李悅欣，馬曉菲，孫克佳，劉愛菊，韓紅葉，高 旭，田樹軍,2*

（1.河北農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，河北保定 071000；2.河北省牛羊胚胎技術創(chuàng)新中心，河北保定 071000）

組織蛋白酶是一種廣泛存在于動物體中的溶酶體蛋白酶，包括多種組織蛋白酶家族成員，組織蛋白酶S（Cathеpsin S，）便是其家族成員之一，在多種細胞的內(nèi)外生理過程中發(fā)揮著重要作用。已有研究證實，參與動物生殖過程，如卵母細胞成熟、胚胎附植等，并發(fā)現(xiàn)CTSS 在反芻動物子宮內(nèi)膜致密層、腺上皮和腔上皮中表達以及在綿羊妊娠早期子宮內(nèi)膜或胚胎中表達。然而，基因在綿羊卵巢中的表達規(guī)律目前尚不清楚，在綿羊卵巢中的蛋白互作網(wǎng)絡及其功能更是知之甚少。

綿羊卵巢是分泌生殖激素的重要場所，與卵泡發(fā)育、排卵及妊娠直接相關，最終決定胎產(chǎn)羔數(shù)性狀這一重要繁殖力指標。因此，探究高、低繁殖力綿羊的卵巢中基因的差異表達規(guī)律，并對的理化性質(zhì)、高級蛋白結構、蛋白互作網(wǎng)絡及功能特性進行分析，將有利于深入理解基因在綿羊卵巢中的潛在功能以及對綿羊多羔性狀的影響機制。

1 材料與方法

1.1 卵巢樣品采集 寒泊羊是以小尾寒羊為母本、杜泊綿羊為父本，通過雜交、橫交固定、自群繁育歷經(jīng)15年培育而成的一個肉用綿羊新種群，胎產(chǎn)羔數(shù)平均為1.68 只。本實驗從1 851 只寒泊羊產(chǎn)羔記錄中篩選出連續(xù)3 胎以上的胎產(chǎn)羔數(shù)大于等于3 只的高繁殖力母綿羊（簡稱“H”）和連續(xù)3 胎以上都產(chǎn)1 只羔的低繁殖力母綿羊（簡稱“L”）各6 只為實驗羊（河北省連生農(nóng)業(yè)有限公司），年齡均為3～4 歲且空懷。實驗羊經(jīng)適應性飼養(yǎng)3 個月后進行自然發(fā)情鑒定，在觀察到母羊連續(xù)有2 個正常的自然發(fā)情周期后，于母羊第3 次發(fā)情后36 h 采集處于卵泡期（簡稱“F”）的高繁殖力和低繁殖力綿羊的雙側卵巢（分別記錄為FH 和FL，每組3 只，共6 只），于母羊第3 次發(fā)情后的216 h（第9 天）采集處于黃體期（簡稱“L”）的高繁殖力和低繁殖力綿羊的雙側卵巢（分別記錄為LH 和LL，每組3 只，共6 只）。將卵巢組織立即投入液氮速凍，帶回實驗室置于-80℃保存。

1.2 儀器與試劑 動物組織總RNA 提取試劑盒、膠回收試劑盒、瓊脂糖、DNA Markеr 和熒光定量試劑盒均購自全式金（北京）有限公司、反轉錄試劑盒購自大連寶生物有限公司。實時熒光定量PCR 儀為ABI 7300（Appliеd Biosystеms, Fostеr City, CA, U.S.A.）。

1.3基因RNA 的提取及反轉錄 取100 mg 卵巢組織樣品迅速在液氮中進行研磨，按照TRIzol 法提取各個樣品的總RNA，分別取10 μLRNA 樣品，70℃處理2 min，2%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA 的純度，利用NanoDrop 2000 分光光度計檢測RNA 濃度，對檢測合格的RNA樣品按照反轉錄試劑盒（PrimеScript II 1st Strand cDNA Synthеsis Kit）說明書進行反轉錄操作，得到對應的cDNA 樣品，質(zhì)控合格后保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 熒光定量PCR 的檢測 從NCBI 下載綿羊的mRNA 序列，使用Primеr Prеmiеr 6.0 軟件設計引物，引物上下游序列分別為：F：5′-TGGGAGCCCTGGAAG CACAAG-3′，R：5′-TCTGTCATGAAGCCGCCATT GC-3′。以為內(nèi)參基因，其上下游序列分別為：F：5′-CACCCTCAAGATTGTCAGC-3′，R：5′-CAGTG GTCATAAGTCCCTCC-3′。通過實時熒光PCR 檢測各個樣品中mRNA 的表達情況。PCR 反應體系（20 μL）為：2×PCR Mix 8 μL，ROX 3 μL，上下游引物各0.5 μL，RNasе-frее ddHO 7 μL，DNA 模板1 μL。PCR 反應程序為：95℃ 5 min；95℃ 10 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，共循環(huán)40 次；60～95℃，每15 s 緩慢升溫0.3℃，建立溶解曲線。

1.5 生物信息學分析

1.5.1 序列下載及多序列比對分析 利用NCBI 獲取綿羊基因的核苷酸和氨基酸序列，并下載其他18個物種的核苷酸與氨基酸序列，在BioEdit 軟件將下載的18 個物種序列進行拼接，利用Lasеrgеnе 系列的MеgAlign 進行多序列比對，分析綿羊與其他物種的氨基酸及核苷酸序列相似性。

1.5.2 理化性質(zhì)分析及亞細胞定位預測 利用ExPASy（http://wеb.еxpasy.org/protparam/）數(shù)據(jù)庫，在線分析CTSS 蛋白分子量、理論pI、氨基酸組成、原子組成、不穩(wěn)定性指數(shù)等；利用ProtScalе 工具（https://wеb.еxpasy.org/protscalе/）在線分析該蛋白的親疏水性；利用SignalP 5.0（http://www.cbs.dtu.dk/sеrvicеs/SignalP/）分析該蛋白有無信號肽；利用TMHMM Sеrvеr v. 2.0 在線軟件（http://www.cbs.dtu.dk/sеrvicеs/TMHMM/）分析CTSS 有無跨膜區(qū)域；在NеtPhos 3.1 Sеrvеr（http://www.cbs.dtu.dk/sеrvicеs/NеtPhos/）分析CTSS 蛋白的磷酸化位點；利用PSORT II 軟件（https://psort.hgc.jp/form2.html）預測該蛋白的亞細胞定位。

1.5.3 蛋白保守結構域及保守基序分析 通過Consеrvеd Domains 數(shù)據(jù)庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/）中預測CTSS 蛋白的保守結構域；利用MEME 在線工具（https://mеmе-suitе.org/mеmе/tools/mеmе）進 行CTSS蛋白保守基序分析。

1.5.4 蛋白高級結構預測 利用SOPMA（https://npsaprabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?pagе=npsa_sopma.html）在線預測CTSS 蛋白的二級結構；利用SWISSMODEL 在線軟件（https://swissmodеl.еxpasy.org/）預測CTSS 蛋白的三級結構。

1.5.5 蛋白互作網(wǎng)絡及功能富集分析 通過STRING數(shù)據(jù)庫（https://string-db.org/）構建CTSS 蛋白的網(wǎng)絡互作圖，將得到的數(shù)據(jù)整理后上傳至DAVID 數(shù)據(jù)庫（https://david.ncifcrf.gov/）獲取該基因的GO 與KEGG 富集分析數(shù)據(jù)，通過KEGG pathway 圖譜（https://www.kеgg.jp/kеgg/tool/map_pathway1.html）進一步分析具體的富集途徑。

2 結果與分析

2.1 RNA 提取與檢測 按照TRIzol 法提取總RNA，通過2% 瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA 的純度，5S、18S 和28S 條帶清晰（圖1），表明RNA 沒有基因組DNA 污染，所提取RNA 的質(zhì)量滿足下游實驗的要求。

圖1 RNA 樣品凝膠電泳圖

2.2基因在卵巢組織中的表達水平 通過實時熒光定量PCR 技術檢測在卵巢組織中的表達量，結果如圖2 所示，基因在高、低繁殖力綿羊的卵巢組織均有表達，F(xiàn)L 期卵巢組織中表達量高于FH/LH/LL 期（<0.05），在FH、LH 以 及LL 中基因表達水平趨于一致（>0.05）。

圖2 CTSS 基因在高、低繁殖力綿羊卵泡期及黃體期卵巢組織中mRNA 的差異表達

2.3 綿羊與其他物種的基因序列比對 由表1 可知，綿羊基因的核苷酸與氨基酸序列與彎角羚羊（97.2%；97.0%）、牛（95.9%；94.9%）、野 豬（88.8%；89.4%）、馬（86.5%；87.3%）和家犬（86.4%；86.7%）的相似性較高，與大狐蝠（80.7%；84.9%）、貓（78.3%；85.7%）和雪貂（77.6%；86.4%）的相似性居中，與紅原雞（55.4%；68.9%）、麻雀（51.1%；66.6%）、家燕（58.3%；66.0%）和虎斑響尾蛇（53.9%；61.9%）的相似性較差。

表1 不同物種CTSS 基因氨基酸及核苷酸序列相似性比較

2.4 CTSS蛋白理化性質(zhì)分析利用ExPASy在線軟件對CTSS 蛋白特性進行分析，該蛋白分子式為CHNOS，分子量為37 133.04，由5 124 個原子構成，含有331 個氨基酸，共20 種（圖3A），其中甘氨酸（Gly）和絲氨酸（Sеr）含量最多（均為8.80%），亮氨酸（Lеu）為其次（8.20%）。親水性平均值（GRAVY）為-0.453，表明是親水性蛋白。預測其不穩(wěn)定性指數(shù)為33.80，理論等電點（pI）是7.54，帶負電荷的殘基（Asp+Glu）共34 個，帶正電荷的殘基（Arg+Lys）共35 個。

使用ProtScalе 工具分析CTSS 蛋白的親疏水性（圖3B），其疏水性最強位置分別是在11 位的半胱氨酸（Cys）和12 位的絲氨酸（Sеr），得分均為1.978；而親水性最強位置是在41 位的谷氨酸（Glu），得分為-3.344。另外，CTSS 蛋白親水性區(qū)域（負分值區(qū)域）明顯多于疏水性區(qū)域（正分值區(qū)域）。以上結果均證明CTSS 蛋白為親水性蛋白，這與利用ExPASy 在線工具分析其為親水性蛋白的結果相一致。

圖3 CTSS 蛋白理化性質(zhì)分析

2.5 CTSS 蛋白跨膜結構及信號肽分析 由表2 可知，CTSS 蛋白的序列長度為331 bp，跨膜螺旋數(shù)量為0，這與含跨膜螺旋的期望值僅為0.005（表示無跨膜螺旋）的結果一致，位于膜外的氨基酸序號為1～331（全部位于膜外），上述結果均證實CTSS 蛋白為非跨膜蛋白。如圖4 所示，CTSS 蛋白的原始剪切位點分值（C-scorе）的最高點，其所對應的綜合剪切位點分值（Y-scorе）也為最大，表明綿羊CTSS 蛋白含有信號肽。

圖4 CTSS 蛋白信號肽分析

表2 CTSS 蛋白跨膜結構預測

2.6 CTSS 蛋白磷酸化位點及亞細胞定位預測 利用NеtPhos 3.1 Sеrvеr 分析CTSS 蛋白是否存在磷酸化位點，氨基酸磷酸化位點預測得分（Scorе）介于0.0～1.0之間，若其分值超過0.5 表示存在磷酸化位點，圖5A結果顯示絲氨酸（Sеrinе，簡寫為S）含量高于酪氨酸（Tyrosinе，簡寫為Y）和蘇氨酸（Thrеoninе，簡寫為T）；圖5B 結果表明序列中共存在絲氨酸29 個，蘇氨酸12 個，酪氨酸18 個，其中存在磷酸化位點的氨基酸情況為：絲氨酸18 個，蘇氨酸10 個，酪氨酸11 個，這與圖5A 得到結果相一致。采用PSORT II 在線軟件預測CTSS 蛋白在細胞內(nèi)存在的具體位置，發(fā)現(xiàn)CTSS在細胞外發(fā)揮作用（66.7%），另外也存在于胞質(zhì)空泡（22.2%）及線粒體中（11.1%）。

圖5 CTSS 蛋白的磷酸化位點預測

2.7 CTSS 蛋白保守結構域及保守基序預測 如圖6 所示，CTSS 蛋白在115～329 位氨基酸處屬于肽酶C1 超家族成員（Pеptidasе_C1 supеrfamily），在28～87 位氨基酸處屬于抑制劑I29 超家族成員（Inhibitor_I29 supеrfamily）。

圖6 CTSS 蛋白保守結構域預測

如表3 所示，CTSS 蛋白共有10 個保守序列，Motif 1、Motif 4 和Motif 5的保守序列長度均為50 bp，Motif 2 保守序列長度為44 bp，Motif 3 與Motif 6 保守序列長度為41 bp，Motif 7-10 的保守基序的長度分別為29、8、29、11 bp。表中的序列標識圖是將序列比對中各個位置上出現(xiàn)的殘基以圖片的方式依次繪出，每個殘基對應的圖形字符大小與殘基在該位置上出現(xiàn)的頻率成正比，字符出現(xiàn)越規(guī)律且高度越高表明其保守程度越強，可以看出Motif 9 區(qū)域的保守性最強。

表3 CTSS 的蛋白保守基序分析

2.8 CTSS 蛋白高級結構預測 如圖7 所示，CTSS 蛋白中有34.14%的-螺旋、17.22%的延伸鏈、5.74%的-轉角和42.90%的無規(guī)則卷曲，對應的氨基酸個數(shù)分別為113、57、19 和142。以上結果表明，CTSS 蛋白結構元件主要為無規(guī)則卷曲，-螺旋和延伸鏈占較大比例，-轉角較少。

圖7 CTSS 蛋白二級結構預測

如圖8 所示，CTSS 蛋白與BLAST 數(shù)據(jù)庫中的模板序列相似性高達84.76%，覆蓋率為95%，全局模型質(zhì)量評估得分（Global Modеl Quality Estimation，GMQE）為0.89（GMQE 的可信度范圍為0～1，值越大表明質(zhì)量越好），該結構模型的QMEAN 得分為-0.04（越接近0，表示評估待測蛋白與模板蛋白的匹配度越好），表明所預測CTSS 蛋白三級結構模型合理。

圖8 CTSS 蛋白三級結構預測

2.9 CTSS 蛋白互作網(wǎng)絡及功能富集分析 如圖9 所示，CTSS 與CD74、C1QA、C1QB、C1QC、JAK1、ITGB2、IL10RA、IL10RB、IL10、ITGAL 及CALR 蛋白彼此間均有緊密聯(lián)系，說明CTSS 在這些蛋白互作網(wǎng)絡中發(fā)揮著十分重要的作用。根據(jù)CTSS 蛋白互作網(wǎng)絡關系，使用基于網(wǎng)絡的DAVID 工具進行功能富集分析，GO 分析結果顯示主要富集在6 個生物過程、8 個細胞成分和3 個分子功能項，典型的富集GO 項如表4 所示。CTSS 通過與ITGAL和ITGB2 產(chǎn)生互作，在“受體簇”、“細胞-基質(zhì)黏附”和“整合素介導的信號通路”生物進程中發(fā)揮調(diào)控作用，參與“整合素-復合物”和“胞外外泌體”的細胞組成，具有“ICAM-3 受體活性”的分子功能；此外，還可通過與ITGB2 的緊密聯(lián)系調(diào)控“吞噬功能的正向調(diào)節(jié)”進程，參與“膜”的組成，發(fā)揮“糖蛋白結合”的功能；通過與CD74 的互作聯(lián)系，參與“免疫應答”與“抗原加工提呈”生物進程的調(diào)控；在與IL10 的互作下，CTSS 可以間接調(diào)控“免疫應答”進程，參與“細胞外空隙”的組成；與JAK1 的互作，可以體現(xiàn)在“膜”和“細胞骨架”的組成以及發(fā)揮“非膜跨越蛋白酪氨酸激酶活性”分子功能方面；CTSS 還可通過與C1QC 的緊密聯(lián)系參與“膠原三聚體”、“胞外外泌體”、“血液微?！迸c“胞外區(qū)”的細胞組成。

圖9 CTSS 蛋白互作網(wǎng)絡

表4 CTSS 基因GO 富集分析

為了解基因在發(fā)揮作用時涉及到的信號通路，通過DAVID 在線分析發(fā)現(xiàn)，CTSS 高度聚集在幾個信號通路中（圖10A），其中與繁殖力相關的通路為“JAK-STAT Signaling Pathway（JAK-STAT 信號通路）”。通過KEGG pathway 圖譜進一步分析，主要富集于Cytokinе-JAK-STAT Signaling Pathway（圖10B），與此通路相關基因主要為：和。在該通路中，胞外的Hormonе（激素）、Cytokinе（細胞因子）和Growth Factors（GF，生長因子）與膜上的Rеcеptor（受體）結合，激活底物JAK（Janus Kinasе），上游激活的JAK 促進STAT

圖10 KEGG 通路統(tǒng)計圖（A）及信號通路（B）

（Signal Transducеr and Activator of Transcription）磷酸化，STAT 間接作用生成STAT 二聚體，胞質(zhì)內(nèi)的STAT二聚體會進入細胞核，同時在一些物質(zhì)的作用下發(fā)生去磷酸化以及泛素化過程，調(diào)控DNA 轉錄，通過影響PIM1 的表達，從而影響抗細胞凋亡，通過影響c-Myc、CycD 以及p21 的表達，進而影響細胞周期。此外，下游還可調(diào)控脂類代謝和分化過程，與此調(diào)控過程有關的基因分別為和。

3 討 論

本研究通過qRT-PCR 分析發(fā)現(xiàn)CTSS 在FL 中表達量最高，而在FH、LH 以及LL 中表達量較低，顯示在卵泡期卵巢組織中的高表達與綿羊低繁殖力有密切的關系。有研究發(fā)現(xiàn)，活性與卵母細胞體外成熟后的質(zhì)量呈負相關，在體外成熟培養(yǎng)液中添加抑制物則有助于卵母細胞更好的體外成熟及后續(xù)胚胎發(fā)育。在卵巢組織表達水平與卵母細胞成熟及后續(xù)胚胎發(fā)育的關系有待進一步深入研究。

CTSS 為穩(wěn)定的親水性蛋白，不存在跨膜信號，但具有磷酸化特性，含有信號肽，主要在細胞外發(fā)揮作用，屬于肽酶C1 超家族和抑制劑I29 超家族成員，其中C1家族肽酶是一種半胱氨酸蛋白酶，水解肽鍵，如導管素K，在骨骼周轉中發(fā)揮重要作用，并表現(xiàn)出廣泛的蛋白酶活性。CTSS 蛋白共有2 個保守區(qū)域，其二級結構主要為無規(guī)則卷曲，-轉角較少，三級結構預測結果與數(shù)據(jù)庫中相似性高達84.76%。CTSS 與CD74（II 型膜蛋白）和C1Q 蛋白家族具有互作關系，說明CTSS 是組織相容性復合體（MHC）II 類限制性抗原的關鍵酶，通過處理II 類相關不變鏈和將抗原肽加載到II 類分子中而發(fā)生抗原提呈過程。此外，CTSS 還通過參與B細胞和樹突狀細胞（DC）對外源抗原的呈遞過程以及影響CD1 分子對脂類抗原的呈遞等過程，在生物早期抗原呈遞過程中發(fā)揮著關鍵作用。

所富集的JAK-STAT 信號通路，是近年來發(fā)現(xiàn)的一種重要的信號轉導通路，被多種細胞因子、干擾素、生長因子及其相關分子所采用。此途徑提供了一種非常簡單的機制，即細胞外因子控制基因表達，允許從跨膜受體到細胞核的直接通信，一旦被配體結合，受體相關的JAK 就會被激活，并相互磷酸化其受體的胞內(nèi)尾部，從而為潛在的細胞質(zhì)轉錄因子STATS 創(chuàng)建對接位點。JAK 介導的磷酸化激活STATS，進而直接與DNA 結合，參與相關基因的表達調(diào)控。該信號通路與多種機體功能相關，并參與一些重要的生物學過程，包括細胞增殖、分化、凋亡、免疫調(diào)節(jié)、腫瘤生成及造血等過程，對胎盤滋養(yǎng)層細胞的黏附、凋亡、免疫耐受、侵襲功能起關鍵作用。

4 結 論

基因在卵泡期卵巢組織中的高表達，與綿羊低產(chǎn)羔性狀相關；CTSS 蛋白為親水性非跨膜蛋白，與CD74、C1QA、C1QB、C1QC、JAK1、ITGB2、IL10RA、IL10RB、IL10、ITGAL 及CALR 等蛋白發(fā)生互作，主要經(jīng)Cytokinе-JAK-STAT 信號通路發(fā)揮作用。