李曉楠　王云　王喆　劉小莉　吳寒　周劍忠　夏秀東

摘要： 為提高大腸桿菌異源表達(dá)β-葡萄糖苷酶的底物可及性，本研究以大腸桿菌BL21（DE3）為宿主細(xì)胞，使用信號(hào)肽OprI、OsmY、PelB、OmpA將納豆芽孢桿菌的β-葡萄糖苷酶基因bglH錨定到大腸桿菌BL21（DE3）外膜和周質(zhì)上。然后使用啟動(dòng)子T7、Trc、LacUV5誘導(dǎo)表達(dá)Ⅱ型分泌途徑的SecB伴侶蛋白，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)全細(xì)胞催化糖苷型底物水解。本研究通過表征不同細(xì)胞定位的β-葡萄糖苷酶活性，發(fā)現(xiàn)信號(hào)肽PelB分泌效果明顯高于其他信號(hào)肽，LacUV5啟動(dòng)子與SecB伴侶蛋白組合表達(dá)bglH的重組菌株全細(xì)胞催化酶活性最高。此外，添加甘氨酸至質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.0%時(shí)，全細(xì)胞催化β-葡萄糖苷酶活性最高。并且通過優(yōu)化誘導(dǎo)條件確定了β-葡萄糖苷酶的最優(yōu)發(fā)酵條件：初始細(xì)胞密度（OD600）為1.0，發(fā)酵溫度為25 ℃，發(fā)酵時(shí)間為24 h，發(fā)酵pH為6.5，最終全細(xì)胞催化β-葡萄糖苷酶活性可達(dá)2.55 U/ml。

關(guān)鍵詞： β-葡萄糖苷酶;分泌表達(dá);信號(hào)肽;伴侶蛋白SecB

中圖分類號(hào)： Q78 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A 文章編號(hào)： 1000-4440（2022）01-0223-09

Abstract： To enhance the substrate accessibility of heterologous expression of β-glucosidase in Escherichia coli， E. coli BL21 （DE3） was used as the host cell in this study. β-glucosidase related gene （bglH） of Bacillus natto was anchored to the outer membrane and periplasm of E. coli BL21 （DE3） by using different signal peptides （OprI， OsmY， PelB， OmpA）. Different promoters （T7， Trc， LacUV5） were used to induce the expression of SecB chaperonin in type Ⅱ secretory pathway to realize the hydrolysis of glycoside-type substrate from the aspect of whole-cell catalysis. Through representation of the activities of β-glucosidase located in different cells， it was found that the secretion effect of signal peptide PelB was obviously higher than other signal peptides， and in the recombinant strain which combined LacUV5 promoter and SecB chaperonin to express bglH， the whole-cell catalytic enzyme activity was the highest. In addition， activity of β-glucosidase was the highest under the condition of whole-cell catalysis when the mass fraction of glycine in the solution was 1.0%. The optimum conditions for β-glucosidase fermentation were determined through optimizing the induction conditions， which were as follows： the initial cell density （OD600） was 1.0， the fermentation temperature was 25 ℃， the fermentation time was 24 h and the fermentation pH was 6.5. Under these conditions， activity of β-glucosidase from the aspect of whole-cell catalysis can reach 2.55 U/ml.

Key words： β-glucosidase;secretory expression;signal peptides;chaperonin SecB

糖苷是天然產(chǎn)物的重要組成成分，具有多種重要的生理活性，有些糖苷通過水解生成苷元（如槲皮素、京尼平和稀有人生皂苷等[1-2]），可以產(chǎn)生更好的藥理活性。β-葡萄糖苷酶（BGL）是纖維素類水解酶，可水解末端、非還原性的烴基-β-葡萄糖苷或芳香基-β-葡萄糖苷的β-D-糖苷鍵，釋放出β-葡萄糖和相應(yīng)的配基[3]。β-葡萄糖苷酶對(duì)糖苷的水解有關(guān)鍵作用，工業(yè)上通過向糖苷水解系統(tǒng)中添加β-葡萄糖苷酶來提高糖苷的水解效率[4]。糖苷類化合物轉(zhuǎn)化方法包含商品酶催化、微生物轉(zhuǎn)化和酸水解。目前，從植物中很難直接純化得到大量的β-葡萄糖苷酶，并且純化蛋白質(zhì)生產(chǎn)成本高[5]，產(chǎn)生β-葡萄糖苷酶能力強(qiáng)的野生型菌株不易獲取，而異源表達(dá)系統(tǒng)的建立能夠有效解決這個(gè)問題，該系統(tǒng)反應(yīng)條件溫和、操作簡(jiǎn)單、成本低、污染少，因此常用基因工程手段進(jìn)行異源表達(dá)，實(shí)現(xiàn)外源蛋白質(zhì)的高效表達(dá)，有利于降低生產(chǎn)成本[6]。由于全細(xì)胞可保護(hù)酶免受外界環(huán)境的影響，且無需添加任何輔因子或酶，因此全細(xì)胞催化已經(jīng)逐漸替代粗酶或純酶廣泛應(yīng)用于目標(biāo)產(chǎn)物的生物合成中[7]。大腸桿菌具有遺傳背景清楚、表達(dá)周期短、操作簡(jiǎn)單、轉(zhuǎn)化效率高等優(yōu)點(diǎn)，常用于外源蛋白質(zhì)的表達(dá)[8]。但是，由于大腸桿菌缺乏有效的分泌系統(tǒng)、細(xì)胞質(zhì)空間有限，外源蛋白質(zhì)的大量表達(dá)會(huì)聚集形成包涵體，而且胞內(nèi)蛋白質(zhì)種類多，含量大，破碎后的純化步驟極易造成目的蛋白質(zhì)的損失[9-10]。研究結(jié)果表明，胞外蛋白質(zhì)種類和蛋白酶較少，一般情況下可直接純化得到高純度、穩(wěn)定的目的蛋白質(zhì)[11]。盧俊文[12]將丙酮酸氧化酶基因在大腸桿菌中分別進(jìn)行胞內(nèi)和分泌表達(dá)，發(fā)現(xiàn)丙酮酸氧化酶分泌表達(dá)酶活性比胞內(nèi)表達(dá)提高了61%。細(xì)胞循環(huán)發(fā)酵已被證明可以提高菌株生產(chǎn)效率，降低生產(chǎn)成本，通過向發(fā)酵罐中連續(xù)添加底物可使目標(biāo)蛋白質(zhì)分泌表達(dá)菌株連續(xù)生產(chǎn)[13]。目前工程菌表達(dá)的糖苷酶多是胞質(zhì)酶，但糖苷型底物難以進(jìn)入胞內(nèi)與酶結(jié)合，因此糖苷酶的可及性差，難以實(shí)現(xiàn)全細(xì)胞高效催化[14-16]。因此，研究β-葡萄糖苷酶的胞外分泌表達(dá)，有利于提高酶和糖苷型底物的可及性，提高全細(xì)胞催化效率。

Ⅱ型分泌系統(tǒng)是分泌表達(dá)外源蛋白質(zhì)的常用方法，該系統(tǒng)利用信號(hào)肽介導(dǎo)外源蛋白質(zhì)至周質(zhì)空間，再透過外膜至培養(yǎng)基中實(shí)現(xiàn)分泌[17]。SecB途徑是Ⅱ 型分泌途徑的一種亞途徑，SecB途徑通過轉(zhuǎn)運(yùn)信號(hào)肽（PelB、OmpA等）幫助蛋白質(zhì)定位[18-19]。SecB是一種特殊的伴侶蛋白質(zhì)，當(dāng)前體蛋白質(zhì)被翻譯后，含有信號(hào)肽的蛋白質(zhì)前體跨過內(nèi)膜之前與SecB蛋白結(jié)合，阻止前體蛋白質(zhì)自我折疊，使其轉(zhuǎn)移至周質(zhì)空間后進(jìn)行折疊[20]。本研究選用來自枯草納豆芽孢桿菌B.N.K的具有高異黃酮糖苷水解活性的2個(gè)β-葡萄糖苷酶基因bglH（基因ID：64305721）和yckE（基因ID：17139092）為研究對(duì)象，將大腸桿菌Ⅱ型分泌途徑中的信號(hào)肽序列添加到β-葡萄糖苷酶N端，通過測(cè)定全細(xì)胞蛋白質(zhì)、胞內(nèi)蛋白質(zhì)、周質(zhì)空間蛋白質(zhì)的表達(dá)量和酶活性衡量β-葡萄糖苷酶跨膜表達(dá)效果，除此之外，考察伴侶分子SecB的表達(dá)對(duì)蛋白質(zhì)內(nèi)膜轉(zhuǎn)運(yùn)的影響，通過添加甘氨酸及優(yōu)化發(fā)酵條件提高β-葡萄糖苷酶的分泌表達(dá)，提高β-葡萄糖苷酶與糖苷型底物的可及性，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)糖苷型異黃酮向苷元型異黃酮的高效轉(zhuǎn)化。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)所用的枯草納豆芽孢桿菌B.N.K菌株由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 試劑與儀器

試劑：胰蛋白胨、酵母提取物、瓊脂、氯化鈉、氯霉素、氨芐青霉素、鏈霉素、丙三醇由南京壽德有限公司生產(chǎn)，基因組提取試劑盒由天根生化科技（北京）有限公司生產(chǎn);SanPrep柱式質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒、SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒、PCR引物由生工生物工程（上海）股份有限公司生產(chǎn); DNA Marker，瓊脂糖，Taq DNA聚合酶（TaKaRa公司產(chǎn)品）;Goldview I 型核酸染色劑由北京索萊寶科技有限公司生產(chǎn)。

儀器：DSX-280B 型壓力蒸汽滅菌器由上海申安醫(yī)療器械廠生產(chǎn); W-CJ-2G型超凈工作臺(tái)、LRH-150型生化培養(yǎng)箱由德國 Sartorius生產(chǎn);3K15型高速冷凍離心機(jī)由美國 Sigma生產(chǎn); WH-3型漩渦混合儀由上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司生產(chǎn);PCR儀、GelDocEQ 型凝膠成像儀和蛋白質(zhì)電泳儀由BIO-RAD公司生產(chǎn);恒溫水浴鍋由常州國華電器有限公司生產(chǎn);One Drop OD-2000分光光度計(jì)由南京五義科技有限公司生產(chǎn)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 β-葡萄糖苷酶的表達(dá)與發(fā)酵

1.3.1.1 β-葡萄糖苷酶基因重組質(zhì)粒的構(gòu)建 以枯草納豆芽孢桿菌B.N.K菌株的基因組DNA作為模板，通過同源臂引物bglH-F和bglH-R擴(kuò)增bglH基因，通過yckE-F和yckE-R擴(kuò)增yckE基因，引物序列見表1。使用同源重組酶將擴(kuò)增產(chǎn)物與經(jīng)Bam HⅠ和NcoⅠ酶切的載體PACYCDuet-1連接，得到重組質(zhì)粒A-bglH、A-yckE，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21（DE3）獲得重組菌株，分別命名為BglH、YckE。

1.3.1.2 納豆芽孢桿菌來源的β-葡萄糖苷酶的定位研究 將50 μl的樣品與50 μl 5 mmol/L pNPG在100 mmol/L的磷酸鈉緩沖液（pH 6.0）中混合，37 °C下孵育10 min，用Na2CO3終止反應(yīng)，測(cè)量405 nm處的吸光度。1個(gè)酶活性的單位定義為1 min釋放1 μmol對(duì)硝基苯酚的酶量。直接測(cè)定得到的發(fā)酵液上清液β-葡萄糖苷酶酶活性即為胞外β-葡萄糖苷酶酶活性;將細(xì)胞懸浮于200 μl 30 mmol/L Tris-HCl溶液中，冰浴30 min后離心，上清液即為周質(zhì)空間組分;將離心得到的細(xì)胞懸浮于400 μl的25 mmol/L Tris-HCl和150 mmol/L NaCl緩沖液中進(jìn)行超聲破碎，離心取上清液即為細(xì)胞質(zhì)組分;離心得到的不溶物質(zhì)即為細(xì)胞沉淀組分。

1.3.1.3 重組β-葡萄糖苷酶的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）檢測(cè) 按照方法1.3.1.2的方法制備不同組分的樣品，分別取200 μl的樣品，加入等體積的2×SDS上樣緩沖液，沸水浴處理10 min，4 ℃ 12 000 r/min離心5 min，取上清液進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)。

1.3.2 不同的信號(hào)肽與BglH的融合表達(dá) 以A-BglH為模板，用表1中的引物通過PCR的方法將信號(hào)肽PelB、OmpA、OprI和OsmY融合到BglH的N端，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物使用限制性核酸內(nèi)切酶（Dpn Ⅰ）處理1 h后，將膠回收產(chǎn)物進(jìn)行末端磷酸化，磷酸化產(chǎn)物使用Soution Ⅰ DNA連接酶連接，獲得重組質(zhì)粒A-ompA-bglH、A-oprI-bglH、A-osmY-bglH和A-pelB-bglH，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21（DE3）即得重組菌株，分別命名為PelB-BglH、OmpA-BglH、OprI-BglH、OsmY-BglH。按照1.3.1.2和1.3.1.3的方法對(duì)其進(jìn)行酶活性測(cè)定以及SDS-PAGE檢測(cè)。

1.3.3 SecB伴侶蛋白在不同啟動(dòng)子質(zhì)粒下的表達(dá) 將A-pelB-bglH片段和線性化的PACYCDuet-1載體在16 ℃用T4連接酶連接過夜，以獲得A-T7-pelB-bglH，通過PCR獲得Trc啟動(dòng)子，與線性化的A-pelB-bglH連接獲得A-Trc-pelB-bglH。以大腸桿菌BL21（DE3）基因組作為模板，擴(kuò)增得到secB基因，將其與線性化A-Trc-pelB-bglH質(zhì)粒在16 ℃下用T4連接酶連接過夜，以獲得A-Trc-pelB-bglH-T7-secB。將PCR獲得的Trc啟動(dòng)子與線性化A-Trc-pelB-bglH連接獲得重組質(zhì)粒A-Trc-pelB-bglH-Trc-secB，用同樣的方法構(gòu)建重組質(zhì)粒A-Trc-pelB-bglH-LacUV5-secB。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21（DE3）即得重組菌株Trc-PelB-BglH、Trc-PelB-BglH-T7-SecB、Trc-PelB-BglH-Trc-SecB、Trc-PelB-BglH-LacUV5-SecB。按照1.3.1.2的方法對(duì)其進(jìn)行酶活性測(cè)定。

1.3.4 甘氨酸對(duì)分泌表達(dá)的影響 在方法1.3.3的基礎(chǔ)上，挑取含有重組A-Trc-pelB-bglH-LacUV5-secB單菌落接種于LB培養(yǎng)基（含50 μg/ml氯霉素抗生素）中，37 ℃ 200 r/min培養(yǎng)過夜。將種子液以1%接種量接種于含氯霉素的LB液體培養(yǎng)基中，在37 ℃ 200 r/min的條件下，培養(yǎng)至初始細(xì)胞密度（OD600）達(dá)到0.45～0.55時(shí)，加入0.1 mmol/L異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，同時(shí)加入甘氨酸至最終質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.5%、1.0%、1.5%、2.0%。在25 ℃、100 r/min的條件下誘導(dǎo)24 h后測(cè)定全細(xì)胞酶活性、全細(xì)胞破碎上清液酶活性以及OD600。

1.3.5 發(fā)酵條件優(yōu)化 在方法1.3.4的基礎(chǔ)上，研究誘導(dǎo)時(shí)初始細(xì)胞密度OD600（0.5、0.8、1.0、1.5、2.0）、誘導(dǎo)時(shí)間（12 h、18 h、24 h、36 h，添加誘導(dǎo)劑IPTG時(shí)為0 h）、誘導(dǎo)溫度（15 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃）以及初始pH（5.5、6.0、6.5、7.0、7.5）對(duì)β-葡萄糖苷酶分泌表達(dá)的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 β-葡萄糖苷酶工程菌的表達(dá)

2株重組菌的全細(xì)胞蛋白質(zhì)以及胞外蛋白質(zhì)的SDS-PAGE結(jié)果如圖1A所示，重組大腸桿菌BglH和YckE中β-葡萄糖苷酶主要存在于細(xì)胞質(zhì)中，胞外組分中幾乎觀察不到目標(biāo)蛋白質(zhì)。如圖1B所示，在細(xì)胞質(zhì)組分中，重組大腸桿菌BglH和YckE的β-葡萄糖苷酶酶活性分別可達(dá)到5.33 U/ml和4.17 U/ml。而在發(fā)酵液上清液中并未檢測(cè)到葡萄糖苷酶活性。這一結(jié)果表明，重組大腸桿菌BglH、YckE中β-葡萄糖苷酶主要存在于細(xì)胞內(nèi)部，屬于胞質(zhì)酶，并沒有分泌到細(xì)胞外與糖苷型底物充分結(jié)合。對(duì)重組大腸桿菌BglH和YckE的破胞粗酶液進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)重組大腸桿菌BglH的β-葡萄糖苷酶酶活性略高于YckE，可達(dá)到12 U/ml，說明重組大腸桿菌BglH的水解糖苷能力高于YckE。 Kuo等[21]也發(fā)現(xiàn)BglH在水解糖苷型異黃酮方面比YcKE更加有效，BglH更適用于異黃酮去糖基化。此外，利用上述菌株的粗提液進(jìn)行全細(xì)胞催化，在重組大腸桿菌BglH和YckE中均檢測(cè)到少量的β-葡萄糖苷酶活力，但是重組大腸桿菌BglH的β-葡萄糖苷酶酶活性略高于YckE，說明重組大腸桿菌BglH更能有效地進(jìn)行全細(xì)胞催化，因此選用BglH進(jìn)行后續(xù)研究。

2.2 不同信號(hào)肽對(duì)β-葡萄糖苷酶分泌表達(dá)的影響

信號(hào)肽是輔助前體蛋白質(zhì)折疊以及前體蛋白質(zhì)跨膜的重要元件，對(duì)于異源蛋白質(zhì)的分泌表達(dá)效率及產(chǎn)量具有重要影響，篩選信號(hào)肽可以實(shí)現(xiàn)異源蛋白質(zhì)的高效表達(dá)以及提高目的蛋白質(zhì)的產(chǎn)量[22]。

本研究從信號(hào)肽OprI、OsmY、PelB、OmpA中進(jìn)行篩選。如圖2所示，融合蛋白OprI-BglH、OsmY-BglH絕大部分在胞內(nèi)以沉淀的形式存在，泳道2、泳道5的沉淀中大部分為目標(biāo)蛋白質(zhì)。這是因?yàn)棣?葡萄糖苷酶在大腸桿菌中高水平表達(dá)時(shí)，其表達(dá)蛋白會(huì)折疊不正確而形成無天然活性的包涵體，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)無法利用，降低了該酶的產(chǎn)量和利用率[23-24]。而泳道1、泳道4細(xì)胞周質(zhì)組分和泳道3、泳道6細(xì)胞質(zhì)組分中幾乎無目標(biāo)蛋白質(zhì)。融合蛋白PelB-BglH、OmpA-BglH多以可溶狀態(tài)存在，主要存在于細(xì)胞質(zhì)組分中，在細(xì)胞周質(zhì)中觀察到少量目標(biāo)蛋白質(zhì)。

以未與信號(hào)肽融合表達(dá)的BglH菌株作為對(duì)照，對(duì)不同的信號(hào)肽OprI、OsmY、PelB、OmpA與BglH共表達(dá)的重組菌株各組分的酶活性進(jìn)行測(cè)定，如圖3A所示，信號(hào)肽OprI、OsmY表達(dá)后在細(xì)胞周質(zhì)和發(fā)酵液上清液中未檢測(cè)到葡萄糖苷酶活性，說明OprI、OsmY的表達(dá)并未將葡萄糖苷酶錨定到膜上與底物之間進(jìn)行充分結(jié)合。沙沖[25]將OsmY與脂肪酶融合表達(dá)，經(jīng)過細(xì)胞定位分析，發(fā)現(xiàn)該融合蛋白存在于細(xì)胞質(zhì)中，而非定位于細(xì)胞表面或分泌到細(xì)胞外，說明OsmY信號(hào)肽的適用蛋白需要進(jìn)一步甄別。如圖3B所示，由OprI、OsmY與BglH共表達(dá)后的全細(xì)胞催化酶活性遠(yuǎn)低于對(duì)照組，根據(jù)圖2的電泳結(jié)果推測(cè)這2個(gè)信號(hào)肽形成了包涵體，從而導(dǎo)致酶活性下降。對(duì)于信號(hào)肽PelB、OmpA與BglH共表達(dá)的重組菌株，細(xì)胞質(zhì)組分中的酶活性均有下降，且在細(xì)胞周質(zhì)和發(fā)酵液上清液中都檢測(cè)到了較低的葡萄糖苷酶活性，這說明PelB、OmpA的表達(dá)能使β-葡萄糖苷酶分泌到細(xì)胞周質(zhì)中，進(jìn)一步分泌到細(xì)胞外。如圖3B所示，全細(xì)胞催化的結(jié)果與對(duì)照組相比，信號(hào)肽PelB和OmpA與BglH共表達(dá)的菌株進(jìn)行全細(xì)胞催化后酶活性明顯提高。Wang等[26]利用PelB天然信號(hào)肽分泌表達(dá)內(nèi)切菊糖酶，其酶活性可達(dá)到75.22 U/mg。Yamabhai等[27]發(fā)現(xiàn)大腸桿菌外膜蛋白OmpA能夠提高重組蛋白在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中的分泌效率，實(shí)現(xiàn)了α-淀粉酶、甘露聚糖酶以及殼多糖酶的胞外分泌表達(dá)量。李琦等[28]同樣發(fā)現(xiàn)信號(hào)肽PelB和OmpA的表達(dá)可提高重組蛋白的可溶性表達(dá)量。圖3A顯示，PelB表達(dá)的菌株細(xì)胞周質(zhì)中酶活性明顯高于OmpA。如圖3B所示， PelB-BglH對(duì)于底物pNPG的催化效率最高，發(fā)酵24 h后酶活性可達(dá)0.98 U/ml，因此信號(hào)肽PelB的共表達(dá)能夠使酶更高效地分泌表達(dá)。

2.3 不同啟動(dòng)子表達(dá)伴侶蛋白SecB對(duì)BglH分泌表達(dá)的影響

啟動(dòng)子是基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的重要表達(dá)元件，篩選強(qiáng)啟動(dòng)子能夠明顯提高異源基因的轉(zhuǎn)錄水平[29]。如圖4A所示，使用Trc啟動(dòng)子的重組菌株在細(xì)胞周質(zhì)中β-葡萄糖苷酶活性稍高，全細(xì)胞催化的β-葡萄糖苷酶活性能達(dá)到1.23 U/ml。因此選用Trc啟動(dòng)子實(shí)現(xiàn)信號(hào)肽PelB與BglH融合表達(dá)進(jìn)行下一步試驗(yàn)。據(jù)報(bào)道SecB伴侶蛋白有利于Ⅱ型分泌系統(tǒng)信號(hào)肽的分泌表達(dá)[30] ，由于Trc啟動(dòng)子表達(dá)的PelB-BglH菌株全細(xì)胞催化酶活性仍然低于細(xì)胞質(zhì)組分，考慮通過伴侶蛋白SecB提高外源蛋白質(zhì)的分泌效率。

為了進(jìn)一步提高伴侶蛋白SecB的表達(dá)效率，本研究選用T7、Trc、LacUV5啟動(dòng)子表達(dá)伴侶蛋白SecB。如圖4B所示，T7啟動(dòng)子與伴侶蛋白SecB共表達(dá)后的重組菌株中各組分的糖苷酶活性均比對(duì)照組低。這可能是因?yàn)榘閭H蛋白SecB的過量表達(dá)是大腸桿菌細(xì)胞的負(fù)擔(dān)，導(dǎo)致包涵體形成的增加，降低β-葡萄糖苷酶活性[31]。而Trc啟動(dòng)子和LacUV5啟動(dòng)子與伴侶蛋白SecB共表達(dá)的菌株細(xì)胞質(zhì)酶活性均有一定程度的降低，細(xì)胞周質(zhì)中β-葡萄糖苷酶活性有所提升，這表明Trc啟動(dòng)子和LacUV5啟動(dòng)子與伴侶蛋白SecB共表達(dá)使得β-葡萄糖苷酶能更好地從胞內(nèi)向胞外轉(zhuǎn)移，與糖苷型底物更充分地結(jié)合。將上述菌株進(jìn)行全細(xì)胞催化，LacUV5啟動(dòng)子與SecB的組合表達(dá)后全細(xì)胞催化酶活性最高，可達(dá)2.02 U/ml，因此選用A-Trc-PelB-BglH-LacUV5-SecB可進(jìn)行下一步的表達(dá)優(yōu)化。由于伴侶蛋白有利于異源蛋白質(zhì)分泌，但是伴侶蛋白的過量表達(dá)會(huì)對(duì)重組大腸桿菌造成負(fù)擔(dān)，因此有必要對(duì)不同的異源蛋白質(zhì)和伴侶蛋白進(jìn)行分析研究。Lu等[32]選用3個(gè)啟動(dòng)子（T7、lac、bla）共表達(dá)伴侶蛋白SecB來實(shí)現(xiàn)丙酮酸氧化酶的細(xì)胞外表達(dá)，與T7和Lac啟動(dòng)子相比，弱啟動(dòng)子bla提供了最佳的細(xì)胞外丙酮酸氧化酶活性。

2.4 甘氨酸對(duì)β-葡萄糖苷酶表達(dá)分泌的影響

酶的分泌表達(dá)不僅受酶的表達(dá)效率的影響，還與細(xì)胞膜的通透性有關(guān)，若不能及時(shí)分泌到胞外，就會(huì)造成累積，從而堵塞分泌通道[33]。通過添加甘氨酸破壞重組大腸桿菌細(xì)胞壁和Cu2+作為bglH穩(wěn)定劑，使周質(zhì)空間的外膜蛋白滲透至胞外，可以進(jìn)一步提高重組蛋白質(zhì)分泌表達(dá)量[34]。

添加甘氨酸對(duì)大腸桿菌A-trc-pelB-bglH-lacUV5-secB細(xì)胞密度和β-葡萄糖苷酶活性的影響如圖5所示。由圖5A可知，甘氨酸對(duì)細(xì)胞生長具有顯著的負(fù)面影響，隨著甘氨酸含量的增加，菌體濃度降低，這可能是因?yàn)楦拾彼釋?duì)細(xì)胞生長具有一定的毒害作用[34]。從圖5B可知，甘氨酸的添加對(duì)細(xì)胞質(zhì)中β-葡萄糖苷酶活性也有負(fù)面影響，細(xì)胞質(zhì)的酶活性隨著甘氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)。而全細(xì)胞催化酶活性隨著甘氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，甘氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%時(shí)酶活性最高，可達(dá)到2.24 U/ml。細(xì)胞外的β-葡萄糖苷酶活性的提高證明了甘氨酸對(duì)蛋白質(zhì)滲漏的影響，與前期優(yōu)化甘氨酸以實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)滲漏的研究結(jié)果類似[35]。

2.5 重組表達(dá)菌株培養(yǎng)條件優(yōu)化

分子水平的操作可以提高β-葡萄糖苷酶的細(xì)胞外分泌表達(dá)產(chǎn)量，優(yōu)化培養(yǎng)條件也可以提高β-葡萄糖苷酶的胞外分泌量[35]。本研究通過對(duì)誘導(dǎo)表達(dá)過程中初始菌體密度、誘導(dǎo)時(shí)間、誘導(dǎo)溫度以及初始pH進(jìn)行優(yōu)化，進(jìn)一步提高胞外分泌量。

大腸桿菌 A-trc-pelB-bglH-lacUV5-secB在不同初始細(xì)胞密度（OD600）下誘導(dǎo)后的生長曲線以及全細(xì)胞β-葡萄糖苷酶活性變化如圖6A所示，細(xì)胞初始密度（OD600）為0.4～1.6時(shí)，β-葡萄糖苷酶酶活性顯著增加，而在細(xì)胞初始密度大于1.5后β-葡萄糖苷酶酶活性保持相對(duì)穩(wěn)定。隨著初始細(xì)胞密度的增加，全細(xì)胞酶活性整體表現(xiàn)為先緩慢上升后迅速下降，在初始細(xì)胞密度（OD600）為1.0時(shí)進(jìn)行誘導(dǎo)，發(fā)酵24 h后全細(xì)胞酶活性最高，達(dá)到2.31 U/ml，初始細(xì)胞密度大于1.0之后進(jìn)行誘導(dǎo)不利于β-葡萄糖苷酶的分泌表達(dá)，說明誘導(dǎo)時(shí)機(jī)過晚比過早對(duì)表達(dá)的影響更大[36]。楊濤等[33]也發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)時(shí)菌體生長時(shí)期會(huì)對(duì)蛋白質(zhì)的表達(dá)和分泌造成影響，他們考察了誘導(dǎo)時(shí)菌體OD600對(duì)多銅氧化酶在大腸桿菌中分泌的影響，結(jié)果表明當(dāng)OD600=1時(shí)，多銅氧化酶胞內(nèi)、胞外酶活性均為最高。由圖6B可知，發(fā)酵24 h后重組大腸桿菌A-Trc-PelB-BglH-LacUV5-SecB的終細(xì)胞密度隨著誘導(dǎo)時(shí)間的增加上升，而全細(xì)胞催化酶活性隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，誘導(dǎo)時(shí)間為24 h時(shí)，全細(xì)胞β-葡萄糖苷酶活性最高，可達(dá)2.52 U/ml。圖6C顯示了誘導(dǎo)溫度對(duì)重組大腸桿菌A-Trc-PelB-BglH-LacUV5-SecB的細(xì)胞密度以及β-葡萄糖苷酶活性的影響，總體而言，在20～35 ℃獲得高細(xì)胞密度，誘導(dǎo)溫度為25 ℃時(shí)，β-葡萄糖苷酶活性最高，且較高溫度和較低溫度均不利于β-葡萄糖苷酶的胞外表達(dá)。這是因?yàn)檎T導(dǎo)溫度是影響蛋白質(zhì)表達(dá)的一個(gè)重要因素，溫度過高會(huì)形成包涵體，溫度過低會(huì)造成外源基因表達(dá)不足[37]。誘導(dǎo)期的初始pH對(duì)大腸桿菌A-Trc-PelB-BglH-LacUV5-SecB的細(xì)胞密度和β-葡萄糖苷酶活性有顯著影響（圖6D）。在pH為5.5～7.5時(shí)β-葡萄糖苷酶的全細(xì)胞催化酶活性先上升后下降，初始pH為6.5時(shí)，全細(xì)胞催化酶活性最高，達(dá)到2.55 U/ml， 且pH為6.0～7.5時(shí)能夠保持較高酶活性，這與何成等[38]的研究結(jié)果一致。因此通過優(yōu)化誘導(dǎo)條件確定β-葡萄糖苷酶的最優(yōu)發(fā)酵條件為，初始細(xì)胞密度（OD600）=1.0，誘導(dǎo)時(shí)間為4 h，初始pH為6.5，誘導(dǎo)溫度為25 ℃。

3 結(jié)論

本研究以β-葡萄糖苷酶BglH為模式酶，結(jié)合信號(hào)肽結(jié)構(gòu)特點(diǎn)對(duì)大腸桿菌Ⅱ型分泌系統(tǒng)中4種信號(hào)肽進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)在N端融合PelB實(shí)現(xiàn)了β-葡萄糖苷酶BglH在大腸桿菌中的胞外分泌表達(dá)。并使用4種不同的啟動(dòng)子調(diào)控伴侶蛋白SecB的表達(dá)，提高信號(hào)肽PelB對(duì)β-葡萄糖苷酶BglH的分泌效率。此外，通過添加甘氨酸以及優(yōu)化培養(yǎng)條件，進(jìn)一步提高β-葡萄糖苷酶全細(xì)胞催化活性，進(jìn)而提高其與糖苷型底物的可及性，使其轉(zhuǎn)化為具有更高利用效率的苷元型物質(zhì)。

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（責(zé)任編輯：陳海霞）

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