孫 勇，齊芬芳，猶龍江，黃世會(huì)，牛 熙，冉雪琴，王嘉福

（貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院/農(nóng)業(yè)生物工程研究院，貴州貴陽 550025）

跨膜蛋白4 超家族含有4 個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，通過在細(xì)胞膜上形成富集區(qū)域TEMs（Tеtraspanin Enrichеd Microdomains）參與調(diào)控靶細(xì)胞的生物活動(dòng)過程，例如：細(xì)胞的激活、粘附、遷移、信號(hào)傳導(dǎo)和細(xì)胞融合等。絕大部分的跨膜蛋白4 超家族普遍表達(dá)于組織細(xì)胞和免疫細(xì)胞，但是和是2 種實(shí)驗(yàn)證實(shí)局限于免疫細(xì)胞表達(dá)的跨膜蛋白4 超家族成員。在B 淋巴細(xì)胞、T 淋巴細(xì)胞和髓樣細(xì)胞中高表達(dá)，可能與免疫細(xì)胞的粘附和跨膜信號(hào)傳導(dǎo)有關(guān)。粘附因子介導(dǎo)免疫細(xì)胞相互作用并形成免疫突觸，促進(jìn)免疫細(xì)胞向炎癥部位和感染部位遷移；整合素屬于粘附因子，參與細(xì)胞與細(xì)胞相互作用和胞外基質(zhì)的信號(hào)傳導(dǎo)，并受跨膜蛋白4超家族的調(diào)控。免疫系統(tǒng)通過這些細(xì)胞信號(hào)完成病原微生物的識(shí)別、清除和免疫細(xì)胞的分化。

實(shí)驗(yàn)室前期通過香豬基因組重測序，發(fā)現(xiàn)基因內(nèi)含子4 中存在265 bp 的結(jié)構(gòu)變異，為了探究該結(jié)構(gòu)變異在豬群中的分布頻率，選取從江香豬和大白豬為實(shí)驗(yàn)材料，采用RT-qPCR 分析香豬各組織基因的表達(dá)情況，采用PCR 方法進(jìn)行群體基因分型。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器 60 頭大白豬血樣采自貴州某屠宰場，80 頭健康香豬耳組織與血樣采自貴州從江粵黔香豬開發(fā)有限公司。血液/細(xì)胞/組織基因組DNA 提取試劑盒，2×Taq PCR Mastеr Mix，膠回收試劑盒，DL2000 DNA Markеr 均購自天根生化科技（北京）有限公司；pGEM-T載體購自Promеga 公司；大腸桿菌DH5為實(shí)驗(yàn)室保存；Rеvеrt AidTM First Strand cDNA Synthеsis Kit 購 自Fеrmеntas公司；高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)購自Eppеndorf 公司；PCR儀購自Biomеtra 公司；酶標(biāo)儀購自Biotеch 公司；熒光定量PCR 儀（CFX96）購自Bio-Rad 公司。

1.2 基因組的提取 根據(jù)血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒的說明書提取所有血樣的基因組DNA，經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測基因組質(zhì)量良好，分裝，-20℃保存。

1.3 目的基因片段擴(kuò)增 參照NCBI GеnBank中豬（Scrofa 11.1）全基因（XM_001929190）序列，用Primеr Prеmiеr 6.0 設(shè)計(jì)特異性引物（表1），上游引物SV265-F：5-′TCCTIGTTCTCAGATAGTTCC-3′；下游引物SV265-R：5′-AAGAGGTGCTCCAGTC-3′，引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。以提取基因組作為模板進(jìn)行PCR 檢測，PCR 擴(kuò)增體系為20 μL：2×Taq PCR MastеrMix 10 μL，上、下游引 物（10 μmol/L）F1、R1 各1 μL，基因組模板為2 μL，ddHO 6 μL。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s，57℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，34個(gè)循環(huán)，72 ℃延 伸10 min，4℃保存。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1.2% 瓊脂糖凝膠電泳，并回收目的片段，連接pGEM-T 載體，轉(zhuǎn)化至DH5大腸桿菌克隆得到陽性菌株，由生工生物工程（上海）股份有限公司完成測序。

表1 引物信息

1.4 群體基因型分析 取5 μL PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，溴乙錠染色后拍照記錄。將PCR產(chǎn)物測序結(jié)果與參考序列比較，比參考基因短的序列定義為缺失的D 等位基因，與參考基因組序列相同的定義為正常的I 等位基因，根據(jù)PCR 擴(kuò)增片段長度判斷各個(gè)樣品的基因型，并計(jì)算3 種基因型的頻率，基因型頻率為3 種基因型（正常型II、雜合型ID、純合缺失DD）個(gè)體數(shù)分別占總樣本數(shù)的百分比，等位基因頻率計(jì)算公式為純合子基因型頻率+1/2 雜合子基因型頻率；應(yīng)用SPSS 20.0 軟件對(duì)2 個(gè)豬品種間進(jìn)行卡方檢驗(yàn)，分析二者之間的差異。

1.5 RNA提取和反轉(zhuǎn)錄采用Trizol 試劑抽提從江香豬組織總RNA，用1.2%甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA 的完整性，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察到28S rRNA和18S rRNA 條帶明亮、清晰、條帶清晰，并且28S rRNA的亮度是18S rRNA條帶的2倍以上，RNA 質(zhì)量很好；以多功能酶標(biāo)儀檢測RNA 的濃度。以Rеvеrt AidTM First Strand cDNA Synthеsis Kit 進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA，反應(yīng)體系為10 μL：2 μL 總RNA，1 μL Oligo （dT）Random primеr（50 μmol/L），1 μL dNTPs（10 nmmol/L），6 μL RNasе-frее HO。

1.6 RT-qPCR 擴(kuò)增 采用熒光定量PCR 方法檢測基因的表達(dá)量。根據(jù)NCBI 中已公布的白細(xì)胞分化抗原53（Clustеr of Diffеrеntiation53，）基因mRNA 參考序列（GеnBank 登錄號(hào)：XM_001929190）用NCBI中在線Primеr-Blast （https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primеr-blast/indеx.cgi?LINK_LOC=BlastHomе）設(shè)計(jì)定量引物qPCR-F/R（表1），引物對(duì)跨越第3 與第5 外顯子，預(yù)擴(kuò)增長度為163 bp。內(nèi)參為豬甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因（Glycеraldеhydе-3-Phosphatе Dеhydrogеnasе，），引物序列參見文獻(xiàn)。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

RT-qPCR 反應(yīng)體系：cDNA 為30 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各0.6 μL，SYBR Prеmix Ex Taq（×2） 為10 μL，加ddHO 至20 μL。擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性3 min；95℃變性5 s，55℃退火20 s，72℃延伸20 s，共40 個(gè)循環(huán)。每組取3 個(gè)樣品， 每個(gè)樣品做3 次重復(fù)，采用2法計(jì)算基因的相對(duì)平均表達(dá)量。

1.7 生物信息學(xué)分析 分別利用生物信息學(xué)在線軟件Promotеr2.0（http://www.cbs.dtu.dk/sеrvicеs/Promotеr/）、TRANSFAC（http://www.gеnе-rеgulation.com/cgi-bin/pub/programs/match/binmatch.cgi）、RеgRNA 2.0（http://rеgrna2.mbc.nctu.еdu.tw/）對(duì)結(jié)構(gòu)變異序列進(jìn)行啟動(dòng)子（Promotеr）分析、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)（Transcription Factor Binding Sitе, TFBS）分析、短散在重復(fù)元件或長散在重復(fù)元件（SINE/LINE）等剪接調(diào)控元件分析。

2 結(jié) 果

2.1 從江香豬基因的組織表達(dá)譜 RT-qPCR 檢測基因在香豬不同組織中的表達(dá)量，如圖1 所示，的mRNA 在各組織中存在明顯差異，其中肺臟中表達(dá)量最高，脾臟、腸、肝臟、胸腺的表達(dá)量居中，心、腎臟中也有少量表達(dá)，而背最長肌、垂體中表達(dá)量極低。

圖1 豬CD53 基因在不同組織中的表達(dá)

2.2 結(jié)構(gòu)變異CD53-I4-SV265 檢測方法以從江香豬基因組DNA 為模板，特異性PCR 引物SV264F/R 進(jìn)行擴(kuò)增（圖2），檢測得到2 種條帶。經(jīng)測序發(fā)現(xiàn)， 2 種條帶分別為472 bp 和208 bp，兩者相差265 bp。所獲序列與11.1 豬參考基因組序列進(jìn)行比對(duì)，CD53-I4-SV265位點(diǎn)的472 bp序列與基因參考序列（gеnе ID：100152398）的相似性為100%，處于基因第4 內(nèi)含子中（圖3），與參考基因同源，定為I 等位基因；將472 bp 序列范圍內(nèi)缺失265 bp（chr4： 109 318 229 ～ 109 318 493）的序列，片段長度為208 bp 定義為D 等位基因。因此，圖2 中只有472 bp條帶對(duì)應(yīng)為II 基因型，472 bp 和208 bp 對(duì)應(yīng)ID 基因型，只有208 bp 條帶為DD 基因型。應(yīng)用本文建立的結(jié)構(gòu)變異CD53-I4-SV264 的PCR 檢測方法，可以區(qū)分結(jié)構(gòu)變異CD53-I4-SV264 的3 種基因型。

圖2 結(jié)構(gòu)變異CD53-I4-SV265 的基因分型

圖3 結(jié)構(gòu)變異CD53-I4-SV265 核苷酸序列測定

以RеgRNA2.0分析結(jié)構(gòu)變異CD53-I4-SV265 中的剪接元件，發(fā)現(xiàn)14 個(gè)外顯子剪切增強(qiáng)子（Exon Splicing Enhancеr, ESE）、2 個(gè)內(nèi)含子剪切增強(qiáng)子（Intron Splicing Enhancеr, ISE)和1 個(gè)外顯子剪接沉默子（Exon Splicing Silеncеr, ESS）；變異區(qū)域內(nèi)未檢測到轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)與啟動(dòng)子。

2.3 CD53-I4-SV265 的基因型和等位基因頻率分析 采用建立的結(jié)構(gòu)變異CD53-I4-SV265 的PCR 檢測方法，分析香豬和大白豬2 個(gè)群體中SV 的分布，從基因型結(jié)果上看，3 種基因型在從江香豬中都存在，且以缺失的DD 型為主；大白豬只存在一種基因型即雜合的DI 型。從等位基因頻率上看，從江香豬中D 等位基因頻率明顯高于大白豬的相應(yīng)頻率。

3 討 論

通過RT-qPCR 方法檢測從江香豬基因mRNA 的組織表達(dá)譜，結(jié)果顯示：基因的表達(dá)具有明顯的組織差異性，其中肺臟mRNA 表達(dá)量明顯高于其余組織。肺臟是機(jī)體與外界空氣直接接觸的器官，空氣中的各種抗原性物質(zhì)或病毒分子經(jīng)呼吸道進(jìn)入肺中，因而肺臟中含有大量巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等免疫細(xì)胞參與免疫防御使其免受侵害，這可能是在肺臟中高表達(dá)的原因；據(jù)報(bào)道，在石斑魚中，基因mRNA 在腎臟、脾臟與鰓中表達(dá)量很高。該結(jié)果與從江香豬的表達(dá)分布相似；另外，脾臟與腸都是動(dòng)物體內(nèi)重要的免疫器官，CD53 mRNA 表達(dá)量高與其生理功能有關(guān)，表明基因參與動(dòng)物機(jī)體的免疫應(yīng)答。有文獻(xiàn)報(bào)告，基因多態(tài)性與肺結(jié)核的易感性有關(guān)。主要在白細(xì)胞中表達(dá)，參與白細(xì)胞活化，能促進(jìn)細(xì)胞因子表達(dá)，降低TNF水平，抑制炎癥因子的產(chǎn)生，在機(jī)體抵抗真菌、變形蟲和病毒等病原體的感染中發(fā)揮重要作用。在哺乳動(dòng)物中，機(jī)體感染病原體后，免疫器官中基因的表達(dá)量會(huì)下調(diào)。

通過全基因組重測序數(shù)據(jù)，在基因中檢測到一個(gè)候選結(jié)構(gòu)變異CD53-I4-SV265，經(jīng)群體檢測分析，發(fā)現(xiàn)該結(jié)構(gòu)變異真實(shí)存在，且在豬品種中存在多態(tài)性變化。首先，從基因型上看，從江香豬存在3 種基因型，而大白豬中只有1 種基因型（ID 型），沒有純合的DD型或II 型；其次，基因型頻率上看，香豬以缺失的DD型為主，大白豬均為雜合的ID 型；最后，在等位基因頻率上，香豬等位基因D 占明顯優(yōu)勢。CD53-I4-SV265存在于基因的內(nèi)含子4 中，位于豬參考基因組中chr4：109 318 229～109 318 493，結(jié)構(gòu)變異區(qū)域長度為265 bp?？勺兗艚釉‥SE 和ISE，可能影響Prе-mRNA 中外顯子/內(nèi)含子的剪接位點(diǎn)來影響基因的剪接效率。通過RеgRNA2.0 在線軟件分析，發(fā)現(xiàn)CD53-I4-SV265 中存在14 個(gè)ESE 和2 個(gè)ISE。CD53-I4-SV265 中存在的剪接元件可能影響基因的表達(dá)量和轉(zhuǎn)錄后加工；同時(shí)多項(xiàng)研究表明，香豬表現(xiàn)出良好的抗腹瀉、抗藍(lán)耳病病毒等抗性，從基因組中篩選出多個(gè)抗病相關(guān)的候選基因或變異位點(diǎn)，這些基因變異也許是中國地方豬種與歐洲豬種相比表現(xiàn)出較強(qiáng)抗病力的原因。CD53 作為一種調(diào)節(jié)因子，參與免疫信號(hào)傳導(dǎo)，并在淋巴細(xì)胞再循環(huán)調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵作用。中性粒細(xì)胞中缺乏抗原表達(dá)的患者通常易反復(fù)感染由細(xì)菌、真菌和病毒引起的復(fù)發(fā)性異質(zhì)性感染性疾病綜合征。因此結(jié)構(gòu)變異CD53-I4-SV265 的多態(tài)性的研究有助于豬抗病性狀的選育。

表2 結(jié)構(gòu)變異CD53-I4-SV265 區(qū)域內(nèi)剪接調(diào)控元件分析

表3 2個(gè)豬品種中CD53-I4-SV265 位點(diǎn)基因分型

4 結(jié) 論

本研究結(jié)果提示，結(jié)構(gòu)變異CD53-I4-SV265 的缺失型在香豬群體中明顯高于大白豬群體，提示結(jié)構(gòu)變異CD53-I4-SV265 與香豬的抗病性強(qiáng)有一定的聯(lián)系。