康玉軍，康鵬天，陳桂花，何晶晶，劉 哲，施澤強(qiáng)

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅省漁業(yè)技術(shù)推廣總站，甘肅 蘭州 730030；3.敦煌市金博特種水產(chǎn)養(yǎng)殖有限公司，甘肅 敦煌 736203）

虹鱒是聯(lián)合國糧農(nóng)組織向全球推薦的優(yōu)良魚類養(yǎng)殖品種之一。因其骨少肉厚，含肉率高，無肌間刺，肌肉中富含不飽和脂肪酸，深受人們的喜愛[1]。然而，虹鱒對水質(zhì)要求高、應(yīng)激性強(qiáng)，在其活魚運輸過程中往往因運輸脅迫導(dǎo)致魚體受傷死亡，影響鮮度[2-3]。

合理使用化學(xué)麻醉劑能夠降低魚體新陳代謝，減少對魚體的傷害，從而提高運輸存活率，降低運輸成本，達(dá)到安全有效運輸?shù)哪康腫2]。MS-222（3-氨基苯甲酸乙酯甲基磺酸鹽），是目前廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)動物中的麻醉劑，因其具有易處理、效力迅速等優(yōu)點，已獲得美國食品及藥物管理局（FDA）批準(zhǔn)認(rèn)證[4]。但由于MS-222的漁用藥理學(xué)研究滯后，缺乏相關(guān)研究資料，所以其在水產(chǎn)業(yè)中的應(yīng)用存在較大的盲目性，誤用、濫用現(xiàn)象極為普遍，從而使藥物使用效果難以保證；更為甚者，藥物殘留導(dǎo)致水產(chǎn)食品安全問題[5]。

當(dāng)前，水產(chǎn)品藥物殘留和食品安全問題日益引起全世界的廣泛關(guān)注，往往形成我國水產(chǎn)品出口創(chuàng)匯過程中的綠色貿(mào)易壁壘，對國內(nèi)水產(chǎn)食品安全保障也造成巨大阻力[6]。鑒于MS-222在水產(chǎn)品中的應(yīng)用越來越廣泛，因此，虹鱒養(yǎng)殖生產(chǎn)實踐中，必須嚴(yán)格執(zhí)行MS-222休藥期，要科學(xué)用藥，提高虹鱒商品魚的產(chǎn)品質(zhì)量，從而提高經(jīng)濟(jì)效益和產(chǎn)品競爭力。這些工作的前提是建立MS-222在動物體內(nèi)殘留檢測的標(biāo)準(zhǔn)方法，從而形成完備的藥效學(xué)、藥代動力學(xué)資料。

目前，國內(nèi)外對MS-222在水產(chǎn)動物體內(nèi)殘留檢測方法均有研究[5,7-9]，但尚沒有虹鱒體內(nèi)MS-222殘留檢測方法。因此，盡快建立MS-222的代謝和殘留檢測方法非常必要。

本文研究了虹鱒肌肉組織中MS-222殘留檢測的高效液相色譜-紫外（HPLC-UV）檢測方法，旨在建立更加簡便、快速、靈敏和實用的檢測方法，為進(jìn)一步研究MS-222在虹鱒體內(nèi)的殘留及其代謝規(guī)律提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 儀器

福立FL2200高效液相色譜儀，浙江福立分析儀器有限公司。CP214型電子分析天平，奧豪斯儀器（上海）有限公司；TGL-16M高速冷凍離心機(jī)，長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司。XH-B型旋渦混合器，江蘇康健醫(yī)療用品有限公司。YQ-3型組織勻漿機(jī)，常州國華電器有限公司。KQ5200E型超聲波洗滌儀，昆山市超聲儀器有限公司。RE-52C型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，金壇醫(yī)療儀器廠。SHB-III型臺式循環(huán)水多用真空泵，鄭州長城科工貿(mào)有限公司。Eppendorf微量可調(diào)移液器，德國EPPENDORF公司。Alumina-B堿性氧化鋁固相萃取柱（規(guī)格：500 mg/3 ml），上海歇陽生物科技有限公司。

1.2 試劑

對照品：MS-222（含量＞99.5%），Sigma公司。水：水為符合GB/T 6682規(guī)定的二級水；甲醇、乙腈、乙酸為色譜純，正己烷、正丙醇、無水硫酸鈉為分析純，天津市富宇精細(xì)化工有限公司。

1.3 溶液配制

1.3.1 MS-222標(biāo)準(zhǔn)液配制 準(zhǔn)確稱取MS-222標(biāo)準(zhǔn)品0.10 g置于100 ml容量瓶中，用甲醇溶解并定容，在旋渦混合器上混勻5 min，制成質(zhì)量濃度為1.0 mg/ml MS-222標(biāo)準(zhǔn)儲備液。

1.3.2 Mcllvaine緩沖液配制 Mcllvaine緩沖液由563 ml的0.1 mol/L檸檬酸溶液和437 ml的0.2 mol/L的磷酸氫二鈉溶液混合所制。用分析天平稱取21.014 g檸檬酸于燒杯中并加水溶解，定容至1 000 ml制得0.1 mol/L檸檬酸溶液；稱取35.814 g磷酸氫二鈉于燒杯中并加水溶解，定容至500 ml制得0.2 mol/L的磷酸氫二鈉溶液。

1.4 樣品采集及處理

1.4.1 樣品采集 沿著虹鱒背脊取肌肉，去皮后用組織搗碎勻漿機(jī)打成肉糜，冷凍備用。

1.4.2 樣品處理 稱取2.0 g均質(zhì)后的虹鱒肌肉組織置于50 ml具塞離心管中，加入20 ml體積比為1∶1的Mcllvaine緩沖液（pH=4.4）與甲醇的混合提取液，渦旋震蕩5 min使之充分混合。在30 ℃條件下，超聲提取20 min后，以3 000 r/min的速度離心8 min，離心后移取上清液至玻璃試管中（重復(fù)2次）。隨后向50 ml離心管中再加入20 ml體積比1∶1的Mcllvaine緩沖液（pH=4.4）與甲醇的混合提取液，重復(fù)提取1次，合并兩次提取的上清液。將兩次的上清液在50 ℃水浴下旋轉(zhuǎn)減壓蒸發(fā)至近干，蒸干后加入10 mlMcllvaine緩沖液（pH=4.4）將殘渣溶解，溶解液經(jīng)化學(xué)分析定性濾紙過濾后過C18固相萃取柱進(jìn)行純化。萃取柱分別先后以3 ml甲醇和3 ml Mcllvaine緩沖液（pH=4.4）進(jìn)行激活，將過濾后的殘渣溶解液轉(zhuǎn)移到其中，然后用2 ml 7.5%的甲醇溶液淋洗，抽至近干后，用2 ml甲醇和1%乙酸溶液的混合液（體積比為1∶1）進(jìn)行洗脫。洗脫液收集5 ml于離心管中，過0.45 μm微孔濾膜后用甲醇與1%乙酸的混合溶液定容到2 ml容量瓶中，待測。

1.5 色譜條件

安捷倫C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；進(jìn)樣量：50 μl；流動相：甲醇∶水∶乙酸=6 5 ∶3 5 ∶1（等梯度洗脫）；流動相速度：0.6 ml/min；柱溫：35 ℃；檢測波長：223 nm（紫外線檢測）。

1.6 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線

用甲醇將MS-222標(biāo)準(zhǔn)儲備液稀釋，分別在空白肌肉樣品中按25 μg/kg、50 μg/kg、100 μg/kg、200 μg/kg、400 μg/kg、800 μg/kg進(jìn)行添加，按照1.4、1.5步驟測定，記錄峰面積，以MS-222色譜圖峰面積為縱坐標(biāo)、MS-222濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.7 方法學(xué)考察

1.7.1 靈敏度 將逐步稀釋的MS-222對照品加入空白樣品后上機(jī)測定，以信噪比（S/N）=3時的樣品濃度為最低檢測限。

1.7.2 精密度 標(biāo)準(zhǔn)儲備液重復(fù)上機(jī)測定6次，計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD。

1.7.3 回收率和變異系數(shù) 取空白虹鱒肌肉樣品6份，分別準(zhǔn)確加入不同濃度的MS-222，之后按上文樣品處理方法和色譜條件進(jìn)行測定，計算加標(biāo)回收率和變異系數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜圖

按1.5步驟對MS-222標(biāo)準(zhǔn)品和加標(biāo)后的空白虹鱒肌肉樣品進(jìn)行分析，結(jié)果見圖1。由圖1可知，MS-222的HPLC出峰時間為6.1 min左右，目標(biāo)峰分離良好、峰形尖銳、對稱，靈敏度高。

2.2 線性范圍和靈敏度

在每個空白肌肉樣品中分別添加25 μg/kg、50 μg/kg、100 μg/kg、200 μg/kg、400 μg/kg、800 μg/kg的MS-222，每個濃度設(shè)置3個重復(fù)。本研究中MS-222的線性范圍為25～800 μg/kg。在此線性范圍內(nèi)，y=3.12×104x，相關(guān)系數(shù)為0.999 8，線性關(guān)系良好，定量的準(zhǔn)確性高。將MS-222對照品準(zhǔn)確加入空白樣品后上機(jī)測定，依據(jù)信噪比（S/N）測得檢測限為20 μg/kg。

2.3 精密度

虹鱒肌肉組織中添加不同濃度MS-222的HPLC-UV檢測方法精密度見表1。由表1可知，本研究的方法精密度在2.63%～4.74%之間，說明樣品前處理方法得當(dāng)，樣品質(zhì)量較為穩(wěn)定。

2.4 回收率與變異系數(shù)

虹鱒肌肉組織中添加不同濃度MS-222的回收率和變異系數(shù)見表2。結(jié)果顯示：所有加標(biāo)濃度組的MS-222回收率均＞88%，批內(nèi)變異系數(shù)＜1.2%，批間變異系數(shù)均＜5%。結(jié)果表明該方法的重復(fù)性和重現(xiàn)性好。

3 討論

圖1 MS-222標(biāo)準(zhǔn)品（A）和空白虹鱒肌肉加標(biāo)（B）的HPLC-UV色譜圖

表1 虹鱒肌肉組織中添加MS-222檢測方法的精密度

表2 虹鱒肌肉組織中添加MS-222的檢測回收率和變異系數(shù)

MS-222為白色晶狀粉末，其水溶性好，是美國FDA批準(zhǔn)的唯一可用于水產(chǎn)品的漁用麻醉劑。MS-222具有良好的鎮(zhèn)靜安定作用，在活魚麻醉運輸中可提高魚體的存活率以及上市鮮度[10]。隨著人們物質(zhì)生活水平的不斷提高，其對動物源性食品的品質(zhì)和食品安全問題也越來越關(guān)注。然而，對于處在商品流通環(huán)節(jié)的漁用麻醉劑的規(guī)范使用和藥物殘留問題，目前關(guān)注度尚有不足。MS-222的使用劑量往往取決于水產(chǎn)動物的種類、年齡、規(guī)格以及水體溫度等諸多因素，一般介于25～100 mg/L[11-12]。而生產(chǎn)實踐中，銷售商往往僅憑借經(jīng)驗掌握MS-222的用量。此外，有研究顯示MS-222主要蓄積于魚體的肝臟和脾臟等部位，在肌肉中的殘留量較低，但美國FDA依舊規(guī)定MS-222應(yīng)用于養(yǎng)殖魚類，需有21 d的休藥期[12]。目前我國尚未建立有關(guān)MS-222的規(guī)范使用和殘留限量標(biāo)準(zhǔn)，很多商家出于短期利益考量，并未對相關(guān)的商品魚進(jìn)行休藥暫養(yǎng)，可能存在麻醉劑殘留的食品安全風(fēng)險[5]。因此，盡快建立基于MS-222的代謝和殘留檢測方法的漁用麻醉劑使用和限量標(biāo)準(zhǔn)迫在眉睫。

MS-222是一種極性化合物，依據(jù)相似相溶原理，一般多選用極性較強(qiáng)的提取液，如極性有機(jī)溶劑、緩沖溶液/水與有機(jī)溶劑的混合溶液等。常見的MS-222提取液有水、甲醇∶水（1∶1）、乙腈∶水（1∶1）、乙酸-乙酸鈉緩沖液等[13]。本研究參考已有文獻(xiàn)報道，選用Mcllvaine緩沖液（pH=4.4）與甲醇的混合提取液。為了提高M(jìn)S-222的回收率，采用勻漿和超聲波處理相結(jié)合的方法，且虹鱒肌肉組織勻漿后超聲提取兩次。

虹鱒作為典型的冷水性魚類，肌肉成分復(fù)雜，富含油脂[14]。這對于用于HPLC分析的肌肉組織樣品制備造成了一定程度的不利影響，如果樣品處理不當(dāng)，易產(chǎn)生過多雜質(zhì)峰，掩蔽目標(biāo)峰。因此，樣品前處理中的純化步驟尤為重要。在預(yù)試驗階段，本研究對比了C18、C8、苯基、氰基等固相萃取柱的樣品純化效果，最終采用C18萃取柱用進(jìn)行樣品純化。

本研究中的HPLC分析采用的是C18柱分離，餾分使用223 nm波長的紫外線進(jìn)行檢測，最終計算得到檢測限為20 μg/kg。結(jié)合文獻(xiàn)報道[5,15]，紫外檢測器對于低濃度樣品，存在基質(zhì)對定性、定量結(jié)果影響大的問題，方法的靈敏度尚有提升空間。關(guān)于色譜分析過程中的柱溫，預(yù)實驗階段分別在35 ℃和50 ℃下對MS-222對照品溶液進(jìn)行HPLC-UV檢測，結(jié)果顯示35 ℃時目標(biāo)峰的峰型較50 ℃時尖銳，考察保留時間、目標(biāo)峰與雜質(zhì)峰的分離程度等方面，兩個溫度點無顯著差異。考慮節(jié)能、色譜柱壽命等因素，本研究中選35 ℃作為液相色譜儀的檢測溫度。參考Scherpenisse[7]、朱敏[10]和黎智廣[15]等的研究，本研究中先后采用甲醇∶水∶乙酸=65∶35∶1（流動相1）、0.5%甲酸∶乙腈=60∶40（流動相2）、甲醇∶1%乙酸=75∶25（流動相3）和三種流動相對50.0 μg/ml的MS-222標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)行了等梯度洗脫。實驗結(jié)果顯示，使用流動相1洗脫所得峰形相對較好，基線平且低，目標(biāo)峰出峰時間在6.1～6.9 min之間，且在此時間內(nèi)基本無雜質(zhì)峰。與已有相關(guān)報道的研究結(jié)果相比[16-17]，該流動相在一定程度上縮短了目標(biāo)峰的保留時間，且檢測加標(biāo)樣品時目標(biāo)峰分離更好。因而，將甲醇∶水∶乙酸=65∶35∶1的洗脫方式作為最終流動相洗脫梯度。

4 結(jié)論

MS-222在虹鱒肌肉中的HPLC-UV殘留檢測方法具有操作便捷、提取率高、重復(fù)性和重現(xiàn)性好等優(yōu)點，具備良好的檢測特異性和精密度，加標(biāo)回收率＞88%，批內(nèi)變異系數(shù)＜1.2%，批間變異系數(shù)均＜5%，方法的重復(fù)性和重現(xiàn)性好，滿足一般MS-222殘留分析的需要，可為進(jìn)一步研究MS-222在虹鱒體內(nèi)的殘留及其代謝規(guī)律提供技術(shù)支持。