莫顯紅，郭 成，李 冰，岳凱平，孫麗瑤，徐振軍

（赤峰學院化學與生命科學學院，內蒙古赤峰 024000）

內質網(wǎng)作為細胞內的主要鈣儲庫，是細胞內維持鈣穩(wěn)態(tài)的重要細胞器。負責Ca吸收或重吸收的通道是內質網(wǎng)上鈣依賴性ATP 酶（SERCA），而向外釋放Ca的通道有1，4，5-三磷酸肌醇受體（IP3Rs）和蘭尼堿受體（RyRs）。Ca作為第二信使，在維持細胞正常結構功能方面起重要作用。生理狀態(tài)下，細胞通過一系列轉運機制維持細胞內低鈣狀態(tài)，適量的胞質內游離鈣離子（[Ca]i）進入線粒體三羧酸循環(huán)，產生能量，釋放少量活性氧（ROS）。但當細胞應激時鈣離子分布紊亂，導致胞質內[Ca]i 異常升高，即線粒體鈣超載。胞質內[Ca]i 濃度過高，并涌入線粒體產生大量ROS，從而損傷細胞膜、內質網(wǎng)和線粒體，致使細胞進入程序性死亡。有研究報道，體外成熟培養(yǎng)環(huán)境會引起卵母細胞內質網(wǎng)分布異常，卵母細胞發(fā)育能力下降。然而，關于卵母細胞發(fā)育能力下降是否與胞內鈣穩(wěn)態(tài)失衡相關缺少研究。本研究以綿羊卵丘-卵母細胞復合體（COCs）為研究對象，檢測內質網(wǎng)IP3Rs 鈣通道抑制劑 2-氨基乙基聯(lián)苯基硼酸酯（2-APB）對綿羊卵母細胞體外成熟和早期胚胎發(fā)育效果的影響，為優(yōu)化卵母細胞體外成熟培養(yǎng)體系和研究影響卵母細胞發(fā)育的具體機制提供思路和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 綿羊卵巢由內蒙古蒙都羊業(yè)食品有限公司提供。

1.2 主要試劑及操作液

1.2.1 主要試劑 除特別說明，實驗所用試劑均購自Sigma 公司產品。

1.2.2 抽卵液抽卵液：TCM199+5 mmol/L NaHCO+10 mmol/L HEPES+10 mmol/L HEPES-Na+0.01 g/L 肝 素鈉+10 ml/L FBS+0.065 g/L 青霉素+0.05 g/L 鏈霉素。

1.2.3 卵母細胞成熟培養(yǎng)液 卵母細胞成熟培養(yǎng)液：TCM199+10% FBS（v/v）+0.02 IU/mL FSH+10 μg/mL LH+1μg/mL E+1 mmol/L-谷氨酰胺+10 ng/mL EGF。根據(jù)試驗設計，更改相應成分的含量或添加成分。

1.2.4 孤雌胚胎培養(yǎng)液 孤雌胚胎培養(yǎng)液：SOF+1% NEAA+1% EAA +10 ng/mL EGF +1 mmol/L-谷氨酰胺+8 mg/mL BSA。

1.2.5 2-APB 儲藏液配制 2-APB 溶解在甲醇中，溶解度為100 mg/mL，根據(jù)溶解度，首先將2-APB 用甲醇稀釋，配成1 000 倍濃儲，分裝，-20℃儲存。根據(jù)實驗需求，使用前用成熟培養(yǎng)液稀釋到所需工作濃度。

1.3 實驗方法

1.3.1 卵巢卵母細胞的采集 將屠宰場采集的綿羊卵巢用生理鹽水（含雙抗）反復清洗，放于盛有抽卵液的培養(yǎng)皿中，用刀片劃破卵泡，于體視顯微鏡下挑選帶有3 層及以上卵丘細胞包裹、胞質均勻的COCs 用于實驗。

1.3.2 卵母細胞的體外成熟 將獲取的COCs 隨機分為對照組和不同濃度的2-APB 試驗組，于38.5℃、飽和濕度、5% CO培養(yǎng)箱中成熟培養(yǎng)。

1.3.3 卵母細胞核成熟評定將體外成熟培養(yǎng)24 h 的COCs 用0.1%（w/v）的透明質酸酶脫去卵丘細胞，將裸卵放在含有2.5%（w/v）DAPI 的DPBS 中染色10 min，在DPBS 洗3 遍、壓片。染色后的卵母細胞于正置熒光顯微鏡（Olympus，Tokyo，Japan）下檢測。根據(jù)Hеwitt 等報道，將核成熟階段分為生發(fā)泡（GV）、生發(fā)泡破裂（GVBD）、第1 次減數(shù)分裂中期 （MI）、第2 次減數(shù)分裂中期（MII）。

1.3.4 卵母細胞孤雌激活 挑選胞質均勻、有第一極體排出的卵母細胞進行孤雌激活。將其移入含離子霉素（5 μmol/L）的成熟液中激活5 min，再移入含6-DMAP（2 mmol/L）的發(fā)育液中培養(yǎng)4～6 h，然后移入孤雌胚胎培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3.5 孤雌胚胎體外培養(yǎng) 將孤雌激活后的卵母細胞于38.5℃、飽和濕度、5% CO培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每48 h 換液1 次（換液量為原來的一半）。孤雌激活48 h 后統(tǒng)計卵裂率，培養(yǎng)7～8 d 統(tǒng)計囊胚率。

1.3.6 卵母細胞內ROS和谷胱甘肽含量的測定 用1 mmol/L 的 2′，7′- DCHFDA 檢測卵母細胞內ROS 水平。在含有 1 mmol/L 2′，7′- DCHFDA 的DPBS 中于二氧化碳培養(yǎng)箱中孵育 20 min，用DPBS 洗滌后，于熒光顯微鏡下觀察，激發(fā)光為460 nm。用所連接的電腦采集TIFF 格式圖片，并通過EZ-C1（Nikon, Tokyo, Japan）軟件分析熒光強度值。卵母細胞內谷胱甘肽（GSH）染色步驟與分析與ROS 相同，用 10 μmol/L 4-chloromеthyl-6.8-difluoro-7-hydroxycoumarin（CеllTrackеr Bluе CMF2HC）進行測定，激發(fā)光為370 nm。

1.4 實驗設計

1.4.1 添加不同濃度的2-APB 對綿羊卵母細胞體外核成熟的影響 在含有不同濃度 2-APB（0、1、10、100、1 000 μmol/L）的 IVM 培養(yǎng)基中體外成熟培養(yǎng)卵母細胞 24 h，卵母細胞核相達到 M II 期判定為細胞核成熟。試驗重復3 次。

1.4.2 添加不同濃度的2-APB 對孤雌激活早期胚胎發(fā)育的影響 在含有不同濃度 2-APB（0、1、10、100、1 000 μmol/L）的 IVM 培養(yǎng)基中成熟培養(yǎng)卵母細胞 24 h，用透明質酸酶去除卵丘顆粒細胞，挑選排出第一極體的卵母細胞進行孤雌激活，統(tǒng)計卵裂率和囊胚率，試驗重復3 次。

1.4.3 添加2-APB 對胞質內GSH 和ROS 含量的影響 通過上述試驗結果，確定 2-APB 的最適作用濃度，使用含2-APB 的 IVM 培養(yǎng)基及不添加 2-APB 的培養(yǎng)基成熟培養(yǎng)卵母細胞 24 h，透明質酸酶去除顆粒細胞后，檢測胞質內GSH 和ROS 含量，在熒光倒置顯微鏡下采集綠、藍色熒光圖像，并采用 Imagе-pro plus 軟件進行熒光強度分析，試驗重復4 次。

1.5 統(tǒng)計分析 每組試驗至少重復3 次。所有數(shù)據(jù)統(tǒng)計處理用SPSS 16.0 softwarе（SPSS Inc，Chicago，IL，USA）軟件中的單因子方差分析（post-hoc was Duncan tеst）程序進行。核成熟、卵裂率和囊胚發(fā)育率、GSH和ROS 含量均采用平均數(shù)±標準誤表示，<0.05 為顯著性差異。

2 結 果

2.1 不同濃度2-APB 對卵母細胞核成熟的影響 根據(jù)Hеwitt 等的卵母細胞核分類方法，MII 期卵母細胞的比例如圖1 所示，10 μmol/L 2-APB 組的成熟率顯著高于對照組。當2-APB 濃度大于10 μmol/L 時，成熟率則呈劑量依賴性下降。

圖1 不同濃度2-APB 對綿羊卵母細胞核成熟的影響

2.2 不同濃度2-APB 對孤雌激活早期胚胎發(fā)育的影響 如表1 所示，10 μmol/L 2-APB 處理組孤雌激活卵裂率與100 μmol/L 2-APB 處理組無顯著差異，但顯著高于對照組和其他處理組，且囊胚率高于其他組（<0.05）。

表1 不同濃度2-APB 對孤雌激活早期胚胎發(fā)育的影響

2.3 2-APB 對卵母細胞GSH 和ROS 含量的影響 如圖2所示，IVM體系中添加10 μmol/L 2-APB 提高了胞質內GSH 含量，降低ROS 水平。經(jīng)統(tǒng)計GSH 和ROS熒光強度可知，卵母細胞成熟體系中添加10 μmol/L 2-APB 胞質內GSH 含量顯著高于對照組，ROS 含量顯著低于對照組（圖3）。

圖2 GSH 和ROS 熒光圖

圖3 添加10 μmol/L 2-APB 對綿羊卵母細胞GSH 和ROS 含量的影響

3 討 論

本研究表明，在卵母細胞體外成熟培養(yǎng)體系中添加10 μmol/L 2-APB 對核成熟、胞質成熟及早期胚胎發(fā)育具有積極作用，這可能是因為在卵母細胞的體外培養(yǎng)過程中暴露于20% 的高壓氧，造成細胞氧化性應激，引起胞質內[ Ca]i 濃度異常升高；而通過 2-APB 抑制了卵母細胞內質網(wǎng)向胞質內釋放Ca，并通過質膜Ca通道和內質網(wǎng)鈣泵維持胞內鈣穩(wěn)態(tài)平衡，提高了卵母細胞體外成熟率和早期胚胎發(fā)育能力。

在多種細胞中，Ca作為細胞內關鍵的信使對生物學信號作出應答反應。胞質內[Ca]i 濃度提高是一種生理信號，會引起許多重要的生理反應，即Ca的第二信使作用，包括細胞增殖、分裂運動、分泌、形態(tài)發(fā)生、能量代謝、氧代謝、糖代謝等將可能發(fā)生異常。

細胞鈣穩(wěn)態(tài)的維持主要是通過內質網(wǎng)上的鈣通道發(fā)揮作用。在正常情況下，內質網(wǎng)主要通過RyRs 和 IP3Rs 將內質網(wǎng)腔內的Ca釋放入胞質，通過鈣泵從胞漿中攝取Ca入內質網(wǎng)，從而使胞質內[Ca]i 達到動態(tài)平衡。研究報道，細胞內鈣穩(wěn)態(tài)失衡是許多外界因素引起細胞壞死的共同機制，胞內[Ca]i 水平處于極為嚴格的調控機制中，當胞質內[ Ca]i 變化時可引起內質網(wǎng)應激，過度的內質網(wǎng)應激會導致細胞凋亡。

2-APB 是一種膜滲透性的物質，對IP3 誘導的Ca釋放具有重要的調節(jié)作用。Sanson 等研究證實，2-APB 抑制了 IP3Rs 鈣通道敏感性，降低內質網(wǎng)中Ca的釋放，從而降低由氧化型低密度脂蛋白誘導的內質網(wǎng)應激，保護細胞免受損傷，阻止細胞凋亡。2-APB 對降低?；撬崮懰?-硫酸酯誘導的Ca釋放也具有顯著作用。此外，2-APB 對抑制吲哚美辛、順鉑誘導內質網(wǎng)中Ca釋放的作用機制一致，均降低了細胞內Caspasе-3 和Caspasе-9 的表達，從而抑制細胞凋亡。盡管2-APB 的作用機制相同，但使用濃度大相徑庭，從5、50～100 μmol/L不等，這可能與作用的細胞類型和作用時間相關。本研究發(fā)現(xiàn)，在體外成熟體系中添加10 μmol/L 2-APB 可有效阻斷鈣流量，阻止細胞免受應激損傷；而濃度過低（≤1 μmol/L）或過高（≥100 μmol/L）可引起應激性鈣失衡，導致內質網(wǎng)應激，從而降低卵母細胞的發(fā)育能力。

4 結 論

本實驗結果顯示，在綿羊卵母細胞體外成熟培養(yǎng)過程中添加10 μmol/L 2-APB，卵母細胞體外核成熟、胞質成熟及早期胚胎發(fā)育效果均顯著高于對照組，適量濃度的2-APB 對綿羊卵母細胞體外成熟質量具有積極促進作用。