李冰冰 王嵬 支運(yùn)霞 李發(fā)余 王士雨 程國(guó)良 臧恒昌

人參固本口服液，由人參、地黃、熟地黃、山茱萸、山藥、牡丹皮、澤瀉、茯苓、天冬、麥冬等十味中藥組成，藥性溫和，具有滋陰益氣、固本培元的功效。藥理學(xué)研究未發(fā)現(xiàn)其毒性，具有抗疲勞、耐缺氧提高機(jī)體免疫力、清除自由基和抗脂質(zhì)過(guò)氧化等作用[1,2]，臨床可用于肺腎陰虛氣弱咳嗽、腎病綜合征、中醫(yī)辨證氣陰虛的慢性支氣管炎、慢性腎炎、白細(xì)胞減少癥和輔助治療證屬氣陰虛的肺結(jié)核等[1,3,4]。此方由六味地黃丸加味而成，方中六味地黃丸滋補(bǔ)肝腎、養(yǎng)陰清熱，天冬、麥冬生津增液、潤(rùn)肺止咳，人參大補(bǔ)元?dú)?，諸藥配合，滋陰補(bǔ)氣。同時(shí)，除茯苓外的9種中藥均是可用于保健食品的中藥，人參、山茱萸、茯苓、山藥又為“藥食同源”類(lèi)中藥。《黃帝內(nèi)經(jīng)》中就有了食療對(duì)疾病的去除和預(yù)防作用[5]。因此人參固本口服液對(duì)陰虛氣虛患者均具有補(bǔ)益作用，普通人服用后也具有一定的提高機(jī)體免疫功能的作用。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)作為藥物研究的新模式，對(duì)中藥/復(fù)方物質(zhì)基礎(chǔ)、作用機(jī)制研究的發(fā)展起到了重要的作用[6]。本文通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選出人參固本口服液活性成分、作用靶點(diǎn)，并進(jìn)行聚類(lèi)分析，通過(guò)靶點(diǎn)、通路的分析，預(yù)測(cè)其藥理作用及作用機(jī)制，為人參固本口服液臨床應(yīng)用提供理論參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 從《中國(guó)藥典》(2015年版)查詢(xún)?nèi)藚⒐瘫究诜褐?0味中藥的歸經(jīng)，借助中藥系統(tǒng)藥理分析平臺(tái)(TCMSP，http://tcmspw.com/tcmsp.php)[7]，檢索各中藥的化學(xué)成分；以BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫(kù)[8]和已發(fā)表文獻(xiàn)作為補(bǔ)充。結(jié)合口服生物利用度(OB≥30%)和類(lèi)藥性(DL≥0.18)，收集化學(xué)成分及相應(yīng)靶點(diǎn)，根據(jù)Unitprot數(shù)據(jù)庫(kù)[9](http://www.Unitprot.org/)更正所有靶點(diǎn)的名稱(chēng)，最終建立人參固本口服液的成分庫(kù)和靶點(diǎn)庫(kù)。

1.2 成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)、蛋白互作網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 利用Cytoscape軟件構(gòu)建人參固本口服液的中藥-成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)[10]。將人參固本口服液的靶點(diǎn)信息導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫(kù)，設(shè)定物種為“Homo snpiens”，獲取全部蛋白-蛋白相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)。

1.3 Hub網(wǎng)絡(luò)的提取 通過(guò)Cytoscape軟件中的Tools模塊，NetworkAnalyzer-Network Analysis-Analyze Network進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)分析獲取相關(guān)拓?fù)鋮?shù)，首先選取節(jié)點(diǎn)Degree值的2倍中位數(shù)為篩選標(biāo)準(zhǔn)，其次以Betweenness centrality值、Closeness centrality值和neighborhood connectivity值的中位數(shù)作為篩選依據(jù)，提取出相應(yīng)的Hub網(wǎng)絡(luò)。

1.4 生物通路富集分析 為了進(jìn)一步了解上述篩選出的靶標(biāo)基因的功能，將這些靶點(diǎn)導(dǎo)入Metascape數(shù)據(jù)庫(kù)[11](https://david.ncifcrf.gov/)，進(jìn)行GO(gene ontology)生物學(xué)過(guò)程(Biological Process，BP)、細(xì)胞組成(Cellular Component，CC)、分子功能(Molecular Function，MF)富集分析和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)信號(hào)通路富集分析，并利用R 4.0.2軟件將其結(jié)果可視化。

1.5 分子對(duì)接 從TCMSP或ZINC數(shù)據(jù)庫(kù)[12](http://zinc.docking.org/)獲得Degree值前10成分的mol2格式文件，用Autodock Tool軟件處理后得到pdbqt格式文件。從PDB數(shù)據(jù)庫(kù)[13](https://www.rcsb.org/)下載關(guān)鍵靶蛋白的3D結(jié)構(gòu)，運(yùn)用Pymol軟件處理后得到pdbqt格式文件。用Autodock vina將成分和蛋白對(duì)接[14]。結(jié)合能≤-5.0 kJ/mol作為篩選標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)合能數(shù)值越小，對(duì)接結(jié)果較好[15]。

2 結(jié)果

2.1 人參固本口服液活性成分 檢索人參固本口服液各中藥的化學(xué)成分，并以O(shè)B≥30%、DL≥0.18為篩選條件，最終得到61個(gè)成分。見(jiàn)表1。

表1 人參固本口服液活性成分基本信息(OB前20位)

2.2 中藥-成分-靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò) 人參固本口服液中藥-成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)共包括294個(gè)節(jié)點(diǎn)(10個(gè)中藥節(jié)點(diǎn)、61個(gè)成分節(jié)點(diǎn)、223個(gè)靶點(diǎn)節(jié)點(diǎn))和761條邊，“△”代表中藥，“〇”代表成分，“◇”代表靶點(diǎn)，每條邊則表示中藥成分及成分與靶點(diǎn)相互作用關(guān)系(見(jiàn)圖2)。按照Degree值，排名前10位的成分分別是quercetin(槲皮素)、kaempferol(山奈酚)、7-Methoxy-2-methyl isoflavone(7-甲氧基-2-甲基異黃酮)、β-sitosterol(β-谷甾醇)、stigmasterol(豆甾醇)、fumarine(原阿片堿)、tetrahydroalstonine(四氫雞骨常山堿)、kadsurenone(海風(fēng)藤酮)、hederagenin(常春藤素)、hancinone C(山蒟酮C)。見(jiàn)圖1。

圖1 人參固本口服液中藥-成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

2.3 中藥-歸經(jīng)網(wǎng)絡(luò) 根據(jù)人參固本口服液各味藥的歸經(jīng)信息，構(gòu)建該方的中藥-歸經(jīng)網(wǎng)絡(luò)。圖中黃色“□”節(jié)點(diǎn)代表中藥，綠色“○”節(jié)點(diǎn)表示歸經(jīng)，綠色節(jié)點(diǎn)越大、顏色越深表明所屬歸經(jīng)的中藥數(shù)目越多。網(wǎng)絡(luò)中五臟(腎、肺、心、肝、脾)的Degree值分別為9、5、5、4、3，其中，處方中僅麥冬歸經(jīng)不包含腎經(jīng)。歸經(jīng)分析可見(jiàn)，人參固本口服液組方藥性溫和，對(duì)機(jī)體的整體調(diào)節(jié)大有裨益。見(jiàn)圖2。

圖2 人參固本口服液中藥-歸經(jīng)網(wǎng)絡(luò)

2.4 PPI及Hub網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將223個(gè)人參固本口服液的作用靶點(diǎn)導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫(kù)，用Cytoscape軟件可視化，形成219個(gè)節(jié)點(diǎn)、3 937條邊的靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)；根據(jù)網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)鋵W(xué)性質(zhì)篩選Degree值、Betweenness centrality值、Closeness centrality值較大的節(jié)點(diǎn)進(jìn)行分析，得到含有48個(gè)核心靶點(diǎn)的Hub網(wǎng)絡(luò)。按照Degree值從高到低，Hub網(wǎng)絡(luò)中共有11個(gè)靶點(diǎn)與其他47個(gè)靶點(diǎn)均有相互作用(即Degree值=47)，這些靶點(diǎn)分別為：AKT1、CASP3、CXCL8、EGF、IL6、MAPK1、MMP9、PTGS2、TNF、TP53、VEGFA。見(jiàn)圖3。

圖3 人參固本口服液的PPI網(wǎng)絡(luò)(A)及Hub網(wǎng)絡(luò)(B)

2.5 GO功能分析和KEGG通路分析 通過(guò)Metascape數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行的GO功能富集分析得到GO條目1411個(gè)(P<0.01)，其中BP條目1 347個(gè)，CC條目13個(gè)，MF條目51個(gè)，各類(lèi)別分析中排名前20位的條目(CC 13個(gè))。其中，BP主要涉及免疫調(diào)節(jié)、代謝過(guò)程、細(xì)胞功能調(diào)節(jié)、信號(hào)、應(yīng)激反應(yīng)等生物過(guò)程，CC主要包括膜區(qū)域、膜筏、膜微結(jié)構(gòu)域等，MF主要包括轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、酶結(jié)合、細(xì)胞因子受體結(jié)合等。KEGG通路富集分析篩選得到126條(P<0.01)信號(hào)通路，與癌癥相關(guān)的疾病通路有25條，免疫相關(guān)的疾病通路有12條，心血管及血液系統(tǒng)相關(guān)的疾病通路有14條，與寄生蟲(chóng)、真菌、病毒感染引起的疾病通路有18條，血糖調(diào)節(jié)的通路有9條，信號(hào)通路共38條。選Count值較大的前20條通路進(jìn)行可視化。見(jiàn)圖4、5。

圖4 人參固本口服液作用靶點(diǎn)GO分析

圖5 人參固本口服液核心靶點(diǎn)KEGG富集分析的前20條通路氣泡圖

2.6 分子對(duì)接結(jié)果分析 將人參固本口服液中排序前10的核心成分分別與Hub網(wǎng)絡(luò)中的11個(gè)靶點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接。一般認(rèn)為配體與受體結(jié)合的構(gòu)象穩(wěn)定時(shí)能量越低，發(fā)生的作用可能性越大，結(jié)合能≤-5.0 kJ/mol作為篩選標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)合能≤-20.93 kJ/mol時(shí)則視為成分與靶點(diǎn)有較好的活性，結(jié)合能≤-29.34 kJ/mol時(shí)則結(jié)合活性強(qiáng)烈[15]。分子對(duì)接結(jié)果，圖中“〇”越大、顏色越深，表示成分與靶點(diǎn)的結(jié)合活性越強(qiáng)。所有對(duì)接結(jié)果均≤-20.93 kJ/mol，約60%的對(duì)接結(jié)果≤-29.34 kJ/mol。對(duì)接效果最好的靶點(diǎn)包括：AKT1、PTGS2、CXCL8、TNF、CASP3，對(duì)接效果最好的成分包括：fumarine、tetrahydroalstonine、β-sitosterol、stigmasterol、kaempferol。對(duì)其中的4個(gè)不同類(lèi)型成分進(jìn)行分析：β-sitosterol(甾體)、fumarine(生物堿)、7-Methoxy-2-methyl isoflavone(黃酮)、hancinone C(木脂素)與AKT1(PDB ID：6S9W)的對(duì)接位置與原有配體類(lèi)似，均落入蛋白殘基形成的活性口袋中，結(jié)合能分別為-46.47、-43.54、-41.45和-36.01 kJ/mol。β-sitosterol羥基進(jìn)入AKT1口袋內(nèi)側(cè)，與氨基酸殘基(Ser205和Thr211)形成氫鍵，fumarine與AKT1的氨基酸殘基(Asn54和Asp274)形成氫鍵，與ARG273形成π-cation作用，7-Methoxy-2-methyl isoflavone與AKT1的氨基酸殘基(Trp80)形成π-π堆積，hancinone C與AKT1的氨基酸殘基(Asn53和Arg200)形成氫鍵。見(jiàn)圖6、7。

3 討論

人參固本口服液組方是由六味地黃丸、二黃丸化裁而成。六味地黃丸，腎肝脾三陰并補(bǔ)，以補(bǔ)腎陰為主?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，六味地黃丸具有調(diào)節(jié)免疫、抗腫瘤、降血糖血脂等作用[16]。天冬補(bǔ)脾生水，地黃補(bǔ)腎養(yǎng)陰，人參補(bǔ)脾益氣，三藥并稱(chēng)“三才”，是調(diào)治補(bǔ)益常用的基礎(chǔ)方[17]。二黃丸，出自《壽親養(yǎng)老新書(shū)》[18]，由“三才”加熟地黃、麥冬組成，益氣養(yǎng)陰，使氣血旺盛，多用于治療心肺腎氣陰兩虛，具有延緩衰老的作用[19]。人參固本口服液，藥性溫和，氣陰同補(bǔ)，對(duì)機(jī)體的整體調(diào)節(jié)大有裨益。

圖6 活性成分與AKT1相互作用分析(A：β-sitosterol，B：fumarine，C：7-Methoxy-2-methyl isoflavone，D：hancinone C)

圖7 分子對(duì)接結(jié)果氣泡圖

本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，從人參固本口服液中得到61個(gè)有效成分，包括烯烴類(lèi)、生物堿類(lèi)、黃酮類(lèi)、萜類(lèi)、甾體類(lèi)、木脂素類(lèi)、糖苷類(lèi)等，Degree值最高的5個(gè)成分為槲皮素、山奈酚、7-甲氧基-2-甲基異黃酮、β-谷甾醇、豆甾醇。組方歸經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)，人參固本口服液包含“五臟”歸經(jīng)，以腎經(jīng)為主，體現(xiàn)了補(bǔ)虛的遣方用藥特點(diǎn)[20]。從所有靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)中得到48個(gè)核心靶點(diǎn)的Hub網(wǎng)絡(luò)，Hub網(wǎng)絡(luò)中有11個(gè)靶點(diǎn)的Degree值為47，這些靶點(diǎn)分別為：AKT1、CASP3、CXCL8、EGF、IL6、MAPK1、MMP9、PTGS2、TNF、TP53、VEGFA。對(duì)48核心靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG信號(hào)通路富集分析結(jié)果可知，涉及與癌癥相關(guān)的疾病通路有25條，免疫相關(guān)的疾病通路有12條，心血管及血液系統(tǒng)相關(guān)的疾病通路有14條，與寄生蟲(chóng)、真菌、病毒感染引起的疾病通路有18條，調(diào)節(jié)血糖的通路9條，信號(hào)通路共38條。癌癥相關(guān)的疾病通路包括：胰腺癌、前列腺癌、乳腺癌、膀胱癌、子宮內(nèi)膜癌、結(jié)腸直腸癌、膠質(zhì)瘤、非小細(xì)胞肺癌、黑素瘤、慢性骨髓白血病、小細(xì)胞肺癌、甲狀腺癌、腎臟上皮腎細(xì)胞癌等。

AKT1是癌癥中最頻繁激活的增殖和存活途徑的核心成員[21]，AKT1抑制劑能誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞自噬死亡[22]，活化的AKT1可以抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞周期運(yùn)行及細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移[23]。PTGS2是前列腺素生物合成的一個(gè)重要限速酶，正常組織中幾乎不表達(dá)，在多種惡心腫瘤中高度表達(dá)[24]。CASP3是細(xì)胞凋亡的主要執(zhí)行者，通過(guò)特異性地裂解一系列底物而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。IL-6和TNF參與了慢性病貧血/缺鐵性貧血的發(fā)生發(fā)展[25]。TP53在癌癥治療方面有廣泛的研究[26,27]，參與了多種細(xì)胞死亡通路，且可作為信號(hào)中心評(píng)估神經(jīng)元損傷情況[28]。利用分子對(duì)接技術(shù)對(duì)主要活性成分和核心靶點(diǎn)的相互作用進(jìn)行模擬，發(fā)現(xiàn)人參固本口服液的主要活性成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)均具有強(qiáng)烈的結(jié)合能力，所有對(duì)接結(jié)合能均≤-20.93 kJ/mol，約60%的對(duì)接≤-29.34 kJ/mol。氫鍵、疏水作用、π-cation作用和π-π堆積可能是主要的結(jié)合形式。

人參固本口服液源于中醫(yī)經(jīng)典方，肺腎同補(bǔ)，氣陰同調(diào)，既能治已病，還可治未病?！胺稣瘫尽笔侵嗅t(yī)藥治療腫瘤的重要指導(dǎo)思想。人參固本口服液不僅能減輕癌癥患者化療過(guò)程中白細(xì)胞減少癥[1]，還能調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力，起到固本培元的作用。通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)和分子對(duì)接技術(shù)，從分子水平闡述了人參固本口服液通過(guò)多成分、多靶點(diǎn)、多通路發(fā)揮功效的整體調(diào)節(jié)，為人參固本口服液的臨床用藥和再開(kāi)發(fā)提供重要理論依據(jù)。