祁 軍 劉 譽 李浩辰 天津國際旅行衛(wèi)生保健中心（天津，300456）

劉 寅（通信作者） 南開大學醫(yī)學院（天津，300074）

病原體檢測一直是疾病防控當中最重要的一個環(huán)節(jié)。 準確的檢測方法能夠為有效地阻止傳染性疾病擴散提供重要的依據(jù)。 常見的病原體檢測方法可以分為形態(tài)學檢測、生理生化檢測、免疫學檢測以及核酸檢測等。 這其中核酸檢測方法呈現(xiàn)出獨特的優(yōu)勢。 核酸檢測方法基于分子生物學技術(shù)，依靠核酸分子雙鏈堿基互補配對原則，實現(xiàn)對目標核酸的檢測。 傳統(tǒng)的核酸檢測方法大致分為兩類［1-5］：第一類是基于核酸特異性的核酸分子雜交技術(shù)，即具有同源性的核酸單鏈在一定條件下會依據(jù)堿基互補配對原則形成雙鏈。 常見的技術(shù)有Southern DNA印跡雜交，以及核酸生物芯片技術(shù)等，這些方法在酶切圖譜制作、基因克隆篩選、基因突變檢測等科研領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。 第二類是通過在體外模仿體內(nèi)DNA 復制過程，實現(xiàn)對于某段目標序列的擴增。 目前使用的絕大多數(shù)核酸檢測方法均可以歸于這一類別。如聚合酶鏈式反應(yīng)技術(shù)（PCR）、實時熒光定量PCR（Real Time PCR），以及各種核酸等溫擴增技術(shù)（Isothermal Nucleic Acid Testing，INAT）等［6-8］。但是，無論是PCR 方法還是實時熒光PCR 方法，都需要進行變溫循環(huán)，因此上述方法對溫度控制設(shè)備的嚴重依賴，限制了其在檢測中的廣泛應(yīng)用，不利于向基層推廣，特別是在應(yīng)對大量樣品時，將極大延長檢測時間并且降低樣本生物活性。

為了克服PCR 檢測技術(shù)的缺陷，近年來，核酸等溫檢測技術(shù)不斷出現(xiàn)，這些技術(shù)在臨床檢測中發(fā)揮了重要作用的同時顯示出了極大的優(yōu)勢，逐漸成為可以替代PCR 技術(shù)的新型核酸檢測技術(shù)。當下的核酸等溫檢測技術(shù)主要是核酸等溫擴增技術(shù)，該技術(shù)不需要變性、退火和延伸等熱循環(huán)的步驟，因此核酸等溫擴增檢測技術(shù)對儀器的要求極低，僅需要一個恒溫水浴鍋就可以實現(xiàn)反應(yīng)［9-11］。 與PCR 方法類似，核酸等溫擴增技術(shù)具有敏感性高、特異性強等優(yōu)點。 目前常用的核酸等溫擴增技術(shù)有重組酶聚合酶擴增技術(shù) （Recombinase polymerase amplification，RPA）、 環(huán)介導等溫擴增技術(shù) （Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）、 滾 環(huán) 擴 增 技 術(shù)（Rolling circle amplification，RCA）、切刻酶擴增技術(shù)（Nicking endonuclease amplification reaction，NEAR）等［12-14］。核酸等溫擴增技術(shù)由于降低了對檢測設(shè)備的依賴，因此發(fā)展迅速。 但是也存在不足，例如假陽性比例高，引物設(shè)計復雜，體系復雜，成本較高等［15，16］。鑒于此，非擴增核酸等溫檢測技術(shù)應(yīng)運而生。

非擴增核酸等溫檢測技術(shù)并不依賴于目的片段的數(shù)量增加而進行信號放大，而是依靠模板與分子信標探針結(jié)合后切斷探針產(chǎn)生檢測信號。 例如快速等溫檢測技術(shù) （Rapid isothermal detection assay，RIDA）和基于核酸內(nèi)切酶活性的分子信標檢測技術(shù)（Dependence Endonuclease Molecular Beacon Assay，DEMBA）［17，18］。 DEMBA 在具備RIDA 優(yōu)勢的同時，更適合于單鏈RNA 的檢測。 首先，內(nèi)切酶識別的切點位置完全在探針雙鏈上，不受檢測目標序列是否具有核酸內(nèi)切酶識別位點的限制；其次，單鏈RNA模板和探針雜交，改變探針二級結(jié)構(gòu)，并不參與酶切反應(yīng)；第三，核酸內(nèi)切酶種類繁多，為針對不同病原體檢測方法的開發(fā)提供了便利；第四，檢測速度快，在檢測熒光信號的情況下，5 分鐘之內(nèi)即可得到檢測信號。 是一種非常適合于高突變率單鏈RNA病毒的快速檢測技術(shù)。

該技術(shù)的主要不足在于需要進行熒光信號檢測，無法實現(xiàn)現(xiàn)場檢測和自主檢測。 為了進一步推廣該技術(shù)， 本研究中我們通過DEMBA 結(jié)合膠體金檢測試紙， 實現(xiàn)了體溫條件下的無設(shè)備參與檢測，與傳統(tǒng)方法相比，流程進一步簡化。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

本實驗使用到的主要實驗試劑，見表1。

表1 實驗試劑

1.2 探針設(shè)計

根據(jù)中國疾病與預(yù)防控制中心的推薦，我們針對新型冠狀肺炎病毒的ORF lab 和N 基因作為目標序列，開展DEMBA 檢測。 目標序列的長度在35-45 nt 之間。目標序列的特異性通過在NCBI（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/）網(wǎng)頁上BLAST 確定。 最后使用NUPACK 軟件對探針的二級結(jié)構(gòu)、探針和目標序列形成的復合物的二級結(jié)構(gòu)進行評估。 我們設(shè)計了DEMBA 探針P1（見表2），檢測目標序列依次命名為Templte 1。 為了進一步評估探針的特異性，我們針對Templte 1 設(shè)計了具有點突變位點的目標序列，見表2。 其中1MT 和3MT 是目標序列Templte 1對應(yīng)的具有突變堿基的目的序列1MT，在突變堿基點下面劃線。 以1MT 的序列合成了ssDNA 和ssRNA，分別命名為1MT-RNA、1MT-DNA。上述涉及的探針和目標序列都由上海生工生物公司合成。

表2 探針和目標基因的序列

1.3 DEMBA 檢測

DEMBA 檢測體系構(gòu)成如下：反應(yīng)體系的總體積是25 μL，其中包括ddH2O、NEBuffer 2.1[5 mM NaCl，1 mM Tris-HCl，1 mM MgCl2，10 μg/mL BSA（pH7.9，25 ℃）]，BsrDⅠ的反應(yīng)終濃度為100 units/mL，探針終濃度為0.5 μM。 我們優(yōu)化后的通用型DEMBA 反應(yīng)檢測條件是60 ℃孵育40 min，P3 的反應(yīng)混合液61 ℃孵育10 min，然后80 ℃5 min 滅活內(nèi)切酶。

為了系統(tǒng)地評估DEMBA 檢測體系的作用，我們設(shè)置了四個對照組。 通用型DEMBA 反應(yīng)體系及對照組的反應(yīng)體系見表3。 結(jié)果使用電壓8 V/cm 評估DEMBA 檢測結(jié)果。

表3 DEMBA 電泳反應(yīng)體系

1.4 特異性和靈敏度的評估

我們設(shè)計了具有堿基突變DNA 序列1MTDNA 和RNA 序列1MT-RNA，作為參考樣品并對其稀釋后進行熒光DEMBA 檢測。另外，我們將濃度較高的大腸桿菌全基因組DNA 作為背景干擾， 以評估針對DNA 檢測目標物的特異性。 同時我們以等體積的隨機RNA 序列替換目標序列RNA， 以評估針對RNA 檢測目標物的特異性。

為確定DEMBA 的靈敏度， 我們將模板進行梯度稀釋至102copies/μL， 使用梯度稀釋液進行靈敏度評估。

1.5 膠體金檢測

我們將DEMBA 探針兩側(cè)分別標記上FAM 基團和Biotin 基團。 同時將膠體金的金膠墊上浸透金顆粒標記的生物素抗體，T 線上包被FAM 基團抗體，C 線上報備抗生物素抗體的二抗。其基本原理如1 所示。

DEMBA 檢測液從熱循環(huán)儀中取出， 利用渦旋混合儀輕微離心。 取2 mL 的EP 管，加入70 μL 試紙條的配套緩沖液。 而后取8 μL 的稀釋后的反應(yīng)產(chǎn)物混合液滴加在試紙條的樣品墊上；將滴加了反應(yīng)液的試紙條的那端放入含緩沖液的EP 管中。 在15 min 內(nèi)觀察并拍照記錄試紙條的結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 探針的二級結(jié)構(gòu)評估

本文設(shè)計了兩條體溫DEMBA 探針， 它們只有酶切位點不同。 這兩條探針及探針與目標序列的復合物的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果， 由NUPACK 軟件生成。如圖3.2 所示，評估結(jié)果預(yù)測表明沒有目標序列時，探針在37 ℃下均能維持穩(wěn)定的雙發(fā)卡二級結(jié)構(gòu)，沒有呈現(xiàn)內(nèi)切酶位點， 探針不會被酶切割， 如圖2-a所示。當探針和目標序列的濃度比例為1∶1 時，預(yù)測產(chǎn)物只有目標復合物一種，預(yù)測產(chǎn)率100%。 這表明探針和目標序列易于結(jié)合形成復合物，探針具有較強的特異性。 復合物的自由能都比較低，即軟件預(yù)測復合物的結(jié)構(gòu)相對穩(wěn)定。 同時復合物自由能低于探針的自由能， 這顯示探針在被內(nèi)切酶切割后，其他探針在自由能驅(qū)動下傾向于和目標序列形成更穩(wěn)定的Y 字形結(jié)構(gòu)，如圖2-b 所示。

圖2 探針模擬結(jié)構(gòu)分析結(jié)果

2.2 電泳分析

電泳結(jié)果如圖3 所示。 單獨探針的電泳條帶位置在20 bp DNA ladder 的位置附近 （lane 1 和6，band B），目標序列的電泳條帶位置低于20 bp DNA ladder（lane 2 和7，band E），這與探針和目標序列的實際分子大小相當。 探針和目標序列的混合液中，形成新的復合物， 位置在40～60 bp DNA ladder 之間（lane3 和8，band A）。 表明反應(yīng)體系下探針和目標序列結(jié)合形成具有兩條雙鏈Y 字形復合物。 在復合物中加入限制性內(nèi)切酶Bpu 10I 后， 電泳結(jié)果中出現(xiàn)了一條新的條帶C（lane4 和9，band D），它低于電泳條帶的位置卻高于目標序列條帶的位置。 這是內(nèi)切酶切割探針后產(chǎn)生的新碎片。 在沒有目標序列時，探針酶切產(chǎn)物的電泳條帶和純探針電泳條帶位置相同（lane5 和10，band C），表示當目標序列不存在時，探針會維持雙發(fā)卡結(jié)構(gòu)不會被酶切割。

圖3 DEMBA 檢測電泳分析結(jié)果

2.3 DEMBA 結(jié)合膠體金試紙檢測

我 們 使 用 目 標 序 列10、102、103、104copies/μL的梯度稀釋液作為反應(yīng)液進行反應(yīng)， 將DEMBA 反應(yīng)后的反應(yīng)液與緩沖液混合滴加到試紙條，將試紙置于室溫下15 分鐘。 實驗結(jié)果如圖4 所示， 表明102、103、104copies/μL 的標準稀釋液能夠檢測出陽性反應(yīng)。 表明在我們使用DEMBA 檢測技術(shù)開發(fā)的聯(lián)合膠體金RNA 恒溫非擴增檢測法能夠獲得較好的檢測結(jié)果。 特異性檢測中，我們發(fā)現(xiàn)即使單堿基突變的模板也呈現(xiàn)陰性結(jié)果。 證明該技術(shù)有較高的特異性。

圖4 聯(lián)合膠體金RNA 非擴增等溫檢測技術(shù)

3 討論

在摸索DEMBA 探針通用骨架時， 我們嘗試使用Aor13HI （Takara）、BstPI （Takara）、BstBI（NEB）、BsrDI（NEB）等限制性內(nèi)切酶的序列。 但是經(jīng)過實驗發(fā)現(xiàn)，如果以識別序列兩端對稱的酶，作為DEMBA的骨架結(jié)構(gòu)，則在沒有目標序列時，探針可能會出現(xiàn)單發(fā)卡結(jié)構(gòu)。因此我們推薦，在設(shè)計DEMBA 探針時， 使用識別序列兩端不對稱的酶作為DEMBA 的骨架結(jié)構(gòu)。 如果使用識別序列兩端對稱的酶設(shè)計DEMBA 探針，則部分DEMBA 探針由于穩(wěn)定序列部分的結(jié)合力弱于由內(nèi)切酶位點自身相互識別結(jié)合的力， 在沒有目標序列時探針形成了單發(fā)卡結(jié)構(gòu)。但是該結(jié)構(gòu)會呈現(xiàn)內(nèi)切酶位點，讓探針在沒有目標序列時被內(nèi)切酶切割，造成假陽性結(jié)果。 如果要避免該情況，則需要延長DEMBA 探針的穩(wěn)定序列，此時探針長度加長，增加研發(fā)成本，同時容易影響探針的二級結(jié)構(gòu)。

而兩端識別序列具有非對稱性的酶， 如BsrDI作為通用DEMBA 骨架時，通過適當調(diào)整穩(wěn)定序列，可以避免這種情況。 同時，即使探針形成二聚體結(jié)構(gòu)， 內(nèi)切酶位點的部分序列會被DEMBA 探針的其他部分封閉，避免被酶識別，也避免假陽性結(jié)果。 因此在進行通用DEMBA 骨架設(shè)計時， 我們建議以兩端識別序列具有非對稱性的內(nèi)切酶作為骨架的一部分。

我們在設(shè)計過程中， 發(fā)現(xiàn)DEMBA 反應(yīng)混合液中內(nèi)切酶的量遠遠多于需要切割的探針數(shù)量，但是酶消化的目標復合物較少。 當探針兩端不含保護堿基時，電泳結(jié)果顯示，探針和目標序列產(chǎn)生了較多的復合物，但是在復合物反應(yīng)體系中加入內(nèi)切酶消化的結(jié)果卻不理想。 我們推測在反應(yīng)過程中，一方面可能是由于酶切位點序列結(jié)合時受到的阻力較大，酶切位點形成的雙鏈結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，所以酶的識別效果差。 另一方面可能是，在酶切位點序列兩端沒有足夠的位置讓內(nèi)切酶結(jié)合。