常麗麗　彭存智　王丹　仝征　黃超　徐兵強(qiáng)

摘要： 鹽芥是研究耐鹽機(jī)理的模式植物。為從蛋白質(zhì)水平揭示鹽芥響應(yīng)鹽脅迫的分子機(jī)制，本研究采用同位素標(biāo)記相對(duì)和絕對(duì)定量（iTRAQ） 技術(shù)對(duì)不同NaCl濃度處理7 d的鹽芥葉片進(jìn)行差異蛋白質(zhì)組學(xué)分析。結(jié)果表明，鹽芥葉片中共鑒定到4 607個(gè)蛋白質(zhì)，其中281個(gè)蛋白質(zhì)的表達(dá)豐度顯著增加，95個(gè)蛋白質(zhì)的表達(dá)豐度顯著降低。鹽脅迫差異表達(dá)蛋白質(zhì)的KEGG代謝通路和蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果表明，促進(jìn)植株光合作用可幫助鹽芥適應(yīng)低鹽環(huán)境;抑制葉綠素和支鏈氨基酸合成、調(diào)控應(yīng)激反應(yīng)基因的表達(dá)是鹽芥應(yīng)對(duì)中鹽環(huán)境的重要因素;而有效清除活性氧、提高滲透物質(zhì)積累量和增加能量供應(yīng)可能是鹽芥耐受高鹽環(huán)境的關(guān)鍵。本研究結(jié)果為揭示鹽芥應(yīng)答鹽脅迫的分子響應(yīng)機(jī)制提供了理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞： 鹽芥;鹽脅迫;差異蛋白質(zhì);iTRAQ

中圖分類(lèi)號(hào)： 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A 文章編號(hào)： 1000-4440（2022）01-0049-16

Abstract： Eutrema salsugineum is a model plant for salt tolerance study. To reveal the molecular mechanism of E. salsugineum in response to salt stress at protein level， isobaric tags for relative and absolute quantification （iTRAQ） technology was used to do differential proteomics analysis on E. salsugineum leaves treated under different NaCl concentrations for seven days. The results showed that， a total of 4 607 proteins were identified from leaves of E. salsugineum， among which the expressional abundance of 281 proteins were significantly up-regulated， while the expressional abundance of 95 proteins were significantly down-regulated. Results of KEGG metabolic pathway and protein-protein interaction network analysis for differentially expressed proteins under salt stress showed that， promotion of photosynthesis was helpful for E. salsugineum to adapt to environment with low salinity. Inhibition of chlorophyll and branched chain amino acids synthesis， as well as expression regulation of stress-responsive genes were important factors for E. salsugineum to survive in an environment with medium salinity. Moreover， the key points for E. salsugineum to tolerate high salinity condition might be effective elimination of reactive oxygen species （ROS）， elevating accumulation of osmolytes and increasing energy supply. The results can provide theoretical basis for revealing molecular mechanism of E. salsugineum in response to salt stress.

Key words： Eutrema salsugineum;salt stress;differentially expressed protein;isobaric tags for relative and absolute quantification （iTRAQ）

鹽脅迫是自然界中主要的非生物脅迫之一，土壤中的高濃度鹽分會(huì)使植物體內(nèi)離子失衡，產(chǎn)生滲透壓力，從而嚴(yán)重影響植物的生長(zhǎng)和發(fā)育[1]。鹽芥是一年生草本植物，屬真鹽生植物，多生長(zhǎng)于鹽漬化土壤中。鹽芥是擬南芥的近親[2-3]，同樣具有生長(zhǎng)周期短、基因組構(gòu)成?。s為擬南芥的2倍）、種子數(shù)目多、可利用農(nóng)桿菌侵染花序法進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化試驗(yàn)、遺傳轉(zhuǎn)化效率高等特點(diǎn)。因此，近幾年鹽芥被提出作為耐鹽分子機(jī)理研究的理想模式植物[2，4-5]。雖然鹽芥和擬南芥有很多相似的特性，但兩者之間的耐鹽性卻存在很大差異。通過(guò)轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)分析擬南芥和鹽芥在響應(yīng)鹽脅迫的差異時(shí)，發(fā)現(xiàn)擬南芥中存在的鹽脅迫響應(yīng)基因，不管是否處于鹽脅迫環(huán)境，在鹽芥中均能高豐度表達(dá)[6-7]，說(shuō)明鹽芥在面對(duì)逆境時(shí)是“有備無(wú)患”;而且鹽芥中存在特有的新陳代謝途徑，使得其在鹽脅迫條件下能減少由植物激素所誘導(dǎo)的生理修飾[8]，從而能在一定程度上承受更大的脅迫壓力。同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)，鹽脅迫條件下，鹽芥根系的磷酸化蛋白質(zhì)組發(fā)生改變，這些變化的磷酸化蛋白質(zhì)參與了信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、活性氧清除、能量途徑、蛋白質(zhì)合成以及蛋白質(zhì)折疊等過(guò)程[9]，這些研究為將來(lái)從磷酸化水平上研究鹽芥的耐鹽機(jī)制提供了重要的理論依據(jù)。

目前，人們已從鹽芥中鑒定到一些與鹽脅迫耐受相關(guān)的基因和調(diào)控因子，如編碼K+/Na+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因（ThHKT1）[10-11]、編碼細(xì)胞質(zhì)膜和液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因（ThNHX1）和（ThSOS1）[12-14]、焦磷酸酶基因（TsVP） [15-17]、高親和性K+轉(zhuǎn)運(yùn)體（ThHAK5）[18]、脯氨酸合成基因（ThP5CS）[19]、Cu/Zn超氧化物歧化酶基因（ThCSD）[20]等，且部分基因的生物學(xué)功能已得到一定的闡述。我們前期對(duì)鹽芥葉片和葉綠體響應(yīng)鹽脅迫的比較蛋白質(zhì)組學(xué)的研究結(jié)果表明，鹽芥可通過(guò)Na+液泡區(qū)隔化，積累滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)（如淀粉、可溶性糖、脯氨酸等），以及維持光合效率和生長(zhǎng)發(fā)育等方式來(lái)適應(yīng)鹽脅迫環(huán)境[21-22]。本研究在已有的研究基礎(chǔ)上，應(yīng)用先進(jìn)的同位素相對(duì)標(biāo)記與絕對(duì)定量技術(shù)（iTRAQ）對(duì)不同鹽濃度處理?xiàng)l件下的鹽芥葉片進(jìn)行比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究，并重點(diǎn)分析不同鹽濃度處理對(duì)鹽芥葉片蛋白質(zhì)表達(dá)豐度的影響，期望揭示鹽芥適應(yīng)不同鹽濃度條件的蛋白質(zhì)化學(xué)機(jī)制，為揭示鹽芥耐鹽分子機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與試驗(yàn)設(shè)計(jì)

將鹽芥種子直接點(diǎn)播在基質(zhì)土（營(yíng)養(yǎng)土∶蛭石=1∶1，體積比）中，放置在培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)條件：溫度為白天22 ℃，晚上20 ℃;相對(duì)濕度為60%±5%;16 h光照，8 h黑暗。種子發(fā)芽后，用1/2濃度Hoagland營(yíng)養(yǎng)液每3 d澆灌1次。2個(gè)月后，挑選長(zhǎng)勢(shì)一致的鹽芥植株用含有0 mmol/L、200 mmol/L（低鹽）、400 mmol/L（中鹽）和600 mmol/L（高鹽）NaCl的1/2濃度Hoagland營(yíng)養(yǎng)液進(jìn)行澆灌，每天更換新的營(yíng)養(yǎng)液，每個(gè)鹽濃度處理36株植株。收集連續(xù)澆灌7 d（根據(jù)前期的預(yù)試驗(yàn)確定的鹽處理時(shí)間）的鹽芥葉片，每12株為1個(gè)生物學(xué)重復(fù)，液氮速凍，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 鹽芥葉片蛋白質(zhì)的提取、酶解及iTRAQ分析

參照Wang等[23]的BPP法提取鹽芥葉片總蛋白質(zhì)，用預(yù)冷的甲醇和丙酮清洗蛋白質(zhì)沉淀，然后溶解在蛋白質(zhì)裂解液（7 mol/L尿素，2 mol/L硫脲，4% CHAPS（一種非變性的兩性離子型去垢劑），30 mmol/L Tris-HCl，pH 8.5）中。以牛血清白蛋白（BSA）為標(biāo)準(zhǔn)溶液，通過(guò)Bradford測(cè)定法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度[24]。取100 μg用不同濃度的NaCl處理的鹽芥葉片總蛋白質(zhì)，用胰蛋白酶進(jìn)行消化后，使用iTRAQ試劑分別標(biāo)記0 mmol/L、200 mmol/L、400 mmol/L和 600 mmol/L NaCl處理的上述葉片總蛋白質(zhì)酶解產(chǎn)物后，再進(jìn)行等量混合。采用強(qiáng)陽(yáng)離子變換（SCX）色譜柱（4.6 mm×250.0 mm， Aqua C18， 5 μm， 100 ）對(duì)iTRAQ標(biāo)記的肽段進(jìn)行預(yù)分級(jí)，再通過(guò)液相串聯(lián)質(zhì)譜對(duì)標(biāo)記肽進(jìn)行鑒定，獲取差異表達(dá)肽段信息。

1.3 質(zhì)譜數(shù)據(jù)搜庫(kù)

使用Proteinpilot軟件（Version 4.5）對(duì)質(zhì)譜結(jié)果進(jìn)行搜庫(kù)，搜索數(shù)據(jù)庫(kù)為自建的鹽芥蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)，蛋白數(shù)據(jù)從美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心（NCBI）網(wǎng)站（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/12266）上下載。搜庫(kù)參數(shù)設(shè)置為：酶類(lèi)為T(mén)rypsin，錯(cuò)誤剪切位點(diǎn)數(shù)為1，固定修飾位點(diǎn)為Carbamidomethyl（C），可變修飾位點(diǎn)為Oxidation（M）。將0 mmol/L NaCl處理鹽芥葉片蛋白質(zhì)作為對(duì)照組，200 mmol/L NaCl、400 mmol/L NaCl、600 mmol/L NaCl作為處理組，按處理組與對(duì)照組離子的峰面積比值，選擇置信度在95%以上的結(jié)果進(jìn)行報(bào)告。質(zhì)譜鑒定出的可信蛋白質(zhì)篩選參數(shù)應(yīng)滿(mǎn)足：可信度在95%以上的肽置信水平，至少鑒定出2條肽段，且錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率（FDR）≤1%。

1.4 質(zhì)譜數(shù)據(jù)生物信息學(xué)分析

通過(guò)KEGG途徑分析對(duì)可信鑒定的蛋白質(zhì)參與的代謝通路進(jìn)行富集。同時(shí)，對(duì)鹽脅迫差異表達(dá)蛋白質(zhì)（變化倍數(shù)>1.50或<0.67，P<0.05）進(jìn)行KEGG代謝途徑和蛋白質(zhì)間相互作用網(wǎng)絡(luò)分析（https：//string-db.org/cgi/input.pl）。

1.5 部分鹽脅迫差異表達(dá)蛋白質(zhì)對(duì)應(yīng)基因的qRT-PCR分析

提取用不同鹽濃度處理的鹽芥葉片總RNA，取1 μg總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，并將反轉(zhuǎn)錄后的cDNA樣品稀釋5倍后用于qRT-PCR分析，每個(gè)樣品至少重復(fù)3次qRT-PCR試驗(yàn)。取1 μl稀釋后的cDNA加入到SYBR Green PCR Master mix體系中，使用Mx3005P熒光定量PCR儀進(jìn)行qRT-PCR試驗(yàn)，鹽芥的actin基因（NCBI基因登錄號(hào)312283264）作為內(nèi)參基因。用于qRT-PCR的引物序列詳見(jiàn)表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 鹽芥葉片蛋白質(zhì)種類(lèi)分析及鹽脅迫差異表達(dá)蛋白質(zhì)的篩選

應(yīng)用iTRAQ技術(shù)結(jié)合AB5600+高端生物質(zhì)譜儀對(duì)鹽芥葉片總蛋白質(zhì)進(jìn)行定量分析，3次iTRAQ重復(fù)鑒定出的可信蛋白質(zhì)數(shù)分別為3 750個(gè)、3 897個(gè)和3 901個(gè)，共計(jì)4 607個(gè)蛋白質(zhì)至少在1次重復(fù)中鑒定到的可信的鹽芥葉片總蛋白質(zhì)，其中3 811個(gè)蛋白質(zhì)至少在2次重復(fù)試驗(yàn)中得到可信鑒定（圖1A）。這3 811個(gè)可信蛋白質(zhì)參與了18條代謝途徑，其中碳水化合物代謝途徑參與的蛋白質(zhì)種類(lèi)最多（988個(gè)蛋白質(zhì)），其次是翻譯類(lèi)蛋白質(zhì)（895個(gè)蛋白質(zhì)）與折疊、分類(lèi)和降解類(lèi)蛋白質(zhì)（830個(gè)蛋白質(zhì)）、氨基酸代謝（579個(gè)蛋白質(zhì)）、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)（547個(gè)蛋白質(zhì)）、運(yùn)輸和分解代謝（522個(gè)蛋白質(zhì)）、脂質(zhì)代謝（496個(gè)蛋白質(zhì)）、環(huán)境適應(yīng)（452種蛋白質(zhì)）、能量代謝（416種蛋白質(zhì)）等代謝途徑類(lèi)蛋白質(zhì)（圖1B）。

以0 mmol/L NaCl處理的鹽芥葉片為對(duì)照，鹽脅迫處理后共檢測(cè)到376個(gè)鹽脅迫差異表達(dá)蛋白質(zhì)（變化倍數(shù)>1.5或<0.67，P<0.05）（圖1C），其中281個(gè)蛋白質(zhì)的表達(dá)豐度顯著增加，95個(gè)蛋白質(zhì)的表達(dá)豐度顯著降低;其中低鹽處理（200 mmol/L NaCl）檢測(cè)到57個(gè)差異表達(dá)的蛋白質(zhì)，其中表達(dá)豐度增加的蛋白質(zhì)43個(gè)，豐度降低的蛋白質(zhì)14個(gè);中鹽環(huán)境（400 mmol/L NaCl）引起108個(gè)蛋白質(zhì)的表達(dá)豐度發(fā)生顯著改變，24個(gè)顯著增加，84個(gè)顯著降低;高鹽條件下（600 mmol/L NaCl）共有263個(gè)蛋白質(zhì)的表達(dá)豐度發(fā)生顯著改變，252個(gè)表達(dá)豐度增加，11個(gè)表達(dá)豐度降低。通過(guò)比較不同鹽濃度處理?xiàng)l件下的差異表達(dá)蛋白質(zhì)數(shù)量發(fā)現(xiàn)，鹽處理濃度越高，表達(dá)豐度發(fā)生顯著改變的蛋白質(zhì)數(shù)目越多，說(shuō)明鹽芥植株需要調(diào)控更多蛋白質(zhì)的表達(dá)來(lái)應(yīng)對(duì)高鹽環(huán)境。

2.2 鹽脅迫差異表達(dá)蛋白質(zhì)的KEGG代謝通路分析

對(duì)376個(gè)鹽脅迫差異表達(dá)蛋白質(zhì)參與的代謝通路進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)它們主要富集到26條代謝途徑中（僅統(tǒng)計(jì)蛋白質(zhì)數(shù)量≥4個(gè)的代謝途徑）（圖2、表2），包括能量代謝、其他氨基酸代謝、氨基酸代謝、碳水化合物代謝途徑等。其中能量代謝包括光合作用-天線蛋白、氧化磷酸化和硫代謝;谷胱甘肽代謝、硒化合物代謝和β-丙氨酸代謝屬于其他氨基酸代謝途徑;纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸生物合成、酪氨酸代謝、精氨酸和脯氨酸代謝、半胱氨酸和甲硫氨酸代謝、甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝屬于氨基酸代謝;碳水化合物代謝途徑包括半乳糖代謝、氨基糖和核苷酸糖代謝、糖酵解/糖異生、丙酮酸代謝、乙醛酸和二羧酸代謝、淀粉和蔗糖代謝。此外，卟啉和葉綠素代謝、核糖體、RNA轉(zhuǎn)運(yùn)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)加工過(guò)程、苯丙素生物合成、嘌呤代謝、2-氧代羧酸代謝等代謝途徑也受到鹽脅迫的影響（圖2）。

進(jìn)一步比較不同鹽濃度處理?xiàng)l件下差異表達(dá)蛋白質(zhì)富集的代謝通路后發(fā)現(xiàn)，低鹽濃度處理顯著誘導(dǎo)了光合作用天線蛋白和參與氧化磷酸化途徑的蛋白質(zhì)的豐度積累，包括葉綠素a/b結(jié)合蛋白1（CP1，XP_006415537.1）、CP2（XP_024012787.1）、CP4（XP_006404376.1）、CP6（XP_006403520.1）、CP24 10B（XP_006416877.1）、光系統(tǒng)Ⅰ反應(yīng)中心亞基Ⅲ（PsaF，XP_006415339.1）和ATP酶亞基8（ATPase8，XP_006397344.2）。中等鹽度處理卻顯著降低了大部分參與卟啉和葉綠素代謝、纈氨酸生物合成、亮氨酸生物合成和異亮氨酸生物合成以及半胱氨酸和甲硫氨酸代謝途徑蛋白質(zhì)的表達(dá)，其中參與卟啉和葉綠素代謝途徑的蛋白質(zhì)為膽色素原脫氨酶（PBGD，XP_006399317.1）、尿卟啉原脫羧酶2（UROD2，XP_006411313.1）、谷氨酸-1-半醛2，1-氨基變位酶2（GSAM2，XP_006404223.1）、原葉綠素還原酶B（PORB，XP_006413074.1）、鎂螯合酶亞基ChlI-1（CHLI1， XP_006414096.1），以及脫鎂葉綠素加氧酶（PAO， XP_006419093.1）;參與纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸生物合成途徑的蛋白質(zhì)包括3-異丙基蘋(píng)果酸脫氫酶3（IMDH3，XP_006399931.1）、3-異丙基蘋(píng)果酸脫水酶小亞基1（IPMD-S1，XP_006411585.1）、乙酰乳酸合酶1（ALS1，XP_006404237.1）、蘇氨酸脫水酶（THD1，XP_024015515.1）;參與半胱氨酸和甲硫氨酸代謝途徑的蛋白質(zhì)有6個(gè)，包括1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸氧化酶2（ACO2，XP_006391897.1）、ACO4（XP_006418070.1）、S-腺苷甲硫氨酸合酶（SAMS，XP_006396376.1）、SAMS2（XP_006397900.1和 XP_006406736.1）、SAMS3（XP_006410860.1）和胱氨酸裂解酶（CORI3，XP_006413537.1）（圖3）。高鹽濃度處理?xiàng)l件下，大部分參與谷胱甘肽代謝、精氨酸和脯氨酸代謝、糖降解/糖異生，以及氨基糖和核苷糖代謝途徑的蛋白質(zhì)表達(dá)豐度顯著增加，包括10種谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（GST-Z1、GST-U16、GST-U17、GST-U19、GST-U27、GST-F3、GST-F8、GST-F9、GST-DJAR2和GST-DHAR1）、磷脂氫過(guò)氧化物谷胱甘肽過(guò)氧化物酶6（PHGP6，XP_006396880.1）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶7（GPX7，XP_006412543.1），以及吡咯啉-5-羧酸還原酶（PYCR，XP_006399997.1）、δ-1-吡咯啉-5-羧酸合酶A（P5CS-A，XP_006411212.1）、精氨酸酶1（ARG1，XP_006397249.1）、醛脫氫酶家族7成員B4（ALDH7B4，XP_006392717.1）、磷酸甘油酸變位酶4（PGM4，XP_006404025.1）、醛糖1-差向異構(gòu)酶（ALE1，XP_006404339.1）、2，3-二磷酸甘油酸非依賴(lài)性磷酸甘油酸變位酶2（PMG2，XP_006407761.1）、NADPH依賴(lài)性醛酮還原酶（AKR，XP_006410968.1）、葡萄糖-6-磷酸1-差向異構(gòu)酶（GLPE，XP_006413255.2）、UDP-葡萄糖4-差向異構(gòu)酶4（UGE4，XP_006391617.1）、β-D-木糖苷酶4（XYL4，XP_006394136.1）、內(nèi)切幾丁質(zhì)酶（CHI，XP_006397529.1和XP_006397530.1）和CH25（XP_006407328.1）、果糖激酶1（FRK1，XP_006410273.1）、殼三糖苷酶1（CHIT1，XP_006413935.1）和葡萄糖-1-磷酸腺苷酸轉(zhuǎn)移酶大亞基3（GLGL3，XP_024005293.1）（圖3）。這些結(jié)果表明，鹽芥可能通過(guò)調(diào)控不同的代謝途徑來(lái)適應(yīng)不同的鹽脅迫環(huán)境。

2.3 鹽脅迫差異表達(dá)蛋白質(zhì)間的互作調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析

STRING數(shù)據(jù)庫(kù)可用來(lái)分析蛋白質(zhì)間的相互作用，本研究采用最高置信度（得分大于0.9）和馬爾可夫聚類(lèi)（MCL）算法來(lái)呈現(xiàn)鹽脅迫差異表達(dá)蛋白質(zhì)之間的互作調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，結(jié)果如圖4所示。第Ⅰ類(lèi)蛋白質(zhì)主要參與光合作用、葉綠素合成和蛋白質(zhì)降解途徑，含有10個(gè)蛋白質(zhì)：CP1、CP4、CP6、CP24-10B、PsaF、核酮糖二磷酸羧化酶/加氧酶（Rubisco）活化酶（RCA，XP_006411205.1）、彎曲類(lèi)囊體蛋白1A（CURT1A，XP_006396295.1）、PORB、26S蛋白酶體非ATP酶調(diào)節(jié)亞基7（PSMD7，XP_006399036.1）和UPF0603蛋白At1g54780（UPF0603，XP_006392487.1）。第Ⅱ類(lèi)包括5個(gè)蛋白質(zhì)，主要參與卟啉和葉綠素代謝，分別是GSAM2、PBGD、UROD2、CHLI1和未知蛋白質(zhì)LOC18016835（Ycf54，XP_006401109.1）。第Ⅲ類(lèi)包括6個(gè)蛋白質(zhì)，主要參與硫代謝和丙酮酸代謝，包括5′-腺苷酸還原酶2（APR2，XP_006391919.1）、過(guò)硫化雙加氧酶ETHE1（ETHE1，XP_006392779.1）、羥酰谷氨酸水解酶（HAGH，XP_006407499.1）、ATP-硫酰酶1（ATP-S1，XP_006406118.1）和ATP-硫酰酶3（ATP-S3，XP_006414665.1）、乳酰谷胱甘肽裂解酶（GLX1，XP_006417306.1）。第Ⅳ類(lèi)含有7個(gè)蛋白質(zhì)，包括葡萄糖苷酶2（GS2，XP_006401342.1）、內(nèi)質(zhì)素（EP，XP_006413464.1）、蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶1-1（PDIL1-1，XP_006416267.1）、蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶1-2（PDIL1-2，XP_006390081.1）、蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶1-3（PDIL1-3，XP_006403511.1）和蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶1-4（PDIL1-4，XP_006400826.1），以及70 000熱激蛋白（HSP70，XP_006414318.1），這些蛋白質(zhì)主要參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)加工過(guò)程。第V類(lèi)含有15個(gè)蛋白質(zhì)，包括RNA結(jié)合蛋白CP33（RBP-CP33，XP_006403809.1）、含五肽重復(fù)序列蛋白（PRCP，XP_006418504.1）、延伸因子（EF-TS，XP_006412882.1）、觸發(fā)因子蛋白TIG（TF-TIG，XP_006401478.1），以及11個(gè)核糖體蛋白（RP），如30S RP2（XP_006403837.1）、40S RP-S2（XP_006411454.1）、40S RP-S8（XP_006400597.1， XP_006409551.1）、40S RP-S16（XP_006408213.1）、50S RP-L4（XP_006417815.1）、50S RP-L27（XP_006405411.1）、60S RP-L4（XP_006407657.1）、60S RP-L23（XP_006411174.1）、60S RP-L24（XP_006410833.1）和60S RP-L34（XP_006390992.1），這些蛋白質(zhì)主要參與蛋白質(zhì)翻譯過(guò)程。蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用分析結(jié)果表明，鹽芥可通過(guò)多條代謝途徑間的相互協(xié)同作用來(lái)適應(yīng)鹽脅迫環(huán)境。

2.4 部分鹽脅迫差異表達(dá)蛋白質(zhì)的基因表達(dá)規(guī)律分析

為了評(píng)估蛋白質(zhì)表達(dá)豐度與其相應(yīng)基因表達(dá)水平之間的相關(guān)性，本研究利用qRT-PCR對(duì)9個(gè)典型的鹽脅迫差異表達(dá)蛋白質(zhì)進(jìn)行基因表達(dá)分析。結(jié)果（圖5）表明，8個(gè)鹽脅迫差異表達(dá)蛋白質(zhì)的編碼基因在鹽處理后顯著上調(diào)表達(dá)，僅1個(gè)蛋白質(zhì)（PBGD）對(duì)應(yīng)的基因表達(dá)水平在鹽處理后無(wú)明顯變化。其中CP4基因表達(dá)水平僅在低鹽條件下顯著升高，PAO和P5CS-A基因表達(dá)水平在中鹽環(huán)境下顯著升高，而Fd-GOGAT1基因表達(dá)水平在高鹽處理?xiàng)l件下顯著升高。低鹽和中鹽處理顯著誘導(dǎo)了ALDH7B4基因的表達(dá)，而低鹽和高鹽環(huán)境卻顯著上調(diào)UROD2、PORB和30S RP2基因的表達(dá)（圖5）。

比較9個(gè)鹽脅迫差異表達(dá)蛋白質(zhì)與其相應(yīng)基因的表達(dá)變化趨勢(shì)后發(fā)現(xiàn)，PAO、P5CS-A和CP4的蛋白質(zhì)表達(dá)模式與其編碼基因的表達(dá)變化規(guī)律基本相似，而ALDH7B4、Fd-GOGAT1、UROD2、PORB、30S RP2和PBGD的蛋白質(zhì)與編碼基因的表達(dá)變化趨勢(shì)卻不一致（圖5）。

鹽脅迫處理后基因表達(dá)水平和蛋白質(zhì)表達(dá)豐度不一致的現(xiàn)象也在其他植物中出現(xiàn)，如小麥[25]、甜菜[26]等，具體原因還需要進(jìn)一步分析才能確定。

基于上述研究結(jié)果和已有的文獻(xiàn)報(bào)道，我們提出一個(gè)鹽芥適應(yīng)不同鹽濃度脅迫環(huán)境的可能模式（圖6）。

3 討論

當(dāng)植物受到高鹽脅迫時(shí)，植物體內(nèi)的離子和滲透壓會(huì)失去平衡，并由此產(chǎn)生次級(jí)脅迫（如氧化脅迫），從而嚴(yán)重影響植株的生長(zhǎng)和發(fā)育，甚至導(dǎo)致植株死亡[1]。植物通過(guò)建立新的離子和滲透動(dòng)態(tài)平衡、緩解或消除氧化損害、調(diào)控生長(zhǎng)等措施來(lái)適應(yīng)新的脅迫環(huán)境[5]。已有研究結(jié)果表明，在鹽脅迫條件下，鹽芥主要將Na+累積在地上部分，并將Na+泵入液泡內(nèi);同時(shí)，鹽芥的滲透調(diào)節(jié)能力也較強(qiáng)，可通過(guò)降低生長(zhǎng)速率來(lái)適應(yīng)滲透脅迫[27]。本研究利用定量蛋白質(zhì)組學(xué)iTRAQ技術(shù)，對(duì)0 mmol/L、200 mmol/L、400 mmol/L和600 mmol/L NaCl處理7 d條件下的鹽芥葉片進(jìn)行差異蛋白質(zhì)組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)376個(gè)蛋白質(zhì)的表達(dá)豐度在鹽處理后發(fā)生顯著改變。根據(jù)這些差異表達(dá)蛋白質(zhì)的功能分類(lèi)和代謝途徑分析，推測(cè)鹽芥適應(yīng)不同鹽濃度脅迫處理7 d條件下的可能分子機(jī)制。

3.1 增強(qiáng)的光合作用和能量供應(yīng)可能是鹽芥適應(yīng)低鹽環(huán)境的關(guān)鍵

對(duì)許多真鹽生植物來(lái)說(shuō)，適當(dāng)?shù)柠}濃度可以促進(jìn)它們的生長(zhǎng)和發(fā)育。研究結(jié)果表明，300 mmol/L NaCl處理可顯著促進(jìn)真鹽生植物鹽角草的葉片肉質(zhì)化和莖直徑增加[28];鹽生植物海馬齒在200～300 mmol/L NaCl處理?xiàng)l件下表現(xiàn)出最佳的生長(zhǎng)狀態(tài)[29];200 mmol/L NaCl處理可顯著增加鹽地堿蓬的根系干質(zhì)量和鮮質(zhì)量以及根系的總長(zhǎng)度[30]。100 mmol/L NaCl處理鹽芥表現(xiàn)出最佳生長(zhǎng)狀態(tài)，而200 mmol/L和400 mmol/L NaCl處理抑制了葉片的生長(zhǎng)發(fā)育，但沒(méi)有表現(xiàn)出任何毒害癥狀[31]，這與我們以前的研究結(jié)果[21]相一致。本研究發(fā)現(xiàn)光合作用天線蛋白的基因和蛋白質(zhì)的表達(dá)豐度在200 mmol/L NaCl處理?xiàng)l件下均顯著增加，結(jié)合未發(fā)生顯著變化的葉綠體顯微結(jié)構(gòu)[22，31]以及升高的總?cè)~綠素含量和葉綠素a與葉綠素b比值的研究結(jié)果[21，31]，推測(cè)鹽芥可能通過(guò)增加葉綠素含量和提高光合作用天線蛋白的表達(dá)量來(lái)吸收更多的光能。同時(shí)，200 mmol/LNaCl處理可誘導(dǎo)PsaF和ATPase8上調(diào)表達(dá)，將吸收的更多光能傳遞到光反應(yīng)中心，促進(jìn)鹽芥的光合作用，從而合成更多的有機(jī)物和增加能量供應(yīng)來(lái)幫助鹽芥應(yīng)對(duì)低鹽環(huán)境，這些研究結(jié)果與部分植物[32-33]響應(yīng)鹽脅迫的比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究結(jié)果相一致。

3.2 抑制葉綠素與支鏈氨基酸的合成和調(diào)控脅迫響應(yīng)基因的表達(dá)可能是鹽芥在中鹽環(huán)境下存活的重要因素

光合色素是光合作用系統(tǒng)的重要組成部分，主要包括高等植物中的葉綠素a、葉綠素b和類(lèi)胡蘿卜素，其中葉綠素是主要的捕光和反應(yīng)色素。許多研究結(jié)果表明，鹽脅迫通常會(huì)降低植物的葉綠素含量[34-36]。同樣，我們之前的研究發(fā)現(xiàn)400 mmol/L和600 mmol/LNaCl處理均顯著降低了鹽芥葉片的葉綠素含量[21]。本研究共鑒定到6個(gè)參與卟啉和葉綠素代謝的鹽脅迫差異表達(dá)蛋白質(zhì)（PBGD、UROD2、PORB、GSAM2、CHLI1和PAO），其中PBGD可催化4個(gè)膽色素原分子轉(zhuǎn)化為尿卟啉原Ⅲ，是葉綠素生物合成的關(guān)鍵步驟[37];UROD催化尿卟啉原Ⅲ脫羧為共卟啉原Ⅲ[38];PORB是葉綠素生物合成中的關(guān)鍵酶，可催化原葉綠素還原為葉綠素[39];GSAM催化谷氨酸-1-半醛異構(gòu)化為5-氨基乙酰丙酸，而5-氨基乙酰丙酸是四吡咯（如葉綠素和血紅素）的通用前體[40];CHLI1是Mg螯合酶的一個(gè)亞基，可將Mg2+插入原卟啉IX中，完成葉綠素生物合成的第一步[41];PAO是葉綠素分解代謝的關(guān)鍵調(diào)節(jié)酶[42]。在鹽脅迫條件下，水稻幼苗中PBGD的活性[43]和番茄幼苗中PBGD的表達(dá)水平[44]均顯著下降;耐鹽和鹽敏感棉花中PORB的表達(dá)豐度亦受到顯著抑制[45]。同時(shí)，鹽脅迫下水稻幼苗、番茄幼苗和鹽敏感棉花中的葉綠素含量也明顯降低。本研究結(jié)果與這些研究結(jié)果相似，即參與葉綠素生物合成的蛋白質(zhì)（PBGD、UROD2、PORB、GSAM2和CHLI1）的表達(dá)豐度在400 mmol/LNaCl處理后顯著降低，而參與葉綠素分解代謝的PAO表達(dá)豐度卻在600 mmol/LNaCl處理?xiàng)l件下顯著增加，由此推測(cè)鹽芥可能通過(guò)降低葉綠素生物合成中關(guān)鍵蛋白質(zhì)的表達(dá)量來(lái)降低葉片中的葉綠素含量，從而適應(yīng)中鹽脅迫環(huán)境;而高鹽脅迫環(huán)境增強(qiáng)了葉綠素的分解代謝，從而引起葉綠素含量降低。

非生物脅迫可強(qiáng)烈誘導(dǎo)支鏈氨基酸（BCAA）的降解[46-47]。亮氨酸、纈氨酸和異亮氨酸屬于BCAA，但亮氨酸、纈氨酸和異亮氨酸在響應(yīng)脅迫過(guò)程中的功能可能并不完全相同[48]。本研究共鑒定到4個(gè)鹽脅迫差異表達(dá)蛋白質(zhì)（IMDH3、IPMD-S1、ALS1和THD1）參與到纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸生物合成途徑。已有研究結(jié)果表明，靶向干擾禾谷鐮刀菌中編碼IMDH的FgLEU2A基因的表達(dá)，可顯著降低其對(duì)滲透和氧化脅迫的耐受性[49];反義抑制番茄IPMD的表達(dá)可提高果實(shí)中BCAA的水平[50];使用乙酰乳酸合成酶（ALS）抑制劑并不干擾干旱脅迫誘導(dǎo)的BCAA積累過(guò)程[51]。在本研究中，400 mmol/LNaCl處理顯著降低了IMDH3、IPMD-S1、ALS1和THD1的表達(dá)量，表明中度鹽脅迫環(huán)境可能抑制了BCAA的合成。

此外，大多數(shù)參與半胱氨酸和甲硫氨酸代謝途徑的蛋白質(zhì)在400 mmol/L NaCl處理后表達(dá)豐度明顯降低，其中ACO是乙烯生物合成中的關(guān)鍵酶，可將1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸轉(zhuǎn)化為乙烯。在擬南芥中過(guò)量表達(dá)小麥TaACO1基因，可通過(guò)調(diào)控DREB1/CBF信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的脅迫響應(yīng)基因來(lái)降低轉(zhuǎn)基因株系的耐鹽性[52];但過(guò)量表達(dá)擬南芥ACO基因卻提高了轉(zhuǎn)基因株系的耐澇性[53]，這些結(jié)果表明不同植物中的ACO可能在響應(yīng)非生物脅迫時(shí)發(fā)揮不同的功能。SAMS可催化甲硫氨酸和ATP生成S-腺苷-L-甲硫氨酸（SAM），而SAM參與了乙烯、煙草胺和多胺的生物合成。研究結(jié)果表明，非生物脅迫可顯著誘導(dǎo)SAMS的表達(dá)[54]，且擬南芥中異源表達(dá)馬鈴薯和甜菜的SAMS，可通過(guò)上調(diào)與脅迫反應(yīng)相關(guān)的基因表達(dá)量來(lái)提高轉(zhuǎn)基因株系的脅迫耐受性[55-56]。結(jié)合本研究結(jié)果和現(xiàn)有報(bào)道，推測(cè)鹽芥可能通過(guò)降低半胱氨酸和甲硫氨酸代謝中關(guān)鍵蛋白質(zhì)的表達(dá)豐度來(lái)調(diào)控脅迫響應(yīng)基因的表達(dá)，從而適應(yīng)中度鹽脅迫環(huán)境。

3.3 有效清除活性氧、累積滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)、增加能量供應(yīng)可能是鹽芥耐受高鹽脅迫環(huán)境的關(guān)鍵

植物在受到鹽堿、干旱、低溫等逆境脅迫時(shí)，體內(nèi)活性氧物質(zhì)（ROS）含量會(huì)迅速上升，當(dāng)ROS積累到一定水平后，會(huì)對(duì)植物造成損傷，而植物主要通過(guò)酶促抗氧化系統(tǒng)和非酶促抗氧化系統(tǒng)來(lái)清除多余的ROS，以平衡體內(nèi)的ROS水平[57]。谷胱甘肽（GSH）是植物中重要的抗氧化劑，細(xì)胞中GSH的水平與生物和非生物脅迫響應(yīng)密切相關(guān)[58-59]。GPX和GST是谷胱甘肽代謝途徑中的關(guān)鍵酶。GPX在脅迫響應(yīng)過(guò)程中發(fā)揮多種功能，如維持H2O2穩(wěn)態(tài)、形成蛋白質(zhì)復(fù)合體參與脅迫防御、作為ROS或氧化還原傳感器促進(jìn)不同信號(hào)通路間的相互協(xié)作[60]。GST含有大量多功能酶，在GSH介導(dǎo)的氧化還原調(diào)控和細(xì)胞解毒過(guò)程中發(fā)揮重要作用[61]。有研究結(jié)果表明，GPX和GST的表達(dá)量上調(diào)與許多植物的耐逆性提高密切相關(guān)，如擬南芥[62-63]、水稻[64]、小麥[65-66]、大麥[67]、大豆[68]等。目前已在鹽芥中鑒定到GPX基因家族，并證實(shí)鹽和滲透處理可誘導(dǎo)大多數(shù)GPX基因及其蛋白質(zhì)的表達(dá)豐度增加[69]。本研究發(fā)現(xiàn)在高鹽處理?xiàng)l件下，PHGP6、GPX7和10個(gè)GST蛋白質(zhì)的表達(dá)豐度均顯著增加，這與蘋(píng)果樹(shù)根響應(yīng)低溫脅迫和沙棗幼苗接種叢枝菌根真菌后響應(yīng)鹽脅迫的比較蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果相似[70-71]。由此推測(cè)鹽芥可能通過(guò)促進(jìn)GSH代謝途徑中關(guān)鍵酶的表達(dá)來(lái)清除過(guò)量的ROS，從而適應(yīng)高鹽脅迫環(huán)境。

當(dāng)植物受到非生物脅迫時(shí)可通過(guò)積累滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)來(lái)進(jìn)行滲透調(diào)節(jié)[72]。滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)大致可分為2類(lèi)：一類(lèi)是從外部引入細(xì)胞的無(wú)機(jī)離子，另一類(lèi)是細(xì)胞內(nèi)合成的有機(jī)物質(zhì)，包括可溶性糖（蔗糖、葡萄糖、果糖、半乳糖等）和含氮化合物（如脯氨酸、甜菜堿等），其中脯氨酸是許多植物中最有效的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)之一[73-77]。本研究中，我們鑒定到3個(gè)參與精氨酸和脯氨酸代謝途徑的關(guān)鍵蛋白質(zhì)PYCR、P5CS-A和ALDH7B4。PYCR和P5CS-A是植物中脯氨酸合成的關(guān)鍵酶。許多研究結(jié)果表明，PYCR和P5CS的表達(dá)水平與脅迫誘導(dǎo)的脯氨酸合成密切相關(guān)[78-79]。ALDH不僅能將醛氧化成羧酸，通過(guò)減少脂質(zhì)過(guò)氧化來(lái)響應(yīng)脅迫環(huán)境[47]，還能通過(guò)促進(jìn)脯氨酸合成參與擬南芥對(duì)高鹽脅迫的響應(yīng)[80]。本研究發(fā)現(xiàn)，在高鹽脅迫條件下PYCR、P5CS-A和ALDH7B4的蛋白質(zhì)表達(dá)水平明顯升高，結(jié)合不同NaCl濃度處理?xiàng)l件下鹽芥葉片中脯氨酸含量急劇增加的研究結(jié)果[21]，推測(cè)高鹽脅迫提高脯氨酸代謝途徑的蛋白質(zhì)表達(dá)量可促進(jìn)鹽芥中脯氨酸的積累。此外，我們還發(fā)現(xiàn)鹽芥葉片中淀粉和可溶性糖的含量分別在400 mmol/L和600 mmol/LNaCl處理時(shí)達(dá)到最大值[21]，結(jié)合本研究結(jié)果，600 mmol/LNaCl處理下參與碳水化合物代謝的蛋白質(zhì)（5個(gè)參與糖酵解/糖異生的蛋白質(zhì)，8個(gè)參與氨基糖和核苷酸糖代謝的蛋白質(zhì)）表達(dá)豐度均顯著增加，由此推測(cè)高鹽環(huán)境也促進(jìn)了碳水化合物的積累。這些結(jié)果表明，積累的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)（如脯氨酸、淀粉、可溶性糖等）可能是鹽芥適應(yīng)高鹽脅迫環(huán)境的關(guān)鍵因素。

為了降低Na+的毒害效應(yīng)，植物需要消耗大量三磷酸腺苷（ATP）來(lái)排除體內(nèi)多余的Na+，或?qū)a+區(qū)隔化進(jìn)液泡來(lái)建立新的離子和滲透平衡[5]。ATP合成酶可通過(guò)合成ATP為細(xì)胞提供能量[81]。本研究發(fā)現(xiàn)，高鹽脅迫環(huán)境下ATP合成酶的G亞基和ε亞基的表達(dá)豐度均顯著增加，這與鹽芥已有的研究結(jié)果[21-22]和其他植物的研究結(jié)果相似[82-84]。通過(guò)ATP合成酶亞基表達(dá)豐度的增加來(lái)提高能量供應(yīng)可能是鹽芥應(yīng)對(duì)高鹽環(huán)境的重要策略。

本研究利用iTRAQ技術(shù)從鹽芥葉片中鑒定到4 607個(gè)蛋白質(zhì)，其中281個(gè)蛋白質(zhì)的表達(dá)豐度顯著增加，97個(gè)蛋白質(zhì)的表達(dá)豐度明顯降低，以響應(yīng)不同NaCl濃度處理的脅迫環(huán)境，這些鹽脅迫差異表達(dá)蛋白質(zhì)主要參與能量代謝、碳水化合物代謝、氨基酸代謝、卟啉和葉綠素代謝等代謝途徑。通過(guò)對(duì)不同鹽濃度處理下的脅迫差異表達(dá)蛋白質(zhì)進(jìn)行KEGG代謝通路和蛋白質(zhì)互作調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析，基本明確了鹽芥適應(yīng)不同鹽脅迫環(huán)境的可能分子機(jī)制，下一步將深入研究關(guān)鍵鹽脅迫差異表達(dá)蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能，為揭示鹽芥耐鹽分子機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

[1] LIANG W J， MA X L， WAN P， et al. Plant salt-tolerance mechanism： a review[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications， 2018， 495（1）： 286-291.

[2] WARWICK S I， AL-SHEHBAZ I A， SAUDER C A. Phylogenetic position of Arabis arenicola and generic limits of Aphragmus and Eutrema （Brassicaceae） based on sequences of nuclear ribosomal DNA[J]. Canadian Journal of Botany-Revue Canadienne de Botanique， 2006， 84（2）： 269-281.

[3] AMTMANN A， BOHNERT H J， BRESSAN R A. Abiotic stress and plant genome evolution. Search for new models[J]. Plant Physiology， 2005， 138（1）： 127-130.

[4] BRESSAN R A， ZHANG C， ZHANG H， et al. Learning from the Arabidopsis experience. The next gene search paradigm[J]. Plant Physiology， 2001， 127（4）： 1354-1360.

[5] ZHU J K. Plant salt tolerance[J]. Trends in Plant Science， 2001， 6（2）： 66-71.

[6] TAJI T， SEKI M， SATOU M， et al. Comparative genomics in salt tolerance between Arabidopsis and Arabidopsis-related halophyte salt cress using Arabidopsis microarray[J]. Plant Physiology， 2004， 135（3）： 1697-1709.

[7] PANG Q， CHEN S， DAI S， et al. Comparative proteomics of salt tolerance in Arabidopsis thaliana and Thellungiella halophila[J]. Journal of Proteome Research， 2010， 9（5）： 2584-2599.

[8] ARBONA V， ARGAMASILLA R， GMEZ-CADENAS A. Common and divergent physiological， hormonal and metabolic responses of Arabidopsis thaliana and Thellungiella halophila to water and salt stress[J]. Journal of Plant Physiology， 2010， 167（16）： 1342-1350.

[9] ZHOU Y J， GAO F， LI X F， et al. Alterations in phosphoproteome under salt stress in Thellungiella roots[J]. Chinese Science Bulletin， 2010， 55（32）： 3673-3679.

[10]蔡小寧，楊 平，賁愛(ài)玲，等. 鹽芥ThHKT1基因的克隆[J]， 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2006（6）： 21-24.

[11]唐 寧，楊 平. 鹽芥ThHKT1基因的生物信息學(xué)分析[J]. 藥物生物技術(shù)， 2008， 15（6）： 449-452.

[12]WU C， GAO X， KONG X Q， et al. Molecular cloning and functional analysis of a Na+/H+ antiporter gene ThNHX1 from a halophytic plant Thellungiella halophila[J]. Plant Molecular Biology Reporter， 2009， 27（1）： 1-12.

[13]OH D H， GONG Q， ULANOV A， et al. Sodium stress in the halophyte Thellungiella halophila and transcriptional changes in a thsos1-RNA interference line[J]. Journal of Integrative Plant Biology， 2007， 49（10）： 1484-1496.

[14]OH D H， LEIDI E， ZHANG Q， et al. Loss of halophytism by interference with SOS1 expression[J]. Plant Physiology， 2009， 151（1）： 210-222.

[15]GAO F， GAO Q， DUAN X G， et al. Cloning of an H+-PPase gene from Thellungiella halophila and its heterologous expression to improve tobacco salt tolerance[J]. Journal of Experimental Botany， 2006， 57（12）： 3259-3270.

[16]SUN Q H， GAO F， ZHAO L， et al. Identification of a new 130 bp cis-acting element in the TsVP1 promoter involved in the salt stress response from Thellungiella halophila[J]. BMC Plant Biology， 2010， 10（1）： 90.

[17]LV S L， ZHANG K W， GAO Q， et al. Overexpression of an H+-PPase gene from Thellungiella halophila in cotton enhances salt tolerance and improves growth and photosynthetic performance[J]. Plant and Cell Physiology， 2008， 49（8）： 1150-1164.

[18]ALEMN F， NIEVES-CORDONES M， MARTNEZ V， et al. Differential regulation of the HAK5 genes encoding the high-affinity K+ transporters of Thellungiella halophila and Arabidopsis thaliana[J]. Environmental and Experimental Botany， 2009， 65（2/3）： 263-269.

[19]高秀華. 鹽芥耐鹽相關(guān)基因的功能研究[D]. 濟(jì)南： 山東師范大學(xué)， 2006.

[20]XU X， ZHOU Y， WEI S， et al. Molecular cloning and expression of a Cu/Zn-containing superoxide dismutase from Thellungiella halophila[J]. Molecules and Cells， 2009， 27（4）： 423-428.

[21]WANG X C， CHANG L L， WANG B C， et al. Comparative proteomics of Thellungiella halophila leaves from plants subjected to salinity reveals the importance of chloroplastic starch and soluble sugars in halophyte salt tolerance[J]. Molecular & Cellular Proteomics， 2013， 12（8）： 2174-2195.

[22]CHANG L L， GUO A P， JIN X， et al. The beta subunit of glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase is an important factor for maintaining photosynthesis and plant development under salt stress-Based on an integrative analysis of the structural， physiological and proteomic changes in chloroplasts in Thellungiella halophila[J]. Plant Science， 2015， 236： 223-238.

[23]WANG X C， SHI M J， LU X L， et al. A method for protein extraction from different subcellular fractions of laticifer latex in Hevea brasiliensis compatible with 2-DE and MS[J]. Proteome Science， 2010， 8（1）： 35.

[24]BRADFORD M M. A rapid and sensitive method for the quantization of microgram quantities of protein using the principle of protein-dye binding[J]. Analytical Biochemistry， 1976， 72（1/2）： 248-254.

[25]YAN M， LU Z L， LI B， et al. Comparative proteomics reveals new insights into the endosperm responses to drought， salinity and submergence in germinating wheat seeds[J]. Plant Molecular Biology， 2021， 105（3）： 287-302.

[26]LI J， CUI J， CHENG D， et al. iTRAQ protein profile analysis of sugar beet under salt stress： different coping mechanisms in leaves and roots[J]. BMC Plant Biology， 2020， 20（1）： 347.

[27]劉愛(ài)榮，趙可夫. 鹽脅迫對(duì)鹽芥生長(zhǎng)及硝酸還原酶活性的影響[J]. 植物生理與分子生物學(xué)學(xué)報(bào)， 2005， 31（5）： 469-476.

[28]KATSCHNIG D， BROEKMAN R， ROZEMA J. Salt tolerance in the halophyte Salicornia dolichostachya Moss： growth， morphology and physiology[J]. Environmental and Experimental Botany， 2013， 92： 32-42.

[29]YI X， SUN Y， YANG Q， et al. Quantitative proteomics of Sesuvium portulacastrum leaves revealed that ion transportation by V-ATPase and sugar accumulation in chloroplast played crucial roles in halophyte salt tolerance[J]. Journal of Proteomics， 2014， 99： 84-100.

[30]郭建榮，鄭聰聰，李艷迪，等. NaCl處理對(duì)真鹽生植物鹽地堿蓬根系特征及活力的影響[J]. 植物生理學(xué)報(bào)， 2017， 53（1）： 63-70.

[31]GOUSSI R， MANA A， DERBALI W， et al. Comparative analysis of salt stress， duration and intensity， on the chloroplast ultrastructure and photosynthetic apparatus in Thellungiella salsuginea[J]. Journal of Photochemistry and Photobiology B-Biology， 2018， 183： 275-287.

[32]PANG Q， CHEN S， DAI S， et al. Comparative proteomics of salt tolerance in Arabidopsis thaliana and Thellungiella halophila[J]. Journal of Proteome Research， 2010， 9（5）： 2584-2599.

[33]LIU Z， ZOU L， CHEN C， et al. iTRAQ-based quantitative proteomic analysis of salt stress in Spica Prunellae[J]. Scientific Reports， 2019， 9（1）： 9590.

[34]KUMARI M P， SEKAR K. Effect of plant growth regulators on chlorophyll and carotenoid content of salinity stressed okra seedlings[J]. Asian Journal of Horticulture， 2008， 3（1）： 54-55.

[35]XING W， WANG J， LIU H， et al. Influence of natural saline-alkalistress on chlorophyll content and chloroplast ultrastructure of two contrasting rice（Oryza sativa L. japonica） cultivars[J]. Australian Journal of Crop Science， 2013， 7（2）： 289-292.

[36]SAYYAD-AMIN P， JAHANSOOZ M R， BORZOUEI A， et al. Changes in photosynthetic pigments and chlorophyll-a fluorescence attributes of sweet-forage and grain sorghum cultivars under salt stress[J]. Journal of Biological Physics， 2016， 42（4）： 601-620.

[37]SHOOLINGIN-JORDAN P M. Porphobilinogen deaminase and uroporphyrinogen Ⅲ synthase： structure， molecular biology， and mechanism[J]. Journal of Bioenergetics & Biomembranes， 1995， 27（2）： 181-195.

[38]ELDER G H， ROBERTS A G. Uroporphyrinogen decarboxylase[J]. Journal of Bioenergetics & Biomembranes， 1995， 27（2）： 207-214.

[39]SCHOEFS B， FRANCK F. Protochlorophyllide reduction： mechanisms and evolutions[J]. Photochemistry & Photobiology， 2003， 78（6）： 543-557.

[40]ECKHARDT U， GRIMM B， HRTENSTEINER S. Recent advances in chlorophyll biosynthesis and breakdown in higher plants[J]. Plant Molecular Biology， 2004， 56（1）： 1-14.

[41]IKEGAMI A， YOSHIMURA N， MOTOHASHI K， et al. The CHLI1 subunit of Arabidopsis thaliana magnesium chelatase is a target protein of the chloroplast thioredoxin[J]. Journal of Biological Chemistry， 2007， 282（27）： 19282-19291.

[42]PRUZINSK A， TANNER G， ANDERS I， et al. Chlorophyll breakdown： pheophorbide a oxygenase is a Rieske-type iron-sulfur protein， encoded by the accelerated cell death 1 gene[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America， 2003， 100（25）： 15259-15264.

[43]TURAN S， TRIPATHY B C. Salt-stress induced modulation of chlorophyll biosynthesis during de-etiolation of rice seedlings[J]. Physiologia Plantarum， 2015， 153（3）： 477-491.

[44]HU L， XIANG L， LI S， et al. Beneficial role of spermidine in chlorophyll metabolism and D1 protein content in tomato seedlings under salinity-alkalinity stress[J]. Physiologia Plantarum， 2016， 156（4）： 468-477.

[45]GONG W， XU F， SUN J， et al. iTRAQ-based comparative proteomic analysis of seedling leaves of two upland cotton genotypes differing in salt tolerance[J]. Frontiers in Plant Science， 2017， 8： 2113.

[46]HILDEBRANDT T M， NUNES NESI A， ARAJO W L， et al. Amino acid catabolism in plants[J]. Molecular Plant， 2015， 8（11）： 1563-1579.

[47]HUANG S P， ZENG Y L. Research progress on plant aldehyde dehydrogenase under adversity stresses[J]. Biotechnology Bulletin， 2015， 31（12）： 8-14.

[48]HILDEBRANDT T M. Synthesis versus degradation： directions of amino acid metabolism during Arabidopsis abiotic stress response[J]. Plant Molecular Biology， 2018， 98（1/2）： 121-135.

[49]LIU X， HAN Q， WANG J， et al. Two FgLEU2 genes with different roles in leucine biosynthesis and infection-related morphogenesis in Fusarium graminearum[J]. PLoS One， 2016， 11（11）： e0165927.

[50]KOCHEVENKO A， FERNIE A R. The genetic architecture of branched-chain amino acid accumulation in tomato fruits[J]. Journal of Experimental Botany， 2011， 62（11）： 3895-3906.

[51]HUANG T， JANDER G. Abscisic acid-regulated protein degradation causes osmotic stress-induced accumulation of branched chain amino acids in Arabidopsis thaliana[J]. Planta， 2017， 246（4）： 737-747.

[52]CHEN D， MA X， LI C， et al. A wheat aminocyclopropane-1-carboxylate oxidase gene， TaACO1， negatively regulates salinity stress in Arabidopsis thaliana[J]. Plant Cell Reports， 2014， 33（11）： 1815-1827.

[53]RAMADOSS N， GUPTA D， VAIDYA B N， et al. Functional characterization of 1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid oxidase gene in Arabidopsis thaliana and its potential in providing flood tolerance[J]. Biochemical & Biophysical Research Communications， 2018， 503（1）： 365-370.

[54]GUO Z， TAN J， ZHUO C， et al. Abscisic acid， H2O2 and nitric oxide interactions mediated cold-induced S-adenosylmethionine synthetase in Medicago sativa sub sp. falcata that confers cold tolerance through up-regulating polyamine oxidation[J]. Plant Biotechnology Journal， 2014， 12（5）： 601-612.

[55]KIM S H， KIM S H， PALANIYANDI S A， et al. Expression of potato S-adenosyl-L-methionine synthase （SbSAMS） gene altered developmental characteristics and stress responses in transgenic Arabidopsis plants[J]. Plant Physiology and Biochemistry， 2015，87： 84-91.

[56]MA C， WANG Y， GU D， et al. Overexpression of S-adenosyl-l-methionine synthetase 2 from sugar beet M14 increased Arabidopsis tolerance to salt and oxidative stress[J]. International Journal of Molecular Sciences， 2017， 18（4）： 847.

[57]APEL K， HIRT H. Reactive oxygen species： metabolism， oxidative stress， and signal transduction[J]. Annual Review of Plant Biology， 2004， 55（1）： 373-399.

[58]MAY M J， VERNOUX T， LEAVER C， et al. Glutathione homeostasis in plants： implications for environmental sensing and plant development[J]. Journal of Experimental Botany，1998，49（321）：649-667.

[59]CHOUDHURY F K， DEVIREDDY A R， AZAD R K， et al. Rapid accumulation of glutathione during light stress in Arabidopsis[J]. Plant & Cell Physiology， 2018， 59（9）： 1817-1826.

[60]BELA K， HORVTH E， GALL ， et al. Plant glutathione peroxidases： emerging role of the antioxidant enzymes in plant development and stress responses[J]. Journal of Plant Physiology， 2015， 176（1）： 192-201.

[61]LABROU N E， PAPAGEORGIOU A C， PAVLI O， et al. Plant GSTome： structure and functional role in xenome network and plant stress response[J]. Current Opinion in Biotechnology， 2015， 32： 186-194.

[62]MILLA M， MAURER A， HUETE A R， et al. Glutathione peroxidase genes in Arabidopsis are ubiquitous and regulated by abiotic stresses through diverse signaling pathways[J]. The Plant Journal， 2003， 36（5）： 602-615.

[63]XU J， TIAN Y S， XING X J， et al. Over-expression of AtGSTU19 provides tolerance to salt， drought and methyl viologen stresses in Arabidopsis[J]. Physiologia Plantarum， 2016， 156（2）： 164-175.

[64]KANG S G， JEONG H K， SUH H S. Characterization of a new member of the glutathione peroxidase gene family in Oryza sativa[J]. Molecules & Cells， 2004， 17（1）： 23-28.

[65]GALL ， CSISZR J， SECENJI M， et al. Glutathione transferase activity and expression patterns during grain filling in ag leaves of wheat genotypes differing in drought tolerance： response to water deficit[J]. Journal of Plant Physiology， 2009， 166（17）： 1878-1891.

[66]CSISZR J， GALL A， HORVTH E， et al. Different peroxidase activities and expression of abiotic stress-related peroxidases in apical root segments of wheat genotypes with different drought stress tolerance under osmotic stress[J]. Plant Physiology & Biochemistry， 2012， 52： 119-129.

[67]REZAEI M K， SHOBBAR Z S， SHAHBAZI M， et al. Glutathione S-transferase （GST） family in barley： identification of members， enzyme activity， and gene expression pattern[J]. Journal of Plant Physiology， 2013， 170（14）： 1277-1284.

[68]CHAN C， LAM H M. A putative lambda class glutathione S-transferase enhances plant survival under salinity stress[J]. Plant and Cell Physiology， 2014， 55（3）： 570-579.

[69]GAO F， CHEN J， MA T， et al. The glutathione peroxidase gene family in Thellungiella salsuginea： genome-wide identification， classification， and gene and protein expression analysis under stress conditions[J]. International Journal of Molecular Sciences， 2014， 15（2）： 3319-3335.

[70]LI L J， LU X C， MA H Y， et al. Comparative proteomic analysis reveals the roots response to low root-zone temperature in Malus baccata[J]. Journal of Plant Research， 2018， 131（5）： 865-878.

[71]JIA T， WANG J， CHANG W， et al. Proteomics analysis of E. angustifolia seedlings inoculated with arbuscular mycorrhizal fungi under salt stress[J]. International Journal of Molecular Sciences， 2019， 20（3）： 788.

[72]CHEONG M， YUN D J. Salt-stress signaling[J]. Journal of Plant Biology， 2007， 50（2）： 148-155.

[73]KHAN T A， YUSUF M， AHMAD A， et al. Proteomic and physiological assessment of stress sensitive and tolerant variety of tomato treated with brassinosteroids and hydrogen peroxide under low-temperature stress[J]. Food Chemistry， 2019， 289： 500-511.

[74]BANDURSKA H， NIEDZIELA J， PIETROWSKA-BOREK M， et al. Regulation of proline biosynthesis and resistance to drought stress in two barley （Hordeum vulgare L.） genotypes of different origin[J]. Plant Physiology And Biochemistry， 2017， 118： 427-437.

[75]尹 秀，王 俊，張二豪，等. PEG-6000浸種處理對(duì)甘青青蘭種子萌發(fā)及幼苗抗旱性的影響[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2020，48（13）：168-172.

[76]殷世航，周 賽，黃霄宇，等. 中蔗系列新品種對(duì)干旱脅迫的響應(yīng)及抗旱性評(píng)價(jià)[J].南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2020，51（6）：1339-1345.

[77]任保蘭，耿建建，呂 亞，等. 辣木幼苗對(duì)淹水脅迫的生理響應(yīng)及耐澇性綜合評(píng)價(jià)[J].南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2021，52（3）：789-796.

[78]PREZ-ARELLANO I， CARMONA-ALVAREZ F， MARTNEZ A I， et al. Pyrroline-5-carboxylate synthase and proline biosynthesis： from osmotolerance to rare metabolic disease[J]. Protein Science， 2010， 19（3）： 372-382.

[79]SINGH P， TIWARI A， SINGH S P， et al. Proline biosynthesizing enzymes （glutamate 5-kinase and pyrroline-5-carboxylate reductase） from a model cyanobacterium for desiccation tolerance[J]. Physiology and Molecular Biology of Plants， 2013， 19（4）： 521-528.

[80]DEUSCHLE K， FUNCK D， HELLMANN H， et al. A nuclear gene encoding mitochondrial Δ1-pyrroline-5-carboxylate dehydrogenase and its potential role in protection from proline toxicity[J]. The Plant Journal， 2001， 27（4）： 345-356.

[81]TIKHONOV A N. pH-dependent regulation of electron transport and ATP synthesis in chloroplasts[J]. Photosynthesis Research， 2013， 116（2/3）： 511-534.

[82]WANG L X， PAN D Z， LI J， et al. Proteomic analysis of changes in the Kandelia candel chloroplast proteins reveals pathways associated with salt tolerance[J]. Plant Science， 2015， 231： 159-172.

[83]JI W， CONG R， LI S， et al. Comparative proteomic analysis of soybean leaves and roots by iTRAQ provides insights into response mechanisms to short-term salt stress[J]. Frontiers in Plant Science， 2016， 7： 573.

[84]LIU Z， ZOU L， CHEN C， et al. iTRAQ-based quantitative proteomic analysis of salt stress in Spica Prunellae[J]. Scientific Reports， 2019，9（1）： 9590.

（責(zé)任編輯：陳海霞）

1889500783337