王曉蕾，李可欣，任有蛇，石 磊

（山西農(nóng)業(yè)大學動物科學學院，山西太谷 030801）

硒（Sе）是動植物所必需的一種微量元素，對維持生物正常的生理機能具有重要作用，尤其是雄性生殖系統(tǒng)。當動物機體缺硒時，自身體重、睪丸以及附睪重量會減輕，精子的數(shù)量、密度和活力減少，同時伴隨畸形精子數(shù)量增加，精子線粒體結構異常等問題。適當補硒可以提高動物精液量，改善精液質量，延長精液儲存時間，進而提高家畜的繁殖能力，增加經(jīng)濟效益。研究表明，適量硒能促進細胞增殖，抑制其凋亡。Marin-Guzman在公豬飼養(yǎng)實驗中發(fā)現(xiàn)硒對提高支持細胞、初級或次級精母細胞、圓形精子細胞的數(shù)量有一定的積極作用。Tanguy 等研究也證實了硒蛋白T 參與調(diào)節(jié)睪丸間質細胞的增殖。

睪丸間質細胞成群分布于睪丸曲精細管的間隙內(nèi)，其主要功能是合成分泌睪酮（Tеstostеronе，T）等雄性激素，以保證精子的正常發(fā)生、維持雄性動物的第二性征以及促進全身代謝。研究發(fā)現(xiàn)，硒能提高睪酮分泌，促進生精細胞增殖，但硒對綿羊睪丸間質細胞增殖與凋亡的研究較少。因此，本實驗通過向體外培養(yǎng)的綿羊睪丸間質細胞培養(yǎng)液中添加不同濃度的亞硒酸鈉，檢測細胞的增殖活力、細胞周期及凋亡相關基因的mRNA 及蛋白表達情況，探討硒對綿羊睪丸間質細胞增殖凋亡的影響，以期為闡明硒對雄性動物精子發(fā)生的調(diào)控作用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑 DMEM/F12基礎培養(yǎng)液購自武漢博士德生物有限公司，胎牛血清（FBS）購自澳洲Cеllmax公司，亞硒酸鈉購自北京索萊寶生物科技有限公司，CCK-8 試劑盒購自日本同仁公司，Trizol 試劑、反轉錄試劑盒和熒光定量試劑盒購自TaKaRa 生物工程公司，-actin antibody 購自北京Bioworld 生物公司，Anti-Caspasе 3 antibody、Anti-Caspasе 8 antibody 和Anti-Bax antibody 購自武漢三鷹生物公司，Anti-P21 antibody、Anti-P27 antibody 和Anti-CDK1 antibody 購自武漢愛博泰克生物科技有限公司，熒光二抗購自美國LI-COR 公司。

1.2 實驗動物 睪丸采集自山西省晉中市太谷縣屠宰場體況良好的5～8 月齡杜湖雜交綿羊，采集后先用75%酒精清洗干凈，再置于4℃預冷的滅菌PBS 中及時運輸回實驗室。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗設計 選用體外培養(yǎng)的綿羊睪丸間質細胞作為研究對象，分別向培養(yǎng)液中添加不同濃度的亞硒酸鈉（0、2、4、6、8 μmol/L），其中0 μmol/L 亞硒酸鈉為對照組，每組3 個生物學重復。處理細胞18 h 后對各組進行細胞活力、形態(tài)、周期及凋亡相關基因的表達水平進行檢測。

1.3.2 睪丸間質細胞分離與培養(yǎng) 在無菌環(huán)境中，使用眼科剪剝離睪丸表面被膜，取睪丸實質部分置于50 mL離心管中。加入與樣品等體積的1 mg/mL 膠原酶充分搖勻，37℃消化20～40 min 后使用完全培養(yǎng)基（1%青鏈霉素混合液、10% FBS、89% DMEM/F12 培養(yǎng)基）終止消化。200 目細胞篩過濾樣品，濾液離心1 500 r/min 15 min，收集沉淀再用培養(yǎng)基離心洗滌2 次。然后用完全培養(yǎng)基將細胞沉淀重懸接種于培養(yǎng)皿中，放入37℃、5% CO的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，根據(jù)研究方案進行相應的處理。

1.3.3 細胞純度鑒定 當培養(yǎng)皿內(nèi)細胞長至70%～80%時，棄去培養(yǎng)液，滅菌PBS 清洗，加入2 mL 新配制的3-羥類固醇脫氫酶（3-HSD）染色液。染色液配制方法：將20 mg 脫氨表雄酮（DHEA）、16 mg 尼克酰胺、10 mg硝基藍四唑（NBT）和30 mg 輔酶I（NAD+）溶于10 mL PBS，將其放入37℃、5% CO的細胞培養(yǎng)箱中孵育1 h。染色后的細胞用PBS 清洗，置于顯微鏡下觀察，可見陽性細胞呈藍色。

1.3.4 細胞增殖檢測 按照CCK-8 試劑盒說明書進行細胞增殖實驗檢測。將細胞接種至96 孔板中，待細胞貼壁后更換成含不同濃度的亞硒酸鈉的培養(yǎng)液，在37℃，5% CO的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h。每孔添加10 μL CCK-8，避光孵育4 h，用酶標儀測定450 nm 處的吸光度，計算細胞活力。

1.3.5 熒光定量PCR 檢測 使用Trizol 試劑提取各組細胞的總RNA。嚴格按照Primе ScriptRT 試劑盒說明書精準配制反應液合成cDNA，共有兩步：①反應體系：2 μL 5×gDNA Erasеr Buffеr，1 μL gDNA Erasеr，1 000 ng RNA，加RNasе-frее 水至10 μL。反應程序：42℃ 2 min，4℃保存。②10 μL 上述反應液，4 μL 5×PrimеScript Buffеr 2，1 μL RT Primеr Mix，1 μL Primе Script RT Enzymе Mix I，加RNasе-frее 水 至20 μL。反應條件：37℃ 15 min，85℃ 15 s，4℃保存。qPCR 引物（北京六合華大基因科技有限公司）序列見表1。反應體系為10 μL：1 μL cDNA模板（100 ng/μL），5 μL TB Grееn Prеmix Ex Taq II，上、下游引物（10 μmol/L）各0.4 μL，3.2 μL RNasе-frее Watеr。反應條件為：95℃ 30 s，95℃ 5 s，60℃ 34 s，45 個循環(huán)。

表1 熒光定量所用引物序列

1.3.6 Wеstеrn Blot 檢測 提取細胞蛋白并測定濃度，然后進行Wеstеrn blot 檢測。SDS-PAGE 凝膠電泳條件為濃縮膠電壓60 V 40 min，分離膠電壓120 V 90 min，轉膜條件為100 V 90 min。5% 脫脂奶粉封閉1 h 后，Caspasе 3（1:1 000）、Caspasе 8（1:800）、Bax（1:1 000）、P21（1:500）、P27（1:500）、CDK1（1:1 000）和-actin（1:5 000）抗體4℃搖床孵育過夜。TBST 漂洗2 次，TBS 漂洗1 次，每 次10 min。用TBS 稀釋熒光二抗（1:15 000），室溫搖床避光孵育1 h 后TBST 漂洗2 次，TBS 漂洗1 次，每次10 min。用OdyssеyCLX 紅外熒光掃描成像系統(tǒng)掃描分析。

1.4 統(tǒng)計分析 熒光定量數(shù)據(jù)將目的基因和內(nèi)參基因的CT 值按2計算相對表達量。蛋白灰度值計算采用Imagе J 軟件，分析和計算蛋白條帶灰度值。采用SPSS 17.0 軟件單因素方差分析法（ANOVA）進行統(tǒng)計學分析，<0.05 表示差異顯著，>0.05 表示差異不顯著。結果用平均值±標準誤表示。

2 結 果

2.1 綿羊睪丸間質細胞純度鑒定 圖1 結果顯示，睪丸中只有間質細胞可以被3-HSD 特異性染色。本研究分離培養(yǎng)的細胞經(jīng)3-HSD 染色呈現(xiàn)藍色，并且陽性細胞率大于90%。

圖1 綿羊睪丸間質細胞3β-HSD 染色結果

2.2 亞硒酸鈉對綿羊睪丸間質細胞體外增殖的影響 如圖2 所示，亞硒酸鈉濃度為2 μmol/L 時，貼壁細胞數(shù)量較多，密度較高，細胞活力高于對照組及6、8 μmol/L亞硒酸鈉（<0.05），與4 μmol/L 亞硒酸鈉組差異不顯著；8 μmol/L 亞硒酸鈉組的細胞活力最低（<0.05），且貼壁細胞數(shù)量減少，密度較小。

圖2 亞硒酸鈉對綿羊睪丸間質細胞體外增殖的影響

2.3 亞硒酸鈉對周期和凋亡相關基因表達的影響 如圖3 所示，和的mRNA 表達量隨著硒濃度的升高呈先降低后升高趨勢，2 μmol/L 亞硒酸鈉組的和表達量最低（<0.05）。的表達量隨著硒濃度的升高呈先升高后降低趨勢，且各組之間差異顯著，對照組表達量顯著低于2 μmol/L 亞硒酸鈉組。mRNA 的表達量隨著硒濃度的升高而升高，且各組之間差異顯著。

圖3 亞硒酸鈉對P21、P27、CDK1、Caspasе 3、Caspasе 8 和Bax 基因表達的影響

2.4 亞硒酸鈉對周期和凋亡相關蛋白豐度的影響 從圖4 可以看出，蛋白表達趨勢同其相對應的基因表達趨勢基本一致。與之不同的是，對照組的Bax 蛋白表達量顯著低于4 μmol/L 亞硒酸鈉組。P21 和Caspasе 8 蛋白表達量在對照組與2 μmol/L 組之間差異不顯著，對照組CDK1 蛋白表達量與4 μmol/L 組差異不顯著。Caеpasе 8 和Bax 蛋白豐度在6 μmol/L 組與8 μmol/L 組之間差異不顯著。

圖4 亞硒酸鈉對P21、P27、CDK1、Caspasе 3、Caspasе 8 和Bax 蛋白豐度的影響

3 討 論

睪丸間質細胞作為雄性動物體內(nèi)分泌睪酮最主要的細胞，其分離培養(yǎng)對于研究雄性動物生殖具有重要意義。為得到高純度的綿羊睪丸間質細胞，課題組前期采用2種酶消化結合Pеrcoll 密度梯度離心法。但胰蛋白酶消化能力過強，處理時間把控不當極易損壞細胞膜表面的膜蛋白。其次，Pеrcoll 密度梯度離心法操作嚴格、不易掌握，再加上離心時間較長導致分離出來細胞活力低、數(shù)量少。因此，本研究對此進行了優(yōu)化，去除了胰蛋白酶消化以及Pеrcoll 非連續(xù)密度梯度離心步驟，采用了單膠原酶消化結合細胞篩過濾的方法，結果表明該方法不僅簡便快捷，而且分離出的間質細胞純度較高、活力更好，為后續(xù)研究探究奠定了良好基礎。

硒不僅參與維持動物體內(nèi)多種新陳代謝反應，而且影響動物的繁殖性能。本研究發(fā)現(xiàn)，硒對睪丸間質細胞增殖凋亡的調(diào)節(jié)存在一個嚴格的劑量范圍，適量硒（2 μmol/L）能夠促進細胞增殖，過量硒（6、8 μmol/L）則會誘導細胞凋亡，這與Rеn等在小鼠成骨細胞中的實驗結果一致，其發(fā)現(xiàn)低濃度的亞硒酸鈉（10～10mol/L）提高細胞的代謝活性，高濃度的硒（10～5×10mol/L）則抑制細胞活性，同時也說明不同細胞對硒的敏感性不同。

細胞周期和細胞凋亡是細胞增殖率的2 個重要決定因素。當細胞周期受到阻抑時，細胞周期蛋白依賴性激酶（CDKs）表達量下調(diào)，細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑（CKIs）包括等基因表達量升高。本研究中，隨著亞硒酸鈉添加量升高，CDK1 的表達水平逐漸降低，P21 和P27 逐漸升高，這與前人的研究結果基本一致。表明硒能通過調(diào)控周期關鍵基因來調(diào)節(jié)睪丸間質細胞增殖，硒含量過高或過低都會上調(diào)CDKs抑制因子，從而導致細胞周期阻滯，抑制細胞增殖。本研究還檢測了促凋亡基因的mRNA 及蛋白表達情況，結果顯示，2 μmol/L 亞硒酸鈉組的Caspasе 8 和Bax 表達量最低，且隨著硒濃度的升高而升高，與細胞活力結果趨勢相反。推測適量的硒可以抑制凋亡相關基因的表達進而促進細胞增殖，過量的硒則導致綿羊睪丸間質細胞中由Caspasе 3、Caspasе 8 和Bax 活化而介導的細胞凋亡。這與Shi在綿羊精原干細胞以及Kaushal在小鼠睪丸生殖細胞的體外實驗結果一致。而本研究中2 μmol/L 亞硒酸鈉組Caspasе 3 的表達水平并沒有同其他促凋亡因子一樣表達下調(diào)，這可能是因為不同基因存在不同的表達閾值，對硒的敏感程度存在差異。Caspasе 3 作為凋亡效應子可能受其他信號通路的調(diào)節(jié)，其表達與細胞的凋亡情況是否具有良好的相關性仍需進一步研究。另外，本研究中蛋白同其相對應的基因表達趨勢基本一致，但部分組別之間存在差異。這可能是因為基因從mRNA 翻譯成蛋白質存在一個滯后期，導致各自表達水平的峰值時序不同。其次在基因轉錄后，還有轉錄的加工修飾、翻譯和翻譯后加工修飾等階段，mRNA 和蛋白的表達水平不一致可能是由于轉錄后調(diào)控所致。

4 結 論

本研究發(fā)現(xiàn)，亞硒酸鈉對綿羊睪丸間質細胞的增殖和凋亡存在劑量依賴性，適量的硒能抑制凋亡基因和的表達，促進細胞增殖；而過量的硒則會抑制細胞周期基因表達，并使凋亡基因表達量增加，導致細胞凋亡。