何晴 汪熙來 魯志平* 唐利軍 成杰 鄔旭龍 巫德勝 唐書宇 李建臻 郭英博 羅俊林 陳澤林 楊定勇

（1，成都農(nóng)業(yè)科技職業(yè)學(xué)院 611130；2，四川省大英縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局 629300）

大腸桿菌又名大腸埃希氏菌，屬于人與哺乳動(dòng)物胃腸道細(xì)菌中的一個(gè)共生寄棲菌。在某些特定條件下導(dǎo)致畜禽發(fā)病，并造成較大的經(jīng)濟(jì)損失，同時(shí)，大腸桿菌可隨著人或動(dòng)物的排泄物排出體外而直接污染環(huán)境。大腸桿菌病對(duì)畜禽養(yǎng)殖業(yè)由較嚴(yán)重的危害，主要疾病有豬大腸桿菌病、禽大腸桿菌病、兔大腸桿菌病等。大腸桿菌同時(shí)也是耐藥性基因的傳播載體。許多發(fā)達(dá)國家為了有效控制各種細(xì)菌耐藥性，建立了各種細(xì)菌耐藥性情況監(jiān)測(cè)調(diào)度系統(tǒng)。對(duì)四川山地烏骨雞群糞源大腸桿菌病的耐藥性情況進(jìn)行定期調(diào)查，有利于為四川山地烏骨雞疫病防治和細(xì)菌耐藥性監(jiān)測(cè)提供一個(gè)較為理想的科學(xué)研究模型[1]。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

營養(yǎng)瓊脂、營養(yǎng)肉湯、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、腸桿菌科細(xì)菌生化編碼鑒定管、革蘭氏染液、20 種抗菌藥藥敏紙片及每片的含藥量(單位：μg/片)，分別為青霉素類：青霉素(P，10)、哌拉西林(PIP，100)、羧芐西林(CB，100)、氨芐西林(AM，10)、苯唑西林(OX，1)；氨基糖苷類：慶大霉素(GM，10)、新霉素(N，30)、卡那霉素(K，30)、丁胺卡那(AK，30)；頭孢菌素類：頭孢唑啉(CZ，30)、頭孢呋辛(CXM，30)、頭孢曲松 (CTR，30)、頭孢他啶(CAZ，30)、頭孢哌酮 (CFP，75)、頭孢拉定(RAD，30)、頭孢氨芐(CA，30)；四環(huán)素類：米諾環(huán)素(MI，30)、多西環(huán)素(DX，30)、四環(huán)素(TE，30)；大環(huán)內(nèi)酯類：紅霉素(E，15)；以上材料均購于杭州微生物試劑公司。

1.2 樣品采集

1.2.1 采樣區(qū)域

成都農(nóng)業(yè)科技職業(yè)學(xué)院四川山地烏骨雞養(yǎng)殖場(chǎng)(A 場(chǎng)) 和遂寧市大英縣四個(gè)不同的四川山地烏骨雞養(yǎng)殖場(chǎng)(B、C、D、E 場(chǎng)) 采集樣品。

1.2.2 糞樣收集

采用隨機(jī)取樣法對(duì)每場(chǎng)按四川山地烏骨雞養(yǎng)殖量10%進(jìn)行采樣，并分別編號(hào)后置于10ml 滅菌EP 管中避光冷藏運(yùn)輸，24h 內(nèi)進(jìn)行相關(guān)處理[2]。

1.3 細(xì)菌的分離與純化

將無菌采集的四川山地烏骨雞泄殖腔拭子置于無菌生理鹽水中浸泡10～15min，在滅菌普通營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中加入200μL浸泡液，37℃連續(xù)培養(yǎng)16～18h。用無菌接種環(huán)挑取少量菌液，用稀釋涂布平板法均勻的涂布在麥康凱培養(yǎng)基上，在37℃無菌恒溫箱連續(xù)培養(yǎng)24h，觀察每個(gè)麥康凱培養(yǎng)基上菌落形態(tài)、特征情況[3]。挑取單個(gè)光滑粉紅色菌落再經(jīng)麥康凱培養(yǎng)基進(jìn)行純化處理，用革蘭氏染色液染色、鏡檢，觀察菌落染色形態(tài)及特征，根據(jù)染色鑒定結(jié)果對(duì)分離菌進(jìn)行初步鑒定；將符合大腸桿菌特點(diǎn)的菌落接種于營養(yǎng)瓊脂平板上，37℃下恒溫連續(xù)培養(yǎng)24h 后，置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 細(xì)菌鑒定

用腸桿菌科系列專用細(xì)菌生化編碼微量反應(yīng)鑒定管對(duì)已分離的大腸桿菌疑似物進(jìn)行生化鑒定。將分離的各疑似大腸桿菌細(xì)菌液均勻接種于系列細(xì)菌生化編碼微量反應(yīng)鑒定管，在恒溫箱中37℃進(jìn)行培養(yǎng)，24h 后觀察結(jié)果。對(duì)所有反應(yīng)結(jié)果均進(jìn)行生化編碼，根據(jù)生化編碼反應(yīng)值檢測(cè)搜索腸桿菌屬各科中的細(xì)菌生化順序編碼反應(yīng)表格后即可直接獲得反應(yīng)結(jié)果。對(duì)不確定性的菌種則可進(jìn)行接種補(bǔ)充生化編碼反應(yīng)進(jìn)行鑒定。并將經(jīng)過鑒定后的大腸桿菌科的菌落全部接種到普通肉湯培養(yǎng)基中進(jìn)行富集。

1.5 藥敏試驗(yàn)

采用CLSI 推薦的K-B 法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。取純化后的大腸桿菌菌液，用涂布接種法，將其均勻地涂布于普通瓊脂平板表面，37℃培養(yǎng)18～24h，觀察藥片周圍有無抑菌圈，并用游標(biāo)卡尺測(cè)量藥片的抑菌圈直徑(取平均值)。試驗(yàn)結(jié)果判定：每個(gè)藥片周圍抑菌圈直徑0≥20mm 為高度敏感，抑菌圈直徑15≤d＜20mm 為中度敏感，抑菌圈直徑10≤d＜15mm 為低度敏感，抑菌圈直徑0≤d＜10mm 耐藥。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌分離與鑒定

大腸桿菌病的疑似物在麥康凱平板上的表現(xiàn)形態(tài)為邊緣整齊、表面光滑、濕潤且不透明、微帶粉紅色扁平狀的菌落，見圖1。經(jīng)革蘭氏染色，鏡檢呈現(xiàn)粉紅色、兩端鈍圓、粗短的小桿菌。根據(jù)腸桿菌科細(xì)菌生化鑒定編碼微量鑒定管進(jìn)行細(xì)菌生化編碼鑒定，按生化編碼值檢查搜索腸桿菌科細(xì)菌生化鑒定編碼微量表，表明分離菌株為大腸埃希氏菌。

圖1 分離菌在麥康凱平板上菌落特征

2.2 藥敏試驗(yàn)

（1）用K-B 法對(duì)所鑒定的大腸桿菌菌株進(jìn)行20 種常用抗生素的藥敏聯(lián)合試驗(yàn)，分析結(jié)果表明，A 場(chǎng)糞源大腸桿菌對(duì)20種常用抗菌藥物具有高度敏感占15%，中度敏感占25%，低度敏感占10%；B 場(chǎng)中對(duì)抗菌藥物具有高度敏感占10%，中度敏感占20%，低度敏感占10%；C 場(chǎng)中對(duì)抗菌藥物具有高度敏感占10%，中度敏感占10%，低度敏感占15%；D 場(chǎng)中對(duì)抗菌藥物具有高度敏感占35%，中度敏感占20%，低度敏感占10%；E場(chǎng)中對(duì)抗菌藥物具有高度敏感占5%，中度敏感占5%，低度敏感占15%。

（2）分離的大腸桿菌對(duì)四環(huán)素、多西環(huán)素、氨芐西林、苯唑西林、羧芐西林、頭孢曲松、卡那霉素的耐藥率高達(dá)100.00%；而對(duì)鹽酸頭孢哌酮、頭孢呋辛、頭孢拉定、頭孢唑林、頭孢氨芐、哌拉西林、慶大霉素的耐藥率在20%～80%之間；對(duì)頭孢鹽酸鈉和頭孢他啶、新霉素、丁胺卡那、米諾環(huán)素的耐藥率均在20.00%以下。結(jié)果見附表，圖2。

圖2 糞源大腸桿菌的耐藥結(jié)果

附表 不同養(yǎng)殖場(chǎng)大腸桿菌藥敏結(jié)果統(tǒng)計(jì)表（單位：mm）

（3）試驗(yàn)表明，監(jiān)測(cè)的四川山地烏骨雞養(yǎng)殖場(chǎng)對(duì)多種不同類別抗生素耐藥，并且部分養(yǎng)殖場(chǎng)耐藥菌株呈現(xiàn)多重性耐藥，A、B、D 場(chǎng)對(duì)頭孢菌素類藥物使用規(guī)范，C、E 場(chǎng)對(duì)頭孢菌素類藥物使用不規(guī)范；B、D 場(chǎng)對(duì)氨基糖苷類藥物使用規(guī)范，A、C、E 場(chǎng)的用藥規(guī)范有待提高；A、C、D、E 場(chǎng)對(duì)米諾環(huán)素使用規(guī)范，B 場(chǎng)米諾環(huán)素過度使用；A、C、D 場(chǎng)對(duì)哌拉西林比較有規(guī)范。5 個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)中，A 場(chǎng)和D 場(chǎng)對(duì)抗生素的使用較合理規(guī)范，B 場(chǎng)次之；C 場(chǎng)和E 場(chǎng)對(duì)抗生素的合理使用有待提高。

3 討論

目前，大腸桿菌病再次成為畜禽生產(chǎn)中常見細(xì)菌性疾病之首，發(fā)病率逐年攀升，造成畜禽死亡率居高不下[4]。多個(gè)研究表明，細(xì)菌耐藥性可能從動(dòng)物通過食物鏈、環(huán)境或者動(dòng)物和人的直接接觸而傳播[5]。不同品種動(dòng)物的致病菌對(duì)各種新型抗菌生物治療類藥物敏感性程度可能也會(huì)存在較大差異，在選擇和使用各種新型抗菌藥物對(duì)其進(jìn)行抗菌治療時(shí)，需特別注意不同病原菌耐藥性的定期檢測(cè)。

養(yǎng)雞場(chǎng)一旦發(fā)生大腸桿菌病，首先要進(jìn)行藥物敏感性試驗(yàn)，篩選出兩種及以上對(duì)病原菌敏感的抗菌藥物，選擇幾種比較敏感的抗菌藥物同時(shí)進(jìn)行使用或輪換使用，大大減少單一種藥物的使用持續(xù)時(shí)間，有效實(shí)現(xiàn)在臨床上的合理化和規(guī)范化用藥，有效減緩各種細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性[6]。A 場(chǎng)和D 場(chǎng)在日常用藥過程中一直采用敏感藥物篩選等技術(shù)，對(duì)抗生素的使用較合理規(guī)范，多種抗生素均敏感或較敏感。

調(diào)查發(fā)現(xiàn)，四川山地烏骨雞養(yǎng)殖生產(chǎn)中養(yǎng)殖舍飼養(yǎng)環(huán)境、衛(wèi)生質(zhì)量高，飼養(yǎng)人員、車輛、禽舍、用具的清潔消毒處理頻率高，育雛期飼養(yǎng)密度及保溫措施適當(dāng)，飼料無污染且營養(yǎng)合理全面等，病原菌耐藥性也隨之降低，和本試驗(yàn)結(jié)果高度一致。