楊鵬 張華 李欣淼 張子敬 劉賢 趙楊楊 田全召 王二耀 雷初朝 陳宏 黃永震*

（1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，陜西咸陽(yáng) 712100；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部科技發(fā)展中心，北京 100176；3.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，河南鄭州 450002；4.河南省鼎元種牛育種有限公司，河南鄭州 450000）

隨著全球農(nóng)業(yè)反芻動(dòng)物產(chǎn)業(yè)技術(shù)的發(fā)展，我國(guó)人民對(duì)于優(yōu)異種質(zhì)資源認(rèn)識(shí)和需求的加深，家畜培育、養(yǎng)殖及相關(guān)產(chǎn)業(yè)對(duì)我國(guó)國(guó)民生活水平和國(guó)家經(jīng)濟(jì)發(fā)展有重要意義。我國(guó)具有動(dòng)物遺傳資源豐富的天然優(yōu)勢(shì)，但隨著科技水平的發(fā)展和人民生活水平的提高，國(guó)內(nèi)及國(guó)際市場(chǎng)對(duì)畜產(chǎn)品的需求發(fā)生了巨大的變化，僅依靠自然選擇獲得的品種遠(yuǎn)不能滿足當(dāng)前的需求。而在一些地方，“重引進(jìn)、雜交，輕培育和保護(hù)” 的情況非常嚴(yán)重，導(dǎo)致本土品種遺傳資源缺失，且培育效果不佳。20 世紀(jì)末，隨著分子生物技術(shù)的迅猛發(fā)展，以DNA 水平的各種技術(shù)為支撐，發(fā)展出了一套分子標(biāo)記鑒定技術(shù)，突破了常規(guī)育種的限制因素，提高了育種精確度。在此之后，基因芯片技術(shù)的興起與發(fā)展，擴(kuò)大了遺傳標(biāo)記的檢測(cè)范圍，實(shí)現(xiàn)了大量標(biāo)記并行檢測(cè)。而隨著測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，基因組學(xué)飛速發(fā)展，本文旨在對(duì)分子育種技術(shù)進(jìn)行分類總結(jié)，并綜述了分子標(biāo)記、基因芯片和全基因組選擇在黃牛育種中的應(yīng)用，以期為后續(xù)育種工作提供材料參考和技術(shù)支撐。

1 分子育種的分類

1.1 分子標(biāo)記

DNA 分子標(biāo)記是利用測(cè)定遺傳物質(zhì)產(chǎn)生的變化來確定樣本DNA 的變異情況，并以此作為標(biāo)記。這種技術(shù)為遺傳多樣性的研究提供了新的形式[1]。分子標(biāo)記可以通過檢測(cè)準(zhǔn)確反映出檢測(cè)個(gè)體遺傳物質(zhì)遺傳變異的特征信息。優(yōu)良的分子標(biāo)記具有多種優(yōu)點(diǎn)，包括①較高的多態(tài)水平，基因多態(tài)是指在家畜群體中，影響個(gè)體表型的同種基因以多種基因型存在，而較高的多態(tài)水平和樣本量，有利于在試驗(yàn)中檢測(cè)出個(gè)體間的差異，差異性越大，越能體現(xiàn)出優(yōu)勢(shì)基因和優(yōu)勢(shì)基因型；②范圍大，覆蓋群體面積大，有利于我們?cè)诩倚笕后w中開展研究；③分子遺傳標(biāo)記不受個(gè)體年齡、性別和環(huán)境等因素限制，提高了育種的速度和效果；④基因的明確性，可確定所有基因型[2-3]。根據(jù)不同原理，分子標(biāo)記可分為以下幾種：①以分子雜交為核心內(nèi)容的技術(shù)，包括限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP）、數(shù)目可變串聯(lián)重復(fù)多態(tài)性（Variable number of tandem repeats，VNTR）。限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性是指同種生物不同個(gè)體間DNA 序列產(chǎn)生差異，形成可被限制性內(nèi)切酶識(shí)別的序列進(jìn)而可被消化，被消化后的產(chǎn)物由于長(zhǎng)度不同可通過電泳進(jìn)行分型[4]。數(shù)目可變串聯(lián)重復(fù)多態(tài)性是多態(tài)性程度高，重復(fù)性高的DNA 片段，分布廣并且種類多，又分為微衛(wèi)星序列（又稱簡(jiǎn)單重復(fù)序列）和小衛(wèi)星序列[5]；②以PCR 為核心的分子標(biāo)記技，包括隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA（random amplified polymorphic DNAs，RAPD）[6]，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性（Amplified Fragment Length Polymorphism，AFLP）[7]等；③第三種是較為新穎的分子標(biāo)記，如單核苷酸多態(tài)性（Single Nucleotide Polymorphism，SNP）、表達(dá)序列標(biāo)簽（Expressed Sequence Tags，EST）[8]。依靠PCR、電泳等技術(shù)對(duì)重要基因進(jìn)行分型來研究基因表達(dá)和調(diào)控規(guī)律逐漸不足以滿足育種需求，基因芯片的產(chǎn)生，很大程度上改善了這一問題。

1.2 基因芯片

基因芯片（gene chip）又可稱為DNA 微陣列（DNA microarray），是一種通過在固體支持物上設(shè)置成千上萬的核酸探針，將檢測(cè)樣本置于芯片上進(jìn)行雜交，檢測(cè)信號(hào)確定受檢個(gè)體的遺傳信息[9]。20 世紀(jì)80年代，研究者們參考計(jì)算機(jī)芯片將寡核苷酸分子固定在固相載體上，制成首個(gè)芯片[10]?；蛐酒鶕?jù)不同標(biāo)準(zhǔn)具有不同分類，例如依據(jù)固相載體上的探針種類可分為cDNA 芯片和寡核苷酸芯片[11]；根據(jù)不同固相載體可分為玻璃芯片、硅芯片等；根據(jù)其功能還可以分為DNA 測(cè)序芯片、表達(dá)譜芯片等[12]。目前，單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）芯片廣泛引用在家畜育種工作中，包括品種起源、群體組成和功能分析等。

1.3 基因組選擇

2009 年，?；蚪M的公布標(biāo)志著研究者們對(duì)牛的研究將進(jìn)入新階段[13]。?；蚪M涵蓋了至少22000 個(gè)基因，其中14345 個(gè)基因與其他7 個(gè)哺乳動(dòng)物存在同源關(guān)系。全基因組中存在高密度特異性區(qū)域，泌乳與免疫方面存在物種特異性變異，這為后續(xù)牛全基因組方面的研究打下堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。在此之后，不同版本的牛參考基因組相繼公布——Bos taurus5.0、UMD 3.1.1 和ARS-UCD1.2。緊接著，以?；蚪M為核心，研究者們結(jié)合全基因組重測(cè)序分析和基因芯片技術(shù)將分子育種帶入了全基因組選擇育種階段。全基因組選擇（genomic selection，GS）是指通過對(duì)覆蓋全基因組范圍的遺傳標(biāo)記進(jìn)行檢測(cè)，利用獲取的遺傳信息從基因組水平出發(fā)對(duì)家畜個(gè)體不同性狀進(jìn)行育種值估計(jì)（genomic breeding values，GEBV）和選擇[14]。利用全基因組選擇確定的數(shù)量性狀基因座（quantitative trait loci，QTL）能夠更為準(zhǔn)確地估計(jì)個(gè)體育種值，進(jìn)而極大地促進(jìn)育種工作并降低成本[15]。

2 分子育種的特點(diǎn)及優(yōu)勢(shì)

1974 年，第一代分子標(biāo)記RFLP 的提出，標(biāo)志著對(duì)DNA 的研究進(jìn)入了全新的階段，擴(kuò)大了人類疾病、動(dòng)物育種工作的視野[16]，在此之前，動(dòng)物育種依靠傳統(tǒng)的育種方式，通過觀察良好表型的個(gè)體作為種用，依靠不同品種間的雜交實(shí)現(xiàn)了“基因重組”，實(shí)現(xiàn)雜交改良的目的。但是傳統(tǒng)育種方式不可避免地會(huì)出現(xiàn)雜交后產(chǎn)生的后代優(yōu)良性狀不固定，效率不高，成本大等問題，這大大阻礙了家畜的育種工作。隨著分子標(biāo)記概念及技術(shù)的提出和發(fā)展，家畜育種的準(zhǔn)確性和效率都得到了極大的提升。分子標(biāo)記借助其DNA 水平的特點(diǎn)，突破了對(duì)育種目標(biāo)性別、年齡的限制，并且通過對(duì)優(yōu)良性狀候選基因的準(zhǔn)確篩選，避免遇到傳統(tǒng)育種可能出現(xiàn)的問題。傳統(tǒng)育種可能需要大量的樣本、嘗試得到理想的個(gè)體，但分子標(biāo)記技術(shù)的定向選擇可以在家畜育種過程中實(shí)現(xiàn)特定性狀基因快速、高效選育，獲得高產(chǎn)、抗病的家畜品種[17]，這主要體現(xiàn)了分子標(biāo)記的幾個(gè)特點(diǎn)：①分子標(biāo)記的基礎(chǔ)是家畜DNA 多態(tài)性，而這種多態(tài)性在家畜DNA 序列上普遍且大量存在[18]。在家畜DNA 復(fù)制等過程中，多態(tài)性的發(fā)生對(duì)家畜個(gè)體表型產(chǎn)生了不同的影響，而這種變化越多，不同個(gè)體間的差異表現(xiàn)就越大；②動(dòng)物表型受到遺傳因素和環(huán)境因素的共同作用，傳統(tǒng)育種受環(huán)境、個(gè)體年齡和性別等因素影響較大，但是分子標(biāo)記打破了這一限制[19]；③共顯性，由于等位基因的存在，使得基因存在雜合子和純合子的區(qū)別，而分子標(biāo)記可以較為準(zhǔn)確地判斷基因型。

雖然基因芯片最初還是以雜交為核心，依舊存在制作煩瑣，不利于大樣本數(shù)量檢測(cè)，但是隨著分子技術(shù)和基因組學(xué)的發(fā)展，它實(shí)現(xiàn)了可以在同一時(shí)間對(duì)大量的DNA 片段進(jìn)行分析，操作簡(jiǎn)潔且效率高，需要的組成成分少也使得在制作使用期間產(chǎn)生的損耗污染少，這一進(jìn)步極大地提高了基因芯片使用性能。而隨著各國(guó)公司相繼進(jìn)行基因芯片開發(fā)研究，牛上不同密度基因芯片相繼問世，包括由Illumina 開發(fā)的位點(diǎn)數(shù)為50K 的Bovine SNP50 芯片和777K 位點(diǎn)數(shù)的Bovine HD 芯片，Affymetrix 的648KGenome-Wide BOS1 Bovine Array[20]。

基于基因組遺傳信息的全基因組選擇作為目前最新的育種技術(shù)，并非摒棄了之前的育種技術(shù)，相反，更是與表型、系譜和芯片等技術(shù)相結(jié)合，準(zhǔn)確高效地實(shí)現(xiàn)育種值估計(jì)、個(gè)體選擇等目標(biāo)。由于全基因組選擇基于家畜基因組信息可以提前對(duì)具有控制或影響優(yōu)良性狀遺傳信息的個(gè)體進(jìn)行準(zhǔn)確篩選，提高了品種改良的速度；其次，結(jié)合表型和系譜信息，可獲取更準(zhǔn)確地育種值，更全面地定位品種中的優(yōu)秀個(gè)體。全基因組選擇損耗低，效率高，高效、準(zhǔn)確地選擇極大推動(dòng)了育種工作[21]。

3 分子育種在黃牛育種中的應(yīng)用

黃牛養(yǎng)殖是畜牧業(yè)經(jīng)濟(jì)中的重要組成部分，而在整個(gè)黃牛產(chǎn)業(yè)發(fā)展中，育種問題占據(jù)至關(guān)重要的地位。

3.1 肉牛

隨著政策、技術(shù)的發(fā)展和進(jìn)步，我國(guó)肉牛的養(yǎng)殖方式從落后的農(nóng)戶散養(yǎng)逐漸過渡到規(guī)?；?、集約化的大規(guī)模高新技術(shù)養(yǎng)殖方式，分子育種充分發(fā)揮分子生物學(xué)和現(xiàn)代遺傳學(xué)優(yōu)勢(shì)，為大規(guī)模技術(shù)養(yǎng)殖提供強(qiáng)有力的支撐。產(chǎn)仔率作為肉牛繁殖方面的重要性狀，是提高肉牛繁殖性能的重要內(nèi)容。自然條件下，牛雙胎率低，即使母牛能產(chǎn)下雙胎，犢牛成活率也非常低，這對(duì)肉牛養(yǎng)殖造成了極大的限制。雷雪芹等通過PCR-RFLP 標(biāo)記研究發(fā)現(xiàn)FSHR 基因在秦川牛和中國(guó)荷斯坦奶牛中雙胎優(yōu)勢(shì)基因型不同[22]。在肉牛養(yǎng)殖過程中，除了布魯氏桿菌病外，還有一種重要的人畜共患病會(huì)對(duì)產(chǎn)業(yè)、社會(huì)安全造成極大損害——牛結(jié)核病。AFLP 技術(shù)汲取了RFLP 技術(shù)和PCR 技術(shù)的穩(wěn)定、準(zhǔn)確和高效，曾廣泛應(yīng)用于品種鑒定、DNA 指紋圖譜構(gòu)建方面。楊興元等利用AFLP 技術(shù)獲取了具有良好多態(tài)性的西門塔爾牛、延邊牛和南陽(yáng)牛的指紋圖譜，并進(jìn)行比對(duì)后發(fā)現(xiàn)3 個(gè)品種之間存在明顯差異[23]。曹瑞等通過MIRU-VNTR 方法對(duì)30 株新疆地區(qū)的牛分枝桿菌進(jìn)行分型研究，發(fā)現(xiàn)新疆地區(qū)牛分枝桿菌與其他地區(qū)的分枝桿菌多態(tài)性存在差異，這可能作為新疆地區(qū)肉牛養(yǎng)殖過程中檢測(cè)牛結(jié)核病的輔助標(biāo)記之一[24]。

單核苷酸多態(tài)性作為目前分子標(biāo)記研究方面廣泛使用的技術(shù)之一，已為肉牛育種提供了豐富的內(nèi)容，而相關(guān)技術(shù)的進(jìn)步也使得SNP 檢測(cè)豐富多樣。楊穎等利用PCR-SSCP 和DNA 測(cè)序比對(duì)對(duì)南陽(yáng)牛HDAC1基因的多態(tài)位點(diǎn)與經(jīng)濟(jì)性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，結(jié)果表明HDAC1 基因第11 外顯子與3’ UTR 區(qū)域的SNP 與尻長(zhǎng)、十字部高和體高等性狀顯著相關(guān)[25]。有研究通過結(jié)合全基因組關(guān)聯(lián)分析（GWAS）和基因注釋等方法，根據(jù)西門塔爾牛高密度芯片篩選西門塔爾牛SNPs，設(shè)計(jì)構(gòu)建準(zhǔn)確性高、低成本的低密度芯片，解析西門塔爾牛重要經(jīng)濟(jì)性狀遺傳信息，推動(dòng)肉用西門塔爾牛育種工作[26]。全基因組測(cè)序技術(shù)的加入，使DNA 多態(tài)性研究進(jìn)入新的階段。張順進(jìn)等通多對(duì)郟縣紅牛全基因組測(cè)序，并將結(jié)果與參考基因組比對(duì)，獲得涵蓋全基因組內(nèi)容的單核苷酸多態(tài)性（SNP），獲取郟縣紅牛遺傳變異圖譜，為進(jìn)一步挖掘郟縣紅牛經(jīng)濟(jì)性狀重要候選基因提供參考資料[27]。容維中結(jié)合PCR-SSCP 和熒光定量PCR 技術(shù)檢測(cè)早勝牛CAPN1基因和CD36 基因8 個(gè)SNP 位點(diǎn)共22 種基因型，確定了CAPN1 基因和CD36 基因早勝牛優(yōu)勢(shì)基因型[28]。

3.2 奶牛

據(jù)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，2021 年我國(guó)乳制品進(jìn)口量增加18.7%，生鮮乳產(chǎn)量增加7.1%[29]，盡管產(chǎn)量相比于2020 年有所增加，奶牛品種改良培育依舊是我國(guó)奶牛行業(yè)的重要工作，依靠分子標(biāo)記、全基因組選擇、全基因組關(guān)聯(lián)分析等技術(shù)，育種工作者在奶牛產(chǎn)奶性能、繁殖、抗應(yīng)激等方面已取得了重要進(jìn)展。李艷華通過基因組測(cè)序結(jié)合系譜信息、DHI 記錄等發(fā)現(xiàn)DDIT3、RPL23A 等4 個(gè)基因共35 個(gè)SNPs 和3 個(gè)Indels，同時(shí)單標(biāo)記關(guān)聯(lián)分析表明以上標(biāo)記均與產(chǎn)奶性狀顯著相關(guān)[30]。Bohlouli 等注意到乳脂肪酸含量與奶牛對(duì)氣候變化適應(yīng)相關(guān)，利用全基因組關(guān)聯(lián)分析，結(jié)合SNP 標(biāo)記、系譜和基因組信息，鑒定出與奶牛抗病相關(guān)基因，并且發(fā)現(xiàn)乳脂肪酸生成與奶牛熱應(yīng)激遺傳機(jī)制有重要相關(guān)性[31]。王夢(mèng)琦等對(duì)奶牛LF 基因的兩個(gè)多態(tài)位點(diǎn)檢測(cè)，并利用多因素方差分析法等方法進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)兩個(gè)位點(diǎn)分別于體細(xì)胞評(píng)分（somatic cell score，SCS）、乳脂率和日產(chǎn)奶量相關(guān)[32]。Bo Han 等通過RNA 測(cè)序分析，以及GO 和KEGG 富集分析發(fā)現(xiàn)LPIN1 基因與奶牛產(chǎn)奶性狀相關(guān)，存在7 個(gè)SNP位點(diǎn)，關(guān)聯(lián)分析結(jié)果表明與乳脂率、乳蛋白率等性狀相關(guān)[33]。Penagaricano 利用全基因組關(guān)聯(lián)分析了1755頭公牛的公畜受孕率和牛基因組涵蓋的38650 個(gè)單核苷酸多態(tài)性（SNP），使用混合線性模型關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)存在8 個(gè)SNP 與公畜受孕率顯著相關(guān)，其中有SNP 處于雄性繁殖性能相關(guān)基因附近，包括精子頂體反應(yīng)、精子發(fā)生過程中的染色質(zhì)重塑以及男性生殖細(xì)胞成熟過程中的減數(shù)分裂過程[34]。其中一些SNP 表現(xiàn)出顯著的優(yōu)勢(shì)效應(yīng)，這為提高奶牛繁殖性能提供了更多參考。除了以上研究，不育是奶牛淘汰和經(jīng)濟(jì)損失的主要原因。信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子（STAT）蛋白是在生育力和早期胚胎發(fā)育以及許多其他功能中發(fā)揮重要作用的轉(zhuǎn)錄因子，STAT1 和STAT3 基因是該途徑的成員。Khatib 等根據(jù)第7 天的囊胚數(shù)量計(jì)算胚胎早期成活率，利用單SNP 分析發(fā)現(xiàn)STAT3 基因存在兩個(gè)SNP 為SNP 25402 和SNP（SNP19069/SNP254 02）與卵母細(xì)胞受精率相關(guān)，其次，兩個(gè)SNP 位點(diǎn)之間存在相互作用，對(duì)胚胎存活率有顯著影響[35]。

4 小結(jié)

我國(guó)具有豐富的黃牛種質(zhì)資源，并且具有多種品種優(yōu)勢(shì)，具有豐富的遺傳多樣性、較強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)能力和抗病性、肉品質(zhì)好、風(fēng)味佳等特點(diǎn)。長(zhǎng)期以來，通過引進(jìn)國(guó)外優(yōu)秀肉牛品種與我國(guó)本地黃牛品種雜交，選育出了不同用途（肉用、乳用）的品種。但是我國(guó)牛肉市場(chǎng)需求巨大，雜交管理體系不健全，部分品種雜交較為盲目和混亂，使得我國(guó)本土黃牛資源受到了威脅，牛肉供應(yīng)嚴(yán)重不足，導(dǎo)致我國(guó)牛肉非常依賴進(jìn)口。分子標(biāo)記具有準(zhǔn)確、高效選育的優(yōu)點(diǎn)，在此基礎(chǔ)上基因芯片在選擇范圍和效率上具有更好的表現(xiàn)，基于基因組學(xué)的全基因組選擇更是作為目前最新的育種技術(shù)將育種精確度和品種改良速度提高到了新的水平。分子育種是提高我國(guó)黃牛品種生長(zhǎng)、生產(chǎn)和繁殖性能的重要手段，通過將分子育種技術(shù)與其他飼養(yǎng)管理技術(shù)相結(jié)合“保持本土品種獨(dú)有的特性，改善固有的缺陷”，揚(yáng)長(zhǎng)補(bǔ)短，是目前我國(guó)黃牛育種，乃至農(nóng)業(yè)反芻動(dòng)物種質(zhì)資源工作的重要內(nèi)容。