雷宇平 圖門巴雅爾 張仲萍 孫杰 寧艷 王錦 張昱 胡明明 王治維 趙凱 王仲兵

（山西省動物疫病預(yù)防控制中心 030027）

非洲豬瘟（African Swine Fever，ASF）是一種烈性病毒感染性疾病，在野豬和家豬中均可發(fā)病，其病原為非洲豬瘟病毒（African Swine Fever Virus，ASFV）。早在18 世紀20 年代，Kenya 首次報道了該病毒引起的疫病[1]。目前，世界動物衛(wèi)生組織（Office International Des Epizooties，OIE）將ASF 列為法定上報疫病，我國將其列為一類動物疫病[2]。非洲豬瘟疫情的流行不僅給養(yǎng)豬產(chǎn)業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失，而且對公共衛(wèi)生安全也造成風險和威脅[3]。因此，了解非洲豬瘟的流行病學情況可為防控疫情、減少經(jīng)濟損失和保護畜牧業(yè)健康發(fā)展提供有力的科學依據(jù)。

ASFV 是一種雙鏈DNA 病毒，是非洲豬瘟病毒科的唯一成員，也是唯一通過節(jié)肢動物非洲鈍緣蜱傳播的DNA 病毒[1]。ASFV 的分子結(jié)構(gòu)十分復(fù)雜，是有外殼的二十面體，平均直徑約200nm。病毒基因組含有一個線性、共價鍵結(jié)合的雙鏈DNA，長度約170～190Kbp，編碼約151～167 個開放閱讀框，包括一個保守中心和兩段可變區(qū)，該可變區(qū)可編碼5 種多基因家族，與病毒可變性密切相關(guān)[2,4]。

ASF 的自然窗口期通常為4～19d，急性期為3～4d。通常來說，ASF 的臨床表現(xiàn)診斷可分為4 種病程形式，即超急性、急性、亞急性和慢性。其中超急性和急性非洲豬瘟熱是由高致病力的毒株引起，亞急性和慢性非洲豬瘟熱是由中至輕度致病力的毒株引起。超急性感染常發(fā)生猝死，臨床表現(xiàn)較少；急性感染常表現(xiàn)為高熱（達40.5～42℃），早期白細胞和血小板減少，心率和呼吸頻率增快，耳朵、尾巴、四肢遠端、胸部和腹部的皮膚發(fā)紅，死亡前24～48h 出現(xiàn)貧血、發(fā)紺等癥狀，家豬病死率常達100%[5]。亞急性和慢性病程表現(xiàn)較為緩和，發(fā)熱程度較輕，可出現(xiàn)皮膚壞死、潰瘍和關(guān)節(jié)炎，亞急性自然病程在15～45d 死亡，慢性則在2～15 個月死亡[2]。根據(jù)ASFV 毒株致病力的不同，ASF 的臨床表現(xiàn)和病程呈較大的個體差異，可表現(xiàn)為長期持續(xù)感染，也可表現(xiàn)為致死率100%的超急性和急性病程[6]。我國于2018 年爆發(fā)非洲豬瘟疫情，對我國養(yǎng)豬產(chǎn)業(yè)造成巨大影響，個別省份豬肉大規(guī)模減產(chǎn)。因此，建立一種靈敏、準確且快速檢測不同ASFV 的毒株方法對收集非洲豬瘟疫情流行病學數(shù)據(jù)、對疫情形勢做出正確判斷至關(guān)重要。

1 材料與方法

1.1 核酸和樣品

國家標準品非洲豬瘟病毒B646L 基因質(zhì)粒（GBW (E)091034）作為陽性對照，無菌無核酶水作為陰性對照。參考品非洲豬瘟病毒P27 基因質(zhì)粒、非洲豬瘟CD2v 基因缺失質(zhì)粒和非洲豬瘟MGF360-505R 基因缺失質(zhì)粒均購自廣州艾基。

1.2 試劑和儀器

ddH2O（上海生工）、dNTPS（上海生工）、Hot-start Taq聚合酶（菲鵬生物）、5×buffer（菲鵬生物）、非洲豬瘟引物F1（上海生工）、非洲豬瘟引物R1（上海生工）、非洲豬瘟Taqman 探針P1（上海生工）、非洲豬瘟CD2v 基因缺失引物F2（上海生工）、非洲豬瘟CD2v 基因缺失引物R2（上海生工）、非洲豬瘟CD2v 基因缺失Taqman 探針P2（上海生工）、非洲豬瘟MGF360-505R 基因缺失引物F3（上海生工）、非洲豬瘟MGF360-505R 基因缺失引物R3（上海生工）、非洲豬瘟MGF360-505R 基因缺失Taqman 探針P3（上海生工）。NanoDrop 微量分光光度計（賽默飛）、速低溫離心機（珠海黑馬）、LightCycler480 熒光PCR 儀（瑞士羅氏）、小型瞬時離心機（美國精騏）、渦旋振蕩器。

1.3 引物和探針設(shè)計

對比Genbank 上下載序列，各設(shè)計一對非洲豬瘟、非洲豬瘟CD2v 基因缺失和非洲豬瘟MGF360-505R 基因缺失的特異性引物和Taqman 探針，用于非洲豬瘟、非洲豬瘟CD2v 的鑒別檢測，引物和探針由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，參見表1。

表1 引物和探針

1.4 熒光PCR

病毒總DNA 按照核酸提取試劑（廣州維伯鑫）說明書要求提取，再使用NanoDrop 微量分光光度計（賽默飛）通過檢測樣本在260nm 波長的吸光度來確定所提取的DNA 濃度。將提取的病毒DNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，使用LightCycler480 熒光PCR 儀（瑞士羅氏）加入設(shè)計好的引物R1、R2、R3 和各自的探針以cDNA 為模板分別進行擴增。反應(yīng)體系如表2 所示。反應(yīng)程序為42℃，20min；95℃，10min；94℃，15s，55℃，30s（收集熒光），共40 個循環(huán)。

表2 熒光PCR 反應(yīng)體系

1.5 敏感性（最低檢測限）檢測

參考品加入0.5ml 無DNA 酶的去離子水復(fù)溶，待液體完全澄清后作為待測樣品使用。參考品復(fù)溶后濃度為1.3×106copies/ml，分別用無DNA 酶的去離子水進行1:10（濃度為1.3×105copies/mL）、1:102（濃度為1.3×104copies/ml）、1:103（濃度為1.3×103copies/ml）、1:104（濃度為1.3×102copies/ml）及1:105（濃度為1.3×101copies/ml）5 個濃度梯度的稀釋，作為待測樣品用熒光PCR 方法對最低檢出限進行檢測。

1.6 精密性檢測

使用參考品加入無DNA 酶的去離子水稀釋100 倍后利用構(gòu)建的熒光PCR 反應(yīng)體系重復(fù)檢測10 次，計算其CV 值。

1.7 特異性檢測

采用非洲豬瘟國家參考品作為陽性對照，參考品恢復(fù)至室溫，陽性、陰性參考品加入2.5 ml 無DNA 酶的去離子水復(fù)溶，待液體完全澄清后作為待測樣品使用。

1.8 統(tǒng)計學分析

采用IBM SPSS Statistics 26 對重復(fù)性檢測試驗中的變異系數(shù)（Coefficient of Variance,CV）進行計算，CV≤5%表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 敏感性結(jié)果

將參考品病毒核酸按1:10、1:102、1:103、1:104 及1:105倍數(shù)進行稀釋后使用熒光PCR 方法檢測。結(jié)果顯示，該技術(shù)能在濃度為1.3×103copies/ml 及以上時檢出非洲豬瘟病毒（圖1）、非洲豬瘟CD2v 基因缺失病毒（圖2）和非洲豬瘟MGF360-505R 基因缺失病毒（圖3）及豬源性內(nèi)參（圖4）。

圖1 熒光PCR 體系最低檢測限結(jié)果（非洲豬瘟病毒參考品）

圖2 熒光PCR 體系最低檢測限結(jié)果（非洲豬瘟CD2v 基因缺失病毒參考品）

圖3 熒光PCR 體系最低檢測限結(jié)果（非洲豬瘟MGF360-505R 基因缺失病毒參考品）

圖4 熒光PCR 體系最低檢測限內(nèi)參結(jié)果（綠色線）

2.2 精密性結(jié)果

為檢測本研究所構(gòu)建的熒光RT-PCR 體系能否穩(wěn)定的檢測出不同病毒毒株，使用該技術(shù)分別重復(fù)檢測非洲豬瘟病毒（表3 和圖5）、非洲豬瘟CD2v 基因缺失病毒（表3 和圖6）和非洲豬瘟MGF360-505R 基因缺失病毒（表3 和圖7）的參考品各10 次，并計算其CV 值。經(jīng)計算得出非洲豬瘟病毒的CV%為0.55%，非洲豬瘟CD2v 基因缺失病毒的CV%為0.36%，而非洲豬瘟MGF360-505R 基因缺失病毒的CV%為0.21%，三者的CV%均＜1%，提示該方法能重復(fù)穩(wěn)定檢測不同病毒毒株。

表3 精密度檢測結(jié)果

圖5 非洲豬瘟病毒精密性檢測結(jié)果

圖6 非洲豬瘟CD2v 基因缺失病毒精密性檢測結(jié)果

圖7 非洲豬瘟MGF360-505R 基因缺失病毒精密性檢測結(jié)果

2.3 特異性結(jié)果

明確該方法的精密度后，利用國家標準品ASFV B646L 基因質(zhì)粒做陽性對照，檢測區(qū)分不同病毒毒株的特異性（圖8）。與陽性對照相比，該技術(shù)測得的10 個非洲豬瘟病毒參考品全部為陽性，靈敏度為100%（10/10）。

圖8 使用國家標準品作為陽性對照測得的特異性結(jié)果

另外，我們利用陰性參考品檢測該方法的特異度（圖9）。與陰性對照相比，該技術(shù)測得的20 個陰性參考品樣本全部為陰性，特異度為100%（20/20）。

圖9 使用陰性參考品作為對照測得的特異性結(jié)果

3 討論

非洲豬瘟是一種傳染速度快、致死率高的嚴重疾病。本研究建立了一種熒光PCR 方法，能靈敏、準確且快速檢測不同的ASFV 毒株，能協(xié)助收集流行病學數(shù)據(jù)，有利于降低ASFV感染造成的經(jīng)濟損失，同時保護公共衛(wèi)生安全。

2018 年8 月，我國沈陽確診第一例非洲豬瘟疫情，截至2021 年12 月，全國共發(fā)生195 起非洲豬瘟疫情，其中家豬疫情189 起，野豬疫情6 起。2021 年以來，全國累計報告發(fā)生14起非洲豬瘟疫情。目前，人們已嘗試了多種方法制備ASFV 的疫苗均未獲得成功，無法在動物體內(nèi)建立有效的保護性免疫，同時也缺乏有效的治療方法[3]?，F(xiàn)今，主要采用撲殺感染動物、嚴格生物安全措施等成本高、效率低的手段，為阻止疫情在我國乃至全球的蔓延。為了更好地應(yīng)對非洲豬瘟對我國畜牧經(jīng)濟的影響、減少帶病豬肉流入食品加工領(lǐng)域，我國針對ASFV 的實驗室診斷技術(shù)分別制定了一個國家標準《非洲豬瘟診斷技術(shù)》 GB/T 18648-2018[7]、一個商檢行業(yè)標準《非洲豬瘟檢疫技術(shù)規(guī)范》 SN/T 1559-2010[8]和一個團體標準《非洲豬瘟病毒實時熒光PCR 檢測方法》 T/CVMA 5-2018[9]。但根據(jù)ASFV 毒株致病力的不同，ASF 的臨床表現(xiàn)和病程呈現(xiàn)較大的個體差異。因此，早期診斷、快速檢測不同ASFV 病毒毒株、不斷更新迭代病毒檢測方法對疾病源頭防控具有重要的意義。

病原體本身采取的檢測方法是診斷ASFV 初期感染的有效手段，有助于疾病早期確認ASFV 感染，盡早確診并進行干預(yù)處理[10]。熒光PCR 是指在反應(yīng)體系中加入熒光基團和熒光淬滅基團，隨著PCR 反應(yīng)的進行，擴增產(chǎn)物不斷積累，熒光信號逐漸增強，從而能利用較少的樣本檢測出準確的量化結(jié)果，是對原有PCR 技術(shù)的一大變革[11]。在本研究所建立的方法中，通過敏感性檢測測得對不同毒株的最低檢測限都較低，提示本研究方法有較高的靈敏性，能檢出較低濃度的病毒水平。同時，養(yǎng)豬場環(huán)境復(fù)雜，采樣過程難以達到標準化。經(jīng)過重復(fù)性檢驗，重復(fù)10 次檢測后CV%均＜1%，提示本研究建立的方法精密度佳，檢測體系穩(wěn)定可靠。另外，考慮到標本可能混入其他病毒樣本或混合其他雜質(zhì)，我們采用無菌無核酶水及國家標準品作為陰性和陽性對照，結(jié)果發(fā)現(xiàn)本方法可以準確地將不同ASFV 毒株檢出，未出現(xiàn)假陽性或假陰性的情況，提示該檢測方法特異性高，可在實踐工作中避免各種干擾因素影響?？傮w而言，有效的診斷方法能盡早將不同病毒毒株檢出，降低運輸、屠宰、生產(chǎn)加工等下游各環(huán)節(jié)疫情傳播風險，降低成本支出，提高經(jīng)濟受益。

綜上所述，本研究建立的熒光PCR 技術(shù)能快速準確地鑒定ASFV 的不同毒株，為疫情防控提供流行病學依據(jù)。