìn)行分析,以P<0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況

實(shí)驗(yàn)觀察期間,正常組小鼠毛色光亮、呼吸均勻、精神良好且食量正常,CS 組從第8 周出現(xiàn)毛發(fā)微黃、精神不振且呼吸淺快,KP 組僅第8 周出現(xiàn)精神不振、食量減少,CS+KP 組從第4 周出現(xiàn)毛發(fā)干枯發(fā)黃、呼吸急促、精神萎頓且食量減少。各組觀察至第16 周,未出現(xiàn)動(dòng)物死亡現(xiàn)象。

2.2 各組小鼠肺功能變化

第0～16 周,各組小鼠肺功能TV、EF50 隨時(shí)間均有升高趨勢(shì),但正常組升高較為顯著,其余組升高緩慢。與正常組比較,CS 組TV 在第8 周顯著降低并持續(xù)到第12 周,EF50 在第8 周顯著降低且持續(xù)到第16 周(P<0.05);CS+KP 組TV 在第4 周顯著降低并持續(xù)到第16 周(P<0.05),EF50 在第8 周顯著降低且持續(xù)到第16 周(P<0.05);KP 組無顯著差異。見表1、表2。

表1 各組小鼠不同時(shí)間點(diǎn)TV 的比較(,mL/s,n=6)Table 1 Comparison of TV in each group of mice at different time points

表1 各組小鼠不同時(shí)間點(diǎn)TV 的比較(,mL/s,n=6)Table 1 Comparison of TV in each group of mice at different time points

注:與正常組比較,#P<0.05。Note.Compared with normal group,#P<0.05.

表2 各組小鼠不同時(shí)間點(diǎn)EF50 的比較(,mL/s,n=6)Table 2 Comparison of EF50 in each group of mice at different time points

表2 各組小鼠不同時(shí)間點(diǎn)EF50 的比較(,mL/s,n=6)Table 2 Comparison of EF50 in each group of mice at different time points

注:與正常組比較,#P<0.05。Note.Compared with normal group,#P<0.05.

2.3 各組小鼠肺組織病理變化

正常組各時(shí)期鏡下觀察肺泡結(jié)構(gòu)完整、間隔均勻,無炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。CS 組第8 周肺泡間隔破裂明顯且有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)持續(xù)到第16 周;KP 組第8 周肺泡出現(xiàn)部分破裂融合且有少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn),炎癥浸潤(rùn)第16 周仍存在;CS+KP 組第4 周肺泡腔已出現(xiàn)不規(guī)則擴(kuò)張融合、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)并持續(xù)到第16周。見圖1。

圖1 不同時(shí)期各組小鼠肺組織病理變化(HE 染色)Figure 1 Histopathological changes of lung in each group of mice in different periods(HE staining)

2.4 各組小鼠肺組織血管結(jié)構(gòu)變化

正常組各時(shí)期鏡下觀察小鼠肺血管未見明顯的病理改變,血管管腔形態(tài)及管壁厚度正常,未見明顯的炎性浸潤(rùn);CS 組在第8 周,肺小動(dòng)脈可見中膜增厚、管腔狹窄、周圍炎性浸潤(rùn)明顯并持續(xù)到第16 周;KP 組僅第8 周,肺小動(dòng)脈出現(xiàn)管壁增厚、管腔狹窄等病理變化;CS+KP 組在第4 周,肺小動(dòng)脈就已出現(xiàn)中膜增厚且呈肌化、管腔狹窄及大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)并持續(xù)到第16 周。

與正常組比較,CS 組WT%在第8 周顯著升高并持續(xù)到第16 周,WA%僅第8 周顯著升高、LA%僅第8 周顯著降低(P<0.05);CS+KP 組WT%、WA%自第4 周顯著升高且并持續(xù)到第16 周,LA%自第4周顯著降低且持續(xù)到第16 周(P<0.05);KP 組WT%僅第8 周顯著升高,LA%僅在第8 周顯著降低(P<0.05);CS+KP 組較CS 組,WT%在第8 周持續(xù)顯著升高并持續(xù)到第16 周,WA%第16 周顯著升高,LA%第16 周顯著降低(P<0.05);CS+KP 組較KP 組,WT%、WA%在第8 周持續(xù)顯著升高且持續(xù)到第16 周,LA%在第4 周持續(xù)顯著降低且持續(xù)到第16 周(P<0.05),CS 組較KP 組,WT%僅第8 周升高、LA%僅第8 周降低(P<0.05)。見圖2、表3、表4、表5。

表3 各組小鼠不同時(shí)間點(diǎn)WT%比較(,n=6)Table 3 Comparison of WT% in each group of mice at different time points

表3 各組小鼠不同時(shí)間點(diǎn)WT%比較(,n=6)Table 3 Comparison of WT% in each group of mice at different time points

注:與正常組比較,#P<0.05;與香煙煙霧組比較,?P<0.05;與細(xì)菌組比較,ΔP<0.05。Note.Compared with normal group,#P<0.05.Compared with CS group,?P<0.05.Compared with KP group,ΔP<0.05.

表4 各組小鼠不同時(shí)間點(diǎn)WA%比較(,n=6)Table 4 Comparison of WA% in each group of mice at different time points

表4 各組小鼠不同時(shí)間點(diǎn)WA%比較(,n=6)Table 4 Comparison of WA% in each group of mice at different time points

注:與正常組比較,#P<0.05;與香煙煙霧組比較,?P<0.05;與細(xì)菌組比較,ΔP<0.05。Note.Compared with normal group,#P<0.05.Compared with CS group,?P<0.05.Compared with KP group,ΔP<0.05.

表5 各組小鼠不同時(shí)間點(diǎn)LA%比較(,n=6)Table 5 Comparison of LA% in each group of mice at different time points

表5 各組小鼠不同時(shí)間點(diǎn)LA%比較(,n=6)Table 5 Comparison of LA% in each group of mice at different time points

注:與正常組比較,#P<0.05;與香煙煙霧組比較,?P<0.05;與細(xì)菌組比較,ΔP<0.05。Note.Compared with normal group,#P<0.05.Compared with CS group,?P<0.05.Compared with KP group,ΔP<0.05.

圖2 不同時(shí)期各組小鼠肺血管病理變化(HE 染色)Figure 2 Changes in pulmonary vascular pathology in each group of mice at different periods(HE staining)

2.5 各組小鼠肺組織VEGF 蛋白表達(dá)變化

與正常組比較,CS 組VEGF 陽性表達(dá)僅第8 周顯著增加(P<0.05);CS+KP 組VEGF 陽性表達(dá)自第4 周顯著升高并持續(xù)到第16 周(P<0.05);KP 組VEGF 陽性表達(dá)無顯著趨勢(shì)。見圖3、表6。

表6 各組小鼠不同時(shí)間點(diǎn)VEGF 比較(,n=5～6)Table 6 Comparison of VEGF in each group of mice at different time points

表6 各組小鼠不同時(shí)間點(diǎn)VEGF 比較(,n=5～6)Table 6 Comparison of VEGF in each group of mice at different time points

注:與正常組比較,#P<0.05;與香煙煙霧組比較,?P<0.05;與細(xì)菌組比較,ΔP<0.05。Note.Compared with normal group,#P<0.05.Compared with CS group,?P<0.05.Compared with KP group,ΔP<0.05.

圖3 各組小鼠肺組織VEGF 表達(dá)變化(IHC)Figure 3 Changes in VEGF expression in lung tissues in each group of mice

3 討論

COPD 是一種以氣流受限、慢性進(jìn)行性氣道炎癥為特點(diǎn)的肺部疾病,肺血管病變?cè)贑OPD 患者中普遍存在[2]。臨床研究發(fā)現(xiàn),約30%～70%的COPD患者存在顯著肺血管病變,加重疾病惡化程度[9]。此外,肺小動(dòng)脈缺氧性收縮可促進(jìn)血管內(nèi)膜增厚、平滑肌增生,導(dǎo)致血管結(jié)構(gòu)改變,最終形成肺動(dòng)脈高壓[10]。香煙煙霧、環(huán)境污染物等多種致病因素可引起肺小血管的改變[11]。香煙煙草中含有大量有毒成分,長(zhǎng)期香煙煙霧刺激引起氣道平滑肌細(xì)胞增殖的同時(shí),還可通過血小板衍生生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)肺小動(dòng)脈平滑肌層的增厚、管腔變窄、增加右心室收縮壓,從而引起肺血管重構(gòu),繼發(fā)肺動(dòng)脈高壓[12-13]。細(xì)菌感染也是COPD 發(fā)生發(fā)展的重要致病因素,其中,肺炎克雷伯桿菌為常見的病原菌,可導(dǎo)致支氣管炎癥、氣道重塑及肺小動(dòng)脈管壁增厚明顯等病理特征,與患者進(jìn)展和預(yù)后密切相關(guān)[14-16]。目前,COPD 模型制備方法包括單一因素誘導(dǎo)的模型,例如CS 暴露[17]、細(xì)菌感染[18]、病毒感染[19],及復(fù)合因素誘導(dǎo)的模型,例如CS 聯(lián)合細(xì)菌[15,20-21]或病毒感染[8]、CS 聯(lián)合脂多糖[22]等。課題組前期比較了香煙、細(xì)菌、病毒及香煙聯(lián)合細(xì)菌或病毒因素建立的COPD 小鼠模型,發(fā)現(xiàn)均可引起肺功能下降、肺組織結(jié)構(gòu)損傷[8]。本研究在此基礎(chǔ)上,選取CS、KP 及其聯(lián)合三種方法誘導(dǎo)COPD 小鼠模型,以肺血管結(jié)構(gòu)變化為主要指標(biāo),觀察不同誘導(dǎo)因素下肺血管的動(dòng)態(tài)變化,為深入探討COPD 血管病變機(jī)制、藥物對(duì)肺血管的作用及遠(yuǎn)后效應(yīng)評(píng)價(jià)、藥物作用機(jī)制研究提供模型依據(jù)。

肺功能下降不僅反映氣流受限程度,還與肺血管重構(gòu)程度有關(guān),當(dāng)肺實(shí)質(zhì)破壞和血管管壁發(fā)生異常改變時(shí),損害了肺泡腔中氣體交換功能,導(dǎo)致肺功能逐漸下降[23-24]。EF50 作為衡量氣道阻力指標(biāo),反映小鼠支氣管阻塞程度,TV 反映肺通氣功能[25-26]。本研究發(fā)現(xiàn),單獨(dú)香煙煙霧暴露在第8周,TV 明顯降低,小鼠出現(xiàn)呼吸淺快,在第16 周仍存在;EF50 在第8 周降低,出現(xiàn)明顯氣道阻塞并在第16 周仍存在。單獨(dú)細(xì)菌感染EF50、TV 降低并不明顯,提示小鼠無明顯氣道阻力,且呼吸無明顯異常。香煙煙霧聯(lián)合細(xì)菌感染在第4 周,TV 明顯降低,小鼠即出現(xiàn)呼吸淺快,在第16 周持續(xù)存在;EF50 在第8 周降低,出現(xiàn)明顯氣道阻力且在第16周仍持續(xù)存在。說明香煙煙霧或其聯(lián)合細(xì)菌感染可明顯降低小鼠肺通氣功能,引起氣道阻塞,且在去除刺激因素(比如戒煙)后難以逆轉(zhuǎn)。

多種刺激因素導(dǎo)致的缺氧、慢性炎癥,促進(jìn)血管壁分泌VEGF 等細(xì)胞因子,并通過肺血管平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化,刺激血管病理性生成,破壞血管內(nèi)皮屏障,從而出現(xiàn)管壁內(nèi)膜增厚、管腔狹窄甚至閉塞等病理表現(xiàn),最終導(dǎo)致肺血管結(jié)構(gòu)重塑[27-30]。本研究以管壁厚度、管壁面積、管腔面積為肺血管重塑指標(biāo),并選取直徑小于300 μm 的接近于肺小動(dòng)脈范圍的血管,通過測(cè)量分析發(fā)現(xiàn),單獨(dú)香煙煙霧暴露在第8 周,出現(xiàn)肺小動(dòng)脈管壁增厚、管腔狹窄,VEGF 表達(dá)明顯增加,第16 周管壁增厚仍存在,而管腔狹窄僅第8 周存在;單獨(dú)細(xì)菌感染僅第8 周出現(xiàn)管壁增厚、管腔狹窄的病理變化;香煙煙霧聯(lián)合細(xì)菌感染4 周即出現(xiàn)肺小動(dòng)脈管壁增厚、管腔狹窄及VEGF 表達(dá)明顯現(xiàn)象,并在第16 周仍存在。說明香煙煙霧、細(xì)菌及其聯(lián)合均可引起肺小動(dòng)脈重塑,但復(fù)合因素誘導(dǎo)的模型肺小動(dòng)脈重塑發(fā)生較早,持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)。

綜上,香煙煙霧、肺炎克雷伯桿菌及其聯(lián)合刺激8 周均能誘導(dǎo)小鼠出現(xiàn)肺泡破裂、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、肺血管重塑等COPD 病理特征,但各有特點(diǎn):單獨(dú)香煙刺激8 周出現(xiàn)肺功能下降、肺泡結(jié)構(gòu)斷裂融合,并在第16 周仍存在,但肺血管重塑僅第8 周明顯;單獨(dú)細(xì)菌感染肺功能下降不明顯,肺組織炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)明顯并持續(xù)存在,肺泡結(jié)構(gòu)改變及肺血管重塑僅第8 周存在;香煙煙霧聯(lián)合細(xì)菌感染復(fù)合刺激4 周即出現(xiàn)肺功能下降、肺泡結(jié)構(gòu)的破壞及肺血管重塑,第16 周仍持續(xù)存在。因此,對(duì)于COPD 合并肺血管病理機(jī)制及藥物作用機(jī)制的研究可選用單獨(dú)香煙暴露或者香煙煙霧聯(lián)合細(xì)菌感染模型,對(duì)于藥物作用特點(diǎn)、遠(yuǎn)后效應(yīng)評(píng)價(jià)的研究選用香煙煙霧聯(lián)合細(xì)菌感染復(fù)合模型較為妥當(dāng)。