姚新轉(zhuǎn) 張寶會 陳湖芳 呂立堂

摘要：油菜素類固醇（BRs）是必不可少的植物激素，在植物的生長、繁殖以及逆境響應(yīng)中發(fā)揮重要作用。為了驗證該基因的功能，本文構(gòu)建了植物遺傳表達載體，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化法遺傳轉(zhuǎn)化矮牽牛，獲得29 株轉(zhuǎn)基因植株;轉(zhuǎn)基因植物表現(xiàn)為節(jié)間縮短，分枝增多，生長后期表現(xiàn)出葉片延遲衰老;葉綠素含量、可溶性總糖含量、酶活明顯高于野生型， MDA 含量明顯低于野生型;BAS1基因在矮牽牛中的超表達可以提高矮牽牛植株中衰老相關(guān)基因的表達，從而延緩了轉(zhuǎn)基因矮牽牛的衰老。因此，BAS1可用作調(diào)控植物花衰老和延長花壽命的潛在候選基因。

關(guān)鍵詞：BAS1基因;矮牽牛;抗氧化酶活性;相關(guān)基因表達;衰老

中圖分類號：Q812

文獻標(biāo)識碼：A

文章編號：1008-0457（2022）02-0038-006

國際DOI編碼：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2022.02.006

BAS1基因編碼具有羥化酶活性的細(xì)胞色素P450單加氧酶，該酶催化油菜素固醇（BR）C-26的羥基羥化作用，導(dǎo)致BR生理活性的降低或喪失[1]。作為成年植物，BR突變體基本上表現(xiàn)出缺少紅光受體phyB突變體的相反表型。 BR突變體是深綠色，生長緩慢，葉片萎縮且莖短小。另外，BAS1突變體表現(xiàn)出延遲衰老[2]。過表達BAS1的轉(zhuǎn)基因植物顯著降低BR含量，從而導(dǎo)致葉片萎縮，葉片深綠和莖短[3-4]。BAS1過表達誘導(dǎo)的葉片衰老與煙草植物中細(xì)胞分裂素過表達導(dǎo)致的表型非常相似。

異戊烯基轉(zhuǎn)移酶（IPT）催化細(xì)胞分裂素合成的限速步驟。 Gan等[5]研究表明，通過精確控制IPT表達來引發(fā)特定的發(fā)育反應(yīng)。SAG12啟動子僅在衰老開始時才激活I(lǐng)PT表達，這種激活導(dǎo)致衰老過程的抑制[5-6]。通過IPT表達抑制葉片衰老導(dǎo)致衰老特異性啟動子的減弱[7]，從而防止了細(xì)胞分裂素的過量產(chǎn)生，干擾了發(fā)育的其他方面[8]。在SAG12-IPT煙草中，葉片的衰老得到了有效控制，而沒有其他發(fā)育異常[9]。隨后，該方法成功用于水稻[10]、花椰菜[11]、矮牽牛[12]和生菜[13]。

姚新轉(zhuǎn)等[14]使用衰老特異性SAG12啟動子驅(qū)動煙草中BAS1表達，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)SAG12-BAS1基因植物和野生型植物的生長相似。然而，轉(zhuǎn)基因煙草葉片顯示出延遲衰老的特性，主要表現(xiàn)為植物葉片呈深綠色、葉綠素含量增加、保護酶活性增加、細(xì)胞分裂素含量增加、葉片綠色滯留時間延長和延遲的衰老[14]。本研究構(gòu)建了植物遺傳表達載體，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化法遺傳轉(zhuǎn)化矮牽牛衰老延遲，為研究園藝植物奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

矮牽牛植物均在貴州大學(xué)農(nóng)業(yè)生物工程研究所的溫室中生長。PCR引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。其他化學(xué)試劑為國產(chǎn)或進口的分析純化學(xué)品。

1.2矮牽牛的遺傳轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)基因植物鑒定

利用葉盤轉(zhuǎn)化法進行遺傳轉(zhuǎn)化[15]。經(jīng)GUS組織化學(xué)染色和PCR鑒定，獲得轉(zhuǎn)BAS1基因矮牽牛，轉(zhuǎn)BAS1基因矮牽牛出現(xiàn)三種表型（如圖2，按葉片性狀分為表型1：TP28;表型2：TP40;表型3：TP41），本試驗選擇具有相似表型的野生型WT和轉(zhuǎn)基因植物表型1用于隨后的試驗。

1.3生理指標(biāo)的測定

利用分光光度法（721可見分光光度計）測定超氧化物歧化酶（SOD），過氧化物酶（POD）和過氧化氫酶（CAT）的活性和丙二醛（MDA）、葉綠素、可溶性糖含量。按照試劑盒說明書進行操作（蘇州科銘生物技術(shù)有限公司）。

1.4矮牽牛葉片相關(guān)基因表達分析

總RNA提取，根據(jù)試劑盒說明書反轉(zhuǎn)成cDNA。使用ABI 7500實時PCR系統(tǒng)（美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司）進行定量RT-PCR。通過使用QuantiNova SYBR Green PCR試劑盒（目錄號208054;Qiagen，德國）進行熒光定量分析，按照2-△△CT法計算和分析基因的表達水平。每個試驗3次重復(fù)，引物序列見表1。

1.5統(tǒng)計分析

使用Excel 2017軟件（Microsoft，Redmond，USA）和SPSS Statistics 22.0軟件進行統(tǒng)計分析，結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（SD）。

2結(jié)果與分析

2.1農(nóng)桿菌介導(dǎo)的矮牽牛遺傳轉(zhuǎn)化與轉(zhuǎn)基因植株獲得

在植株 3～5葉期對野生型矮牽牛和抗性矮牽牛的葉片進行 GUS 組織化學(xué)染色，結(jié)果顯示野生型矮牽牛植株未檢測到 GUS 活性，抗性矮牽牛植株中檢測到了 GUS 活性（圖1-a）。分別提取野生型矮牽牛和 GUS 組織化學(xué)染色陽性矮牽牛植株的 DNA，以BAS1基因引物進行 PCR 檢測，在野生型矮牽牛植株中未擴增出目的條帶，而轉(zhuǎn)基因植株中獲得了預(yù)期的 419 bp 的目的條帶。證明外源BAS1基因已成功整合到矮牽牛基因組中（圖1-b）。

2.2 矮牽牛植物表型以及BAS1基因的表達分析

野生型和轉(zhuǎn)基因矮牽牛在相同條件下生長，觀察到轉(zhuǎn)基因矮牽牛有三種表型（圖2-a）。轉(zhuǎn)基因植物表型1和野生型表型相似（本試驗選擇表型1進行后續(xù)試驗，包括TP12，TP28和TP38）。與野生型（WT）植物相比，SAG12-BAS1轉(zhuǎn)基因植物（表型2和表型3）表現(xiàn)出較矮小，生長緩慢，較深的綠葉和延遲衰老。表型3顯示最深的綠葉。表型2和表型3中的啟動子可能未受到嚴(yán)格控制，類似于轉(zhuǎn)基因植物中的IPT過表達表型（圖2-a）。圖2-b顯示了三種轉(zhuǎn)基因植物中BAS1基因表達的分析。在表型1和表型2植物中BAS1基因的表達相似，而在表型3中BAS1基因的表達更高（圖2-b）。

2.3 SAG12-BAS1轉(zhuǎn)基因矮牽牛的葉和花衰老

SAG12-BAS1轉(zhuǎn)基因矮牽牛的開花時間為11 d，而野生矮牽牛的開花時間僅為5 d（圖3-a）。生長70 d后，帶有轉(zhuǎn)基因SAG12-BAS1基因的植物被深綠色的葉子完全覆蓋，而野生矮牽牛的葉子為黃色，沒有新的葉子生長。105 d后，WT矮牽牛植物的葉中央部分明顯發(fā)黃，而轉(zhuǎn)基因植物不明顯（圖3-b）。WT矮牽牛幾乎死了，只有幾片黃色的葉子，而轉(zhuǎn)基因矮牽牛正常的生長和發(fā)育。因此，與野生型植物相比，轉(zhuǎn)基因植物的衰老被延遲了超過10～15 d。與野生矮牽牛相比，轉(zhuǎn)基因矮牽牛具有更多的分支，更短的莖和更多的花。

2.4轉(zhuǎn)SAG12-BASA1基因?qū)Π珷颗Ｉ碇笜?biāo)的影響

轉(zhuǎn)基因矮牽牛的葉綠素和可溶性糖含量（平均值）分別比野生型高42.89%和116.8%（圖4）（P<0.05）。轉(zhuǎn)基因矮牽牛的SOD，POD和CAT活性（平均值）分別比野生矮牽牛高82.74%，131.8%和135%。轉(zhuǎn)基因矮牽牛的MDA含量（平均值）比野生矮牽牛的MDA含量低46%（圖5）。因此，在轉(zhuǎn)基因植物中保護酶的活性得到增強，提高了活性氧清除和防止膜脂質(zhì)過氧化以及減少MDA積累。SAG12-BAS1基因的表達增強了矮牽牛植物的抗氧化能力，從而降低了植物膜被破壞的程度，同時提高了植物的抗逆性。

2.5 轉(zhuǎn)基因株系BAS1基因表達及相關(guān)基因的表達

BAS1基因在矮牽牛中表達以及相關(guān)基因表達如圖6所示。結(jié)果表明，與野生型植物相比，轉(zhuǎn)基因植物中調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂素 PhARR2基因和細(xì)胞分裂素受體組氨酸蛋白激酶 PhHK的平均表達量分別顯著增加了2.35倍和2.41倍。與野生型植物相比，矮牽牛 PhGA2ox1和PhGA2ox3的表達在轉(zhuǎn)基因植物中更顯著（分別為11倍和3倍）（P<0.01）。與野生型植物相比，轉(zhuǎn)基因植物中的生長素應(yīng)答因子 PhARF4基因表達水平降低了0.74倍。

3結(jié)論與討論

植物衰老是一個受基因調(diào)控的高度復(fù)雜和有序的過程，具有多層次、多途徑的特點，葉片衰老是植物衰老的主要表現(xiàn)形式[16-18]。本研究結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因矮牽牛延長了10～15 d，同時，影響葉片的衰老信號和保護酶SOD、POD和CAT的活性，與野生矮牽牛相比，轉(zhuǎn)基因矮牽牛葉片中的SOD，POD和CAT活性都提高了。在植物衰老期間，SAG12-BAS1基因的表達提高了植物中保護酶的活性并增強了除氧活性。與野生型相比，轉(zhuǎn)基因矮牽牛的MDA含量低46%，表明轉(zhuǎn)基因矮牽牛的細(xì)胞膜未受到破壞。此外，轉(zhuǎn)基因矮牽牛葉中的葉綠素和可溶性糖含量高于野生型植物。

擬南芥應(yīng)答調(diào)節(jié)器（ARR）基因家族的A型成員的過表達可以產(chǎn)生負(fù)作用調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂素途徑[19]。在本研究中，PhARR2在轉(zhuǎn)基因植物中的表達增加比野生植物提高了2.35倍，表明ARR2正調(diào)控細(xì)胞分裂素的水平。細(xì)胞分裂素受體組氨酸激酶AHK2，AHK3和CREI/AHK4/WOODEN LEG（WOL）與細(xì)胞分裂素結(jié)合并自磷酸化[20]。隨后經(jīng)過其他過程進入細(xì)胞核并將磷酸基團轉(zhuǎn)移到一系列ARR中調(diào)節(jié)下游細(xì)胞分裂素的反應(yīng)，并產(chǎn)生了一系列調(diào)節(jié)植物生長和發(fā)育的生化作用[21]。試驗結(jié)果表明，與野生型相比，轉(zhuǎn)基因矮牽牛中PhAHK的平均表達高2.41倍。 GA2ox表達降低內(nèi)源GA3濃度不僅導(dǎo)致植物矮化，而且改變了種子休眠時間和葉綠素濃度[22]。結(jié)果表明，與野生型相比，轉(zhuǎn)基因矮牽牛中PhGA2ox1和PhGA2ox3的平均表達分別增加了11倍和3倍。在這項研究中，與野生型矮牽牛植物相比，轉(zhuǎn)基因矮牽牛中的PhARF4基因表達被下調(diào)，這表明ARF轉(zhuǎn)錄因子抑制了植物生長素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。

總之，研究表明，在正常狀態(tài)下生長的SAG12-BAS1轉(zhuǎn)基因株系表現(xiàn)出一系列表型變化，包括花蕾數(shù)增加，分支和節(jié)間長度增加，開花延遲，保護酶活性增加以及BAS1相關(guān)基因的表達變化，衰老相關(guān)基因的調(diào)控可能會增加細(xì)胞分裂，降低乙烯含量，并延緩矮牽牛的衰老。但是，作用機理仍不清楚，需要進一步研究。

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Over-Expression of the BAS1 Gene to Delay Senescence in Transgenic Petunia hybrida

Yao Xinzhuan1，Zhang Baohui1，Chen Hufang1，Lv Litang1，2*

（1.College of Tea Science，Guizhou University，Guiyang，Guizhou 550025，China;2.The Key Laboratory of Plant Resources Conservation and Germplasm Innovation in Mountainous Region （Ministry of Education）/Institute of Agro-Bioengineering，Guizhou University，Guiyang，Guizhou 550025，China）

Abstract：Brassinosteroids （BRs） are essential hormones that play an important role in plant growth，reproduction and response to adversity.In order to verify the function of the gene，a plant genetic expression vector was constructed in this paper.Agrobacterium-mediated genetic transformation was used to genetically transform petunia to obtain 29 transgenic plants.The transgenic plants showed shortened internodes，increased branches，and obviously delayed leaf senescencein the late growth period.Transgenic petunia chlorophyll content，total soluble sugar content，and enzyme activity were significantly higher than wild-type，and MDA content of transgenic plants was significantly lower than wildtype.Overexpression of BAS1 gene in petunia can increase the expression of senescence-related genes in petunia plants，thereby prolonging the senescence of transgenic petunia.Therefore，BAS1 can be used as a potential candidate gene for regulating plant flower senescence and extending flower life.

Keywords： BAS1 gene;Petunia hybrida ;antioxidant enzyme activity;related gene expression;senescence

收稿日期：2021-05-06;

修回日期：2021-08-31

基金項目：貴州茶產(chǎn)業(yè)技術(shù)創(chuàng)新中心（黔科中引第[2017] 4005）

通訊作者：呂立堂（1977—），男，博士，教授，主要從事茶樹生物學(xué)和基因工程方面的研究，E-mail：ltlv@gzu.edu.cn.

1857501705307