王玉玲 劉 譽(yù) 天津國(guó)際旅行衛(wèi)生保健中心（天津，300450）

布魯氏菌病 （Brucellosis）（又稱布氏桿菌?。┦怯刹际蠗U菌（Brucella）引起的人獸共患傳染病，其特征是生殖器官和胎膜發(fā)炎，引起流產(chǎn)、不育和各種組織的局部病灶。 布魯氏菌病在牛、羊、豬等家畜中最常發(fā)生［1］。本病很容易傳播給人，引起一種波浪熱的急性發(fā)熱性疾病，也可以發(fā)展成慢性，引起肌肉、骨骼、心血管系統(tǒng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的嚴(yán)重并發(fā)癥［2］。

布魯氏菌病可通過(guò)口腔、呼吸道、結(jié)膜炎或其他可能的途徑通常是職業(yè)性接觸而感染人，攝入感染的奶制品是對(duì)公共衛(wèi)生的主要危險(xiǎn)［2］。 同時(shí)本病亦可由牛、羊、豬傳染于其它家畜［1］。 由于布魯氏菌病對(duì)公共衛(wèi)生的意義極大，對(duì)畜群的危害大，且廣泛分布于世界各地，可引起不同程度的流行，給畜牧業(yè)和人類的健康帶來(lái)嚴(yán)重危害，世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）將其列為一種對(duì)國(guó)際貿(mào)易有重要影響的疫病［2］。 我國(guó)農(nóng)業(yè)部將其列為二類動(dòng)物疫?。?］，并將其列為進(jìn)境動(dòng)物二類傳染?。?］。

布魯氏菌病主要依靠實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果并結(jié)合流行病學(xué)進(jìn)行確診。 目前常用的血清學(xué)檢測(cè)方法有平板凝集、試管凝集、補(bǔ)體結(jié)合和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)。 本項(xiàng)目研究的熒光偏振檢測(cè)方法是一種新的試驗(yàn)方法， 我國(guó)對(duì)該方法還只是處于了解的階段，還沒(méi)有對(duì)其進(jìn)行相關(guān)研究。

為了適應(yīng)國(guó)際貿(mào)易對(duì)實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)方法發(fā)展的需要，提高我國(guó)人獸共患病的高通量快速檢測(cè)能力和技術(shù)水平，開展本項(xiàng)目研究都具有一定的推動(dòng)作用。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑

布魯氏菌病虎紅平板凝集抗原、 試管凝集抗原、補(bǔ)體結(jié)合抗原、補(bǔ)體、溶血素、標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清、標(biāo)準(zhǔn)陰性血清均購(gòu)自中國(guó)獸藥監(jiān)察所，布魯氏菌病間接ELISA、競(jìng)爭(zhēng)ELISA 試劑盒購(gòu)自cedi，布魯氏菌病熒光偏振試劑盒購(gòu)自美國(guó)。

1.1.2 樣品

檢測(cè)部門提供的布魯氏菌陽(yáng)性樣品血清35 份和布魯氏菌陰性樣品血清1 129 份； 采自某地部分牛養(yǎng)殖區(qū)內(nèi)牛的血清792 份；采自某地部分羊養(yǎng)殖區(qū)內(nèi)綿羊的羊血清459 份；采自牛、羊養(yǎng)殖人員的血清15 名。

1.2 方法

1.2.1 FPA 分析敏感性評(píng)估

用生理鹽水將標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清做1∶10、1∶20、1∶40、1 ∶80、1 ∶90、1 ∶100、1 ∶110、1 ∶120、1 ∶130、1 ∶140、1 ∶150、1∶160、1∶170、1∶180、1∶190、1∶200、1∶220、1∶240、1∶260、1∶280、1∶300、1∶320、1∶340、1∶360、1∶380、1∶400、1∶500、1∶600、1∶640、1∶700、1∶800、1∶900、1∶1 000， 加上標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清原液， 共34 個(gè)稀釋度， 分別進(jìn)行FPA、平板凝集（RBPT）、試管凝集（SAT）、補(bǔ)體結(jié)合（CFT）、iELISA、cELISA 測(cè)試。

1.2.2 FPA 分析特異性評(píng)估

用FPA 方法對(duì)沙門氏菌、霍亂O157、大腸桿菌H7、大腸桿菌O157、腸道艾希氏菌O157、痢疾志賀氏菌I 型、 痢疾志賀氏菌2 型、 鮑氏志賀氏菌1-6型、志賀氏菌屬四種多價(jià)、志賀氏菌屬（福氏多價(jià)）、宋內(nèi)氏志賀氏菌、副結(jié)核、結(jié)核、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌O：9、大腸桿菌O：117、大腸桿菌O：156 等16種陽(yáng)性血清進(jìn)行檢測(cè)；用平板凝集試驗(yàn)、試管凝集試驗(yàn)、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)、間接ELISA 試驗(yàn)、競(jìng)爭(zhēng)ELISA 試驗(yàn)、熒光偏振試驗(yàn)對(duì)小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌O：9、大腸桿菌O：117、大腸桿菌O：156 陽(yáng)性血清進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.3 FPA 重復(fù)性評(píng)估

將沙門氏菌陰性血清、布病標(biāo)準(zhǔn)陰性血清、1：10稀釋的標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清、1：20 稀釋的標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清、1：40 稀釋的標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清、1：80 稀釋的標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清，6 個(gè)試驗(yàn)血清樣品在5 塊板進(jìn)行5 次FPA 試驗(yàn)，每次試驗(yàn)重復(fù)3 次。 同時(shí)將熒光偏振試劑盒中的陰性對(duì)照血清在5 塊板進(jìn)行5 次FPA 試驗(yàn)，每次試驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.2.4 FPA 診斷敏感性和診斷特異性評(píng)估

用FPA 對(duì)1129 份布魯氏菌病陰性血清、35 份布魯氏菌病陽(yáng)性血清進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.5 FPA 重現(xiàn)性評(píng)估取牛、羊、人血清共10 份測(cè)試樣品，經(jīng)8 個(gè)實(shí)驗(yàn)室用FPA 進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.6 FPA 田間試驗(yàn)用FPA 對(duì)養(yǎng)殖區(qū)內(nèi)792 份牛血清、459 份羊血清和15 份養(yǎng)殖人血清進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 FPA 分析敏感性檢測(cè)結(jié)果

敏感性檢測(cè)結(jié)果見表1。從表1 看，當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清被稀釋為1：130 時(shí)， 用FPA 試驗(yàn)檢測(cè)為陽(yáng)性。當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清被稀釋為1：90 時(shí)， 用平板凝集試驗(yàn)檢測(cè)為陽(yáng)性。 當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清被稀釋為1：40 時(shí)，用試管凝集試驗(yàn)檢測(cè)為陽(yáng)性。 當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清被稀釋為1：20 時(shí)，用補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)檢測(cè)為陽(yáng)性。 當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清被稀釋為1：640 時(shí)，用iELISA 試驗(yàn)檢測(cè)為陽(yáng)性。 當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清被稀釋為1：700 時(shí)，用cELISA 試驗(yàn)檢測(cè)仍為陽(yáng)性。分析敏感性從高到低為cELISA＞iELISA＞FPA＞RBT＞SAT＞CFT。

表1 分析敏感性檢測(cè)結(jié)果

表1 分析敏感性檢測(cè)結(jié)果

2.2 FPA 分析特異性檢測(cè)結(jié)果

FPA 抗原與16 種陽(yáng)性血清檢測(cè)結(jié)果見表2，從表2 看， 布魯氏菌病FPA 抗原與測(cè)試的16 種陽(yáng)性血清不發(fā)生交叉反應(yīng)。小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌O：9、大腸桿菌O：117、大腸桿菌O：156 三種病菌陽(yáng)性血清，經(jīng)6 種不同的布魯氏菌病血清學(xué)檢測(cè)方法檢測(cè)結(jié)果見表3。 從表3 看，小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌O：9陽(yáng)性血清在平板凝集試驗(yàn)、 試管凝集試驗(yàn)、 競(jìng)爭(zhēng)ELISA 試驗(yàn)中與布魯氏菌抗原發(fā)生交叉反應(yīng)， 在補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)、熒光偏振試驗(yàn)、間接ELISA 試驗(yàn)中不發(fā)生交叉反應(yīng)；大腸桿菌O117、大腸桿菌O156 在六種試驗(yàn)方法中都不出現(xiàn)交叉反應(yīng)。 檢測(cè)結(jié)果說(shuō)明布魯氏菌病FPA 試驗(yàn)特異性比較高， 比RPT、SAT、cELISA 高，與CFT、iELISA 相當(dāng)。

表2 FPA 特異性測(cè)試結(jié)果

表3 三種病菌不同血清學(xué)試驗(yàn)方法交叉反應(yīng)結(jié)果

2.3 FPA 重復(fù)性檢測(cè)結(jié)果

6 個(gè)試驗(yàn)血清樣品的FPA 重復(fù)性檢測(cè)結(jié)果和FPA 試劑盒陰性對(duì)照血清重復(fù)性檢測(cè)結(jié)果見表4。對(duì)表4 中FPA 檢測(cè)數(shù)值進(jìn)行組間、 組內(nèi)變異系數(shù)計(jì)算，6 份樣品的組內(nèi)變異系數(shù)分別為1.18%、1.14%、0.42% 、1.07% 、0.73% 、0.92% ，組間變異系數(shù) 分 別 為1.99% 、1.49% 、1.08% 、1.34% 、1.14% 、1.11%，試驗(yàn)重復(fù)性變異系數(shù)小于20%，說(shuō)明FPA 試驗(yàn)的重復(fù)性符合試驗(yàn)有效性的要求；FPA 試劑盒陰性對(duì)照血清組內(nèi)變異系數(shù)為1.18%， 組間變異系數(shù)1.99%， 說(shuō)明FPA 試劑盒陰性對(duì)照血清其重復(fù)性是有效的。

表4 FPA 試驗(yàn)結(jié)果

2.4 FPA 診斷敏感性和診斷特異性檢測(cè)結(jié)果

用FPA 對(duì)1129 份布氏桿菌病陰性血清檢測(cè)，結(jié)果是檢測(cè)出10 份陽(yáng)性；用FPA 對(duì)35 份布氏桿菌病陽(yáng)性血清檢測(cè)，結(jié)果是有1 份為陰性。 FPA 的特異性為99.1%（1119/1129）， 敏感性為97%（34/35）。特異性和敏感性均大于95%，說(shuō)明FPA 的特異性和敏感性比較高。

2.5 FPA 重現(xiàn)性檢測(cè)結(jié)果

8 個(gè)實(shí)驗(yàn)室用FPA 對(duì)10 份測(cè)試樣品進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果見表5。 從定性的結(jié)果看，8 個(gè)實(shí)驗(yàn)室10 份牛血清樣品的陰陽(yáng)性判定結(jié)果與樣品的實(shí)際結(jié)果一致。 從定量的結(jié)果看，10 份牛血清樣品的FP值變異系數(shù)均小于20%。說(shuō)明FPA 檢測(cè)方法的重現(xiàn)性符合試驗(yàn)重現(xiàn)性要求。

表5 牛血清重現(xiàn)性測(cè)試結(jié)果

2.6 FPA 田間試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果

792 份牛血清樣品中，經(jīng)FPA 檢測(cè)布魯氏菌病抗體陽(yáng)性的牛有428 份，抗性陽(yáng)性牛占54%，樣品來(lái)源地區(qū)對(duì)牛進(jìn)行布魯氏菌病疫苗接種，試驗(yàn)數(shù)據(jù)并不能說(shuō)明該地區(qū)布魯氏菌病存在流行，樣品牛在臨床上無(wú)發(fā)病病例。 459 份羊血清樣品中， 經(jīng)FPA檢測(cè)無(wú)布魯氏菌病抗體陽(yáng)性的羊，樣品來(lái)源地區(qū)對(duì)羊不進(jìn)行布魯氏菌病疫苗接種，試驗(yàn)數(shù)據(jù)說(shuō)明樣品來(lái)源養(yǎng)殖場(chǎng)內(nèi)不存在布魯氏菌病流行，樣品羊在臨床上無(wú)發(fā)病病例。 15 份人血清樣品中，經(jīng)FPA 檢測(cè)無(wú)布魯氏菌病抗體陽(yáng)性反應(yīng)，樣品來(lái)源人員在臨床上無(wú)發(fā)病癥狀。

3 討論

3.1 FPA 的原理是溶液中的分子作隨機(jī)轉(zhuǎn)動(dòng)，分子的大小是影響轉(zhuǎn)動(dòng)速率的主要因素，與其成反比關(guān)系，因而小分子較大分子轉(zhuǎn)動(dòng)得快。 如果給分子標(biāo)記上熒光色素，通過(guò)一定角度的轉(zhuǎn)動(dòng)時(shí)間即可通過(guò)測(cè)量水平和垂直的偏振光強(qiáng)度來(lái)確定。 因而大分子比轉(zhuǎn)動(dòng)快的小分子發(fā)射更多的偏振光。

一般以分子量小于50KD 的抗原用熒光素標(biāo)記， 熒光標(biāo)記的小分子抗原在溶液中旋轉(zhuǎn)速度快，熒光偏振光強(qiáng)度小。當(dāng)加入被檢血清或全血時(shí)，熒光標(biāo)記的小分子抗原與其相應(yīng)抗體結(jié)合后， 所形成的大分子在溶液中旋轉(zhuǎn)速度變慢， 熒光偏振光強(qiáng)度增大。通過(guò)熒光偏振儀測(cè)量，將獲得的偏振光差值與陰性對(duì)照偏振值比較，即可判定出樣品的陰陽(yáng)性。

3.2 目前在國(guó)際貿(mào)易中，在雙邊簽訂的檢疫議定書中， 對(duì)于動(dòng)物布魯氏菌病檢測(cè)主要采用的方法為RBT、SAT、CFT、ELISA［5］；對(duì)于人的布魯氏菌病檢測(cè)主要采用RBT、SAT、ELISA 試驗(yàn)［6］。國(guó)內(nèi)獸醫(yī)部門對(duì)轄區(qū)內(nèi)的動(dòng)物進(jìn)行布魯氏菌病調(diào)查時(shí)，多采用的也是傳統(tǒng)試驗(yàn)方法，以平板凝集試驗(yàn)居多。 從本項(xiàng)目的研究中看到，F(xiàn)PA 試驗(yàn)的敏感性雖不如ELISA，但比平板凝集、試管凝集、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)高出較多，而且FPA 的特異性與ELISA方法相當(dāng)，本研究說(shuō)明熒光偏振檢測(cè)法用于布氏桿菌病檢測(cè)是可靠和有效的，具有較高的特異性、敏感性和較好的重復(fù)性、重現(xiàn)性，可以替代傳統(tǒng)試驗(yàn)方法成為國(guó)際貿(mào)易議定書中指定的檢測(cè)方法之一。

3.3 熒光偏振檢測(cè)法方法簡(jiǎn)便，所用到的試劑只有結(jié)合物和緩沖反應(yīng)液， 試驗(yàn)所用材料是微量反應(yīng)板。 試驗(yàn)只需將待檢血清加入到反應(yīng)板中，再加入結(jié)合物即可， 省去了ELISA方法中需要洗滌的步驟，與ELISA 相比大量縮短了檢測(cè)時(shí)間和簡(jiǎn)化了試驗(yàn)步驟。 FPA方法在微量反應(yīng)板上進(jìn)行，1 塊板92份樣品在15 分鐘內(nèi)完成試驗(yàn)，快速且通量大，是比較適合用于大批量檢測(cè)、監(jiān)測(cè)人或動(dòng)物布魯氏菌病的血清學(xué)檢測(cè)方法，有較好的應(yīng)用前景。

3.4 從本研究田間試驗(yàn)的檢測(cè)結(jié)果看，試驗(yàn)樣品來(lái)源地區(qū)有54%的牛產(chǎn)生了免疫抗體，另有46%的牛沒(méi)有抗體產(chǎn)生，對(duì)沒(méi)有產(chǎn)生抗體的牛已建議對(duì)其復(fù)種一次疫苗，以加強(qiáng)對(duì)布魯氏菌病的免疫力。 本研究檢測(cè)結(jié)果同時(shí)也提醒相關(guān)部門，接種的布氏桿菌病疫苗抗體產(chǎn)生的比例不高，應(yīng)加強(qiáng)疫苗的質(zhì)量監(jiān)控和效果評(píng)價(jià)。