鐘曉勇，李 成，王 芳，陳 斌，梁 暉，阮 甦

福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬人民醫(yī)院，福建 福州 350004

腦卒中是目前國(guó)內(nèi)外引起死亡的首要因素［1］。卒中后往往會(huì)引發(fā)持續(xù)性的神經(jīng)功能障礙，已經(jīng)成為影響國(guó)人健康和生活質(zhì)量的重要疾病，也為社會(huì)造成巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。然而，目前卒中的臨床治療手段仍非常有限［2］。針刺是臨床治療缺血性卒中的有效補(bǔ)充手段，在急性期、恢復(fù)期、后遺癥及康復(fù)期均有顯著效果［3-4］。本課題前期研究表明，電針百會(huì)、神庭具有抗凋亡、抗氧化、促進(jìn)生存因子表達(dá)等生物學(xué)作用，可以多通路、多靶點(diǎn)改善腦卒中模型大鼠的神經(jīng)功能及認(rèn)知功能障礙［5-9］，但其具體作用機(jī)制仍需進(jìn)一步闡明。

近期線粒體自噬在缺血性卒中后的神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制受到越來(lái)越多關(guān)注。線粒體自噬作為一種選擇性自噬，在清除受損線粒體、保護(hù)受損神經(jīng)細(xì)胞方面起著重要的作用。研究表明，腦缺血再灌注過(guò)程可激活線粒體自噬，清除損傷的線粒體，進(jìn)而減少線粒體依賴(lài)的細(xì)胞凋亡［10-11］。此外，通過(guò)進(jìn)一步促進(jìn)線粒體自噬可減輕缺血引起的神經(jīng)損傷［12］，被認(rèn)為是治療缺血性卒中的新靶點(diǎn)。近期WU 等［13］研究表明，逆轉(zhuǎn)BNIP3L 降解促進(jìn)線粒體自噬在缺血性腦損傷中發(fā)揮著重要的神經(jīng)保護(hù)作用。已有研究表明電針可通過(guò)調(diào)節(jié)自噬對(duì)腦缺血再灌注大鼠產(chǎn)生神經(jīng)保護(hù)作用［14-16］，但目前尚未有線粒體自噬相關(guān)的作用機(jī)制研究。因此，本研究擬從電針調(diào)控BNIP3L 介導(dǎo)的線粒體自噬、減輕腦缺血再灌注損傷和細(xì)胞凋亡為研究切入點(diǎn)，為電針改善卒中后神經(jīng)功能障礙的作用機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及分組造模

1.1.1 動(dòng)物 選擇SPF 級(jí)雄性sprague-dawley（SD）大鼠60 只，體質(zhì)量（300±20）g，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物責(zé)任有限公司提供［生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（滬）2017-0005］，恒溫恒濕，12 h 明暗光照交替，晝夜循環(huán)，飼養(yǎng)于福建中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。福建中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心動(dòng)物飼養(yǎng)環(huán)境許可證：SYXK（閩）2019-0007。

1.1.2 分組與造模 采用隨機(jī)數(shù)字表法將60 只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組15只和手術(shù)組45只。所有大鼠術(shù)前禁食12 h 后，采用線栓法制備大鼠大腦中動(dòng)脈線栓阻塞法（middle cerebral artery occlusion，MCAO）模型。具體方法參考Zea Longa 方法［17］：應(yīng)用10%水合氯醛按0.35 g/kg 腹腔注射麻醉大鼠，麻醉后固定于定位儀上，切開(kāi)右側(cè)頸部皮膚，分離并在根部結(jié)扎頸外動(dòng)脈，從右側(cè)頸總動(dòng)脈分叉下方約3～4 mm處剪一“V”形小口，將3 cm尼龍線插入，當(dāng)有阻力時(shí)停止插入，此時(shí)尼龍線進(jìn)入頸內(nèi)動(dòng)脈約為18 mm，待缺血90 min 后拔出線栓再灌注，固定尼龍線并縫合皮膚。成功后2 h采用Zea Longa法［17］進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評(píng)分。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：0 分，無(wú)神經(jīng)損傷癥狀；1 分，不能完全伸展對(duì)側(cè)前爪；2 分，外側(cè)（右）轉(zhuǎn)圈；3 分，向?qū)?cè)傾倒；4 分，不能自發(fā)行走，意識(shí)喪失，分值越高，損傷越嚴(yán)重。將1～3 分的大鼠納入正式實(shí)驗(yàn)，0 分和4 分均認(rèn)為模型不成功。假手術(shù)組將正常SD大鼠，麻醉后固定于定位儀上，切開(kāi)右側(cè)頸部皮膚，只分離、暴露血管，不結(jié)扎，不插入尼龍線，縫合皮膚。手術(shù)組造模成功率約為70%，本次實(shí)驗(yàn)共30 只大鼠造模成功，考慮均衡原則，進(jìn)一步將造模成功手術(shù)組大鼠隨機(jī)分為模型組、電針組和電針＋3-MA 組，每組10 只。動(dòng)物處理方法按照中華人民共和國(guó)科技部頒發(fā)的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見(jiàn)》執(zhí)行，并經(jīng)福建中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審定。

1.2 主要器材和試劑

LC3B、BNIP3L、SQSTM1、β-actin抗體（美國(guó)Cell Signaling Technology 公司）；TUNEL 試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；三甲基腺嘌呤（3-MA）（美國(guó)Sigma 公司），Pannoramic 掃描儀（匈牙利，3Dhistech）；華佗牌電針儀（SDZ-Ⅱ，蘇州醫(yī)療用品廠有限公司）；Gel DOC 2000 凝膠成像系統(tǒng)、APC 300電泳儀、水平電泳槽（美國(guó)BioRad公司）。

1.3 干預(yù)方法

①假手術(shù)組：飼養(yǎng)于普通籠中，只同等條件抓取，無(wú)電針刺激。②模型組：造模后飼養(yǎng)于普通籠，只同等條件抓取，無(wú)電針刺激。③電針組：電針大鼠百會(huì)、神庭，參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》［18］及華興邦制定的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物穴位圖譜［19］。用華佗牌0.3 mm×13 mm毫針，30°斜刺入0.2 cm，隨后用華佗牌電針儀（SDZ-Ⅱ）通電干預(yù)。設(shè)置波形模式為疏密波，其中疏波4 Hz，密波20 Hz，輸出電壓2 V，輸出電流0.5 mA，以針體輕輕抖動(dòng)為判斷電針得氣標(biāo)準(zhǔn)。電針干預(yù)于造模后24 h開(kāi)始，每次治療時(shí)間為20 min，每天同一時(shí)間治療1 次，連續(xù)7 d。④電針＋3-MA組：在復(fù)灌注開(kāi)始時(shí)，大鼠側(cè)腦室注射7.5 μg 3-MA，3-MA 在生理鹽水中加熱藥液至60～70 ℃充分溶解，降至常溫后注射（參考WEN 等［20］的方法），連續(xù)7 d。電針干預(yù)方法及治療參數(shù)同電針組。

1.4 取材及指標(biāo)檢測(cè)

1.4.1 取材 干預(yù)7 d 后取材，各組大鼠在1%戊巴比妥的麻醉下行開(kāi)顱，大腦組織取出后迅速置于-80 ℃冰箱保存或固定后制成石蠟標(biāo)本保存，用于后續(xù)指標(biāo)檢測(cè)。

1.4.2 神經(jīng)功能評(píng)分 造模后第1天、第3天、第5天、第7 天再次采用Zea Longa 法進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分（具體步驟詳見(jiàn)上述），評(píng)估神經(jīng)功能改善情況。

1.4.3 HE 染色 取各組大鼠梗死區(qū)域腦組織及梗死側(cè)海馬組織固定于10%福爾馬林中4～6 h，石蠟包埋，連續(xù)切片，厚4 μm，常規(guī)蘇木素伊紅（HE）染色，光鏡下觀察各組病理形態(tài)學(xué)改變。

1.4.4 Western blot 檢測(cè)LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白表達(dá)水平 取50 μg 左側(cè)大腦皮質(zhì)區(qū)腦組織，加入RIPA裂解液超聲下充分裂解后，采用Bradford 法蛋白質(zhì)定量，用15%聚丙烯酰胺凝膠電泳，考馬斯亮藍(lán)染色標(biāo)記蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)，然后轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，于封閉液中進(jìn)行封閉，經(jīng)封閉洗滌后加入相應(yīng)的單抗，4 ℃過(guò)夜孵育，洗滌，然后分別與生物素標(biāo)記的IgG、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉素卵白素工作液（S-A/HRP）常溫孵育，DAB 顯色液顯色，蒸餾水清洗終止反應(yīng)，圖像掃描。目的蛋白的表達(dá)量用內(nèi)參校正后的各組蛋白的灰度值與假手術(shù)組蛋白的灰度值比較。

1.4.5 組織免疫熒光檢測(cè) 將石蠟組織切片后，脫蠟，梯度脫水，滴加封閉血清，在濕盒中37 ℃封閉30 min。滴加第1 種一抗（BNIP3L）置濕盒中4 ℃孵育過(guò)夜，再用PBS 3 min×5次洗去一抗，用濾紙擦去標(biāo)本外的PBS。滴加對(duì)應(yīng)的HRP 標(biāo)記二抗室溫置濕盒中避光孵育1 h，PBS 3 min×3 次洗去二抗，再加入CY3-TSA 孵育10 min。微波抗原修復(fù)后加入第2種一抗（SQSTM1），按上述步驟加入HRP和FICTTSA。最后滴加DAPI 避光孵育2 min 復(fù)染細(xì)胞核。用PBS 1 min×3次洗去DAPI，用濾紙擦去標(biāo)本外的PBS。最后用含甘油封片，并在熒光顯微鏡下立即觀察。

1.4.6 電針對(duì)各組大鼠凋亡率的影響 將石蠟包埋的腦組織切片后，按常規(guī)方法進(jìn)行脫蠟及水化，PBS漂洗2 次，加入蛋白酶K 工作液，37 ℃孵育30 min，隨后依次加入TdT 酶反應(yīng)液、HRP 工作液、DAB 工作液進(jìn)行標(biāo)記和顯色反應(yīng)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 25.0 統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)。計(jì)量資料符合正態(tài)分布的以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析檢驗(yàn)，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。方差不齊的情況下用Tamhane'sT2方法進(jìn)行事后檢驗(yàn)。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 電針對(duì)MCAO模型大鼠的神經(jīng)功能改善作用

造模2 h 后Zea Longa 法進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評(píng)分。圖1 可見(jiàn)造模2 h 后手術(shù)組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分均顯著升高，評(píng)分均在1～3 分之間，提示手術(shù)造模成功。假手術(shù)組大鼠未表現(xiàn)出神經(jīng)功能缺損癥狀，評(píng)分均為0。造模干預(yù)后第1 天、第3 天、第5 天、第7 天再次進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分。在第7 天模型組及電針＋3-MA 組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分仍顯著升高，與假手術(shù)組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。而電針組大鼠在電針干預(yù)后神經(jīng)功能評(píng)分顯著降低，與模型組及電針＋3-MA 組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖1 4組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分比較Figure 1 Comparison of neurological function scores in four groups

2.2 電針對(duì)MCAO 模型大鼠腦皮質(zhì)區(qū)病理形態(tài)的影響

假手術(shù)組可見(jiàn)神經(jīng)元胞體較大，多角形（多個(gè)突起），核著色淺，胞質(zhì)可見(jiàn)特征性結(jié)構(gòu)尼氏體；模型組神經(jīng)元皺縮，胞質(zhì)結(jié)構(gòu)不清，胞漿嗜依紅染色增強(qiáng)，尼氏體邊聚或消失，核固縮，有的胞體變形縮小，呈三角形，細(xì)胞周?chē)g隙增寬；電針組可以在一定程度上減輕缺血再灌注所致的病理?yè)p傷，而電針＋3-MA組則會(huì)阻斷電針的治療作用。見(jiàn)圖2。

圖2 4組大鼠腦皮質(zhì)區(qū)HE染色結(jié)果（×100）Figure 2 HE staining results of cerebral cortex of rats in four groups(×100)

2.3 電針對(duì)MCAO 模型大鼠皮層組織中自噬水平的影響

我們進(jìn)一步采用LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ檢測(cè)了4 組大鼠皮質(zhì)中自噬激活水平，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ增加代表自噬激活。Western blot 結(jié)果表明，模型組大鼠LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ水平降低，與假手術(shù)組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；電針組的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ水平顯著升高，與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。電針＋3-MA 組中使用自噬抑制劑3-MA 可以逆轉(zhuǎn)電針對(duì)LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白表達(dá)上調(diào)作用，且與電針組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)圖3。

圖3 電針對(duì)MCAO模型大鼠皮層組織中自噬水平的影響Figure 3 Effects of electroacupuncture on autophagy level in cortical tissue of MCAO model rats

2.4 電針對(duì)4 組大鼠皮質(zhì)區(qū)線粒體自噬水平的影響

線粒體自噬相關(guān)蛋白BNIP3L 和SQSTM1 表達(dá)和共定位的結(jié)果表明，模型組中皮質(zhì)梗死區(qū)域線粒體自噬水平缺失，表現(xiàn)為紅色熒光和綠色熒光強(qiáng)度弱；電針干預(yù)可以激活梗死區(qū)域神經(jīng)細(xì)胞的線粒體自噬，表現(xiàn)為紅色熒光和綠色熒光的表達(dá)增高及共定位增強(qiáng)（橘黃色）；應(yīng)用3-MA 抑制劑干預(yù)后，電針干預(yù)對(duì)上述線粒體自噬激活的作用被逆轉(zhuǎn)。見(jiàn)圖4。

圖4 電針對(duì)MCAO 模型大鼠皮層組織中線粒體自噬水平的影響（×400）Figure 4 Effects of electroacupuncture on mitophagy level in cortical tissue of MCAO model rats(×400)

2.5 電針對(duì)4組大鼠皮質(zhì)區(qū)細(xì)胞凋亡率的影響

采用TUNEL 法檢測(cè)了各組大鼠皮質(zhì)中細(xì)胞凋亡水平，模型組大鼠凋亡率升高，與假手術(shù)組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；而電針組的凋亡率降低，與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；電針＋3-MA 組中使用自噬抑制劑3-MA 可以逆轉(zhuǎn)電針降低凋亡水平的作用，且與電針組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)圖5。

圖5 電針對(duì)4組大鼠皮質(zhì)區(qū)細(xì)胞凋亡率的影響（×400）Figure 4 Effect of electroacupuncture on apoptosis index of cortical region of rats in four groups(×400)

3 討 論

腦缺血再灌注損傷是一個(gè)復(fù)雜的病理生理級(jí)聯(lián)反應(yīng)過(guò)程，包括神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)鈣離子超載、脂質(zhì)過(guò)氧化、氧自由基損傷、凋亡基因激活、炎性細(xì)胞因子損害等［21］。線粒體作為細(xì)胞能量代謝的中心，在這些病理反應(yīng)進(jìn)程中起著核心作用。線粒體功能障礙在缺血性腦中風(fēng)中已被證實(shí)是神經(jīng)元死亡的原因之一［22］。研究表明激活線粒體自噬可以及時(shí)清除腦缺血再灌注損傷模型大鼠神經(jīng)細(xì)胞中損傷的線粒體，減少線粒體依賴(lài)的細(xì)胞凋亡［10-11］。因此通過(guò)調(diào)控線粒體自噬對(duì)治療缺血性卒中具有重要的意義。其中BNIP3L 作為一類(lèi)線粒體自噬受體蛋白，在細(xì)胞發(fā)育或病理?xiàng)l件下，可以通過(guò)與自噬泡相關(guān)蛋白LC3 結(jié)合促進(jìn)線粒體自噬，在調(diào)控線粒體自噬中發(fā)揮著重要的作用［23］。研究發(fā)現(xiàn)BNIP3L 基因敲除可以顯著抑制腦缺血再灌注誘導(dǎo)的線粒體自噬，并且加重缺血性腦損傷［11］。近期研究表明，通過(guò)逆轉(zhuǎn)BNIP3L 降解促進(jìn)線粒體自噬在缺血性腦損傷中發(fā)揮著重要的神經(jīng)保護(hù)作用［13］。這些結(jié)果提示通過(guò)調(diào)控BNIP3L 介導(dǎo)的線粒體自噬并且抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡是潛在的腦卒中治療干預(yù)靶點(diǎn)。前期實(shí)驗(yàn)研究已證實(shí)針刺百會(huì)、神庭可以多通路、多靶點(diǎn)減輕MCAO 模型大鼠卒中后腦缺血損傷［9，24］，其機(jī)制可能與減輕線粒體損傷、保護(hù)受損神經(jīng)細(xì)胞相關(guān)［25］。此外有研究表明電針百會(huì)、神庭也可以通過(guò)調(diào)控自噬達(dá)到保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞的功能［26-27］。但目前尚未有從調(diào)控線粒體自噬及細(xì)胞凋亡角度開(kāi)展相關(guān)作用機(jī)制研究。因此，本研究以電針調(diào)控BNIP3L介導(dǎo)的線粒體自噬和凋亡為研究切入點(diǎn)，初步闡明電針減輕腦缺血再灌注損傷以及改善卒中后神經(jīng)功能障礙的作用機(jī)制。

本研究結(jié)果表明，MCAO 模型大鼠7 d后皮層組織中自噬水平較假手術(shù)組顯著降低，表現(xiàn)為L(zhǎng)C3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白水平降低，提示手術(shù)組大鼠MCAO再灌注7 d 后由于皮層神經(jīng)細(xì)胞自噬水平的缺失，導(dǎo)致大鼠清除受損神經(jīng)細(xì)胞的能力下降。這與李建榮等［28］研究相似，該研究表明大鼠MCAO 造模后皮層自噬水平呈動(dòng)態(tài)變化，在7 d 左右自噬水平下降。而電針組電針干預(yù)治療可以在一定程度上激活自噬，表現(xiàn)為電針組的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白表達(dá)水平顯著升高。這提示電針可以通過(guò)激活自噬，提高神經(jīng)細(xì)胞自我清除和保護(hù)能力。徐疏影等［14］研究結(jié)果亦提示電針可以通過(guò)激活自噬產(chǎn)生保護(hù)作用。為進(jìn)一步闡明電針激活自噬保護(hù)受損神經(jīng)細(xì)胞的機(jī)制，本研究觀察了電針百會(huì)、神庭對(duì)一類(lèi)選擇性自噬——線粒體自噬及相關(guān)調(diào)控蛋白BNIP3L表達(dá)的影響。研究結(jié)果表明電針可以提高線粒體自噬相關(guān)蛋白BNIP3L 和SQSTM1 的表達(dá)及共定位，表現(xiàn)為組織免疫熒光檢測(cè)中電針組大鼠皮質(zhì)組織中紅色熒光和綠色熒光的表達(dá)增高及共定位增強(qiáng)（橘黃色）。SQSTM1 是一種重要的選擇性自噬接頭蛋白，也是監(jiān)測(cè)自噬水平的重要自噬標(biāo)志蛋白，其表達(dá)增高和線粒體自噬受體蛋白BNIP3L 共定位增強(qiáng)提示線粒體自噬水平提高。該結(jié)果提示電針激活自噬產(chǎn)生神經(jīng)保護(hù)作用的機(jī)制和其激活線粒體自噬相關(guān)，通過(guò)激活線粒體自噬，清除受損線粒體，進(jìn)而減輕線粒體依賴(lài)的細(xì)胞凋亡，從而達(dá)到改善神經(jīng)功能評(píng)分和病理改變的目的。TUNEL 檢測(cè)結(jié)果、神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分以及病理學(xué)結(jié)果均很好地證實(shí)了這一點(diǎn)。為驗(yàn)證電針對(duì)線粒體自噬的激活作用以及神經(jīng)保護(hù)作用，我們?cè)陔娽槪?-MA 組中使用自噬抑制劑3-MA 進(jìn)行反向驗(yàn)證，結(jié)果表明3-MA 可以逆轉(zhuǎn)上述電針對(duì)線粒體自噬的激活和抗凋亡作用，進(jìn)一步驗(yàn)證了電針的作用靶點(diǎn)。

綜上，本研究表明電針可以通過(guò)調(diào)控BNIP3L介導(dǎo)的線粒體自噬減輕腦缺血再灌注損傷和細(xì)胞凋亡，從而達(dá)到改善神經(jīng)功能預(yù)后的作用。但自噬途徑多樣，電針能否通過(guò)調(diào)控其他自噬相關(guān)通路產(chǎn)生神經(jīng)保護(hù)作用，其具體作用機(jī)制仍需進(jìn)一步闡明。