李彥杰, 蔣夢(mèng)蕓, 楊俊年, 劉仁華, 鐘 彥, 王 晶

(1.重慶三峽學(xué)院 生物與食品工程學(xué)院, 重慶 404100; 2.重慶三峽學(xué)院 教師教育學(xué)院, 重慶 404100)

三峽大壩建成后，因水庫調(diào)度引起的水庫水位變動(dòng)，使得庫區(qū)兩岸形成了垂直落差達(dá)30 m的周期性水淹—露出交替地帶，即三峽庫區(qū)消落帶。水庫水位變化破壞了消落帶原有植被生態(tài)系統(tǒng)，進(jìn)而引發(fā)了諸多生態(tài)環(huán)境問題，恢復(fù)和重建消落帶生態(tài)系統(tǒng)是消落帶治理的關(guān)鍵。

土壤細(xì)菌可促進(jìn)地球養(yǎng)分循環(huán)，改良土壤結(jié)構(gòu)，提高土壤有機(jī)質(zhì)轉(zhuǎn)化，進(jìn)而促進(jìn)植物生長，對(duì)維持植被-土壤生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定具有重要作用[1]。土壤細(xì)菌群落具有明顯的時(shí)空特征，受土壤pH值、養(yǎng)分、質(zhì)地、氣候條件、人工措施、地理位置和植被類型等影響[2-3]。土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)受多種非生物脅迫因子的驅(qū)動(dòng)，塑造后的新群落既作用于逆境下由細(xì)菌介導(dǎo)的土壤養(yǎng)分轉(zhuǎn)化及利用過程，也通過和植物的物質(zhì)交流等共同調(diào)節(jié)植物的抗逆性[4-5]，故分析重建后的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)對(duì)揭示植物的抗逆機(jī)制具有重要意義。此外，土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)多樣性及功能對(duì)植物生存環(huán)境狀況及植被-土壤系統(tǒng)的重建評(píng)價(jià)也具有一定的指示價(jià)值。目前，已有多個(gè)研究表明植被狀況(有植被區(qū)和無植被區(qū)等)[6-8]和水淹高程[9-10]均會(huì)影響三峽庫區(qū)消落帶土壤細(xì)菌群落多樣性，而不同類型的修復(fù)植被對(duì)土壤細(xì)菌群落的影響鮮見報(bào)道。本研究在重慶市萬州區(qū)沱口“三峽水庫消落區(qū)植被修復(fù)試驗(yàn)示范基地”內(nèi)，分別選擇純草地、純林地和覆草林地3種修復(fù)植被樣地土壤為研究對(duì)象，探討不同樣地對(duì)土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響，以期為后續(xù)研究消落帶土壤微生物如何影響植物的耐淹性提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

研究區(qū)塊位于重慶市萬州區(qū)百安壩沱口片區(qū)長江邊的“三峽水庫消落區(qū)植被修復(fù)試驗(yàn)示范基地”(30.77°N，108.43°E)內(nèi)，屬三峽庫區(qū)自然消落帶。萬州區(qū)位于四川盆地東緣，重慶市東北邊緣，地處長江中上游結(jié)合部，屬亞熱帶季風(fēng)濕潤氣候，四季分明，日照充足，冬暖多霧，霜雪稀少，夏熱多伏旱，雨量充沛；多年平均氣溫17.7℃，極端最高氣溫42℃，最低氣溫零下3.7℃，平均年日照時(shí)數(shù)1 484 h，多年平均降水1 243 mm。示范基地在三峽大壩175 m蓄水前大部分為旱作緩坡耕地和梯田耕地。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及采樣方法

示范基地為三峽庫區(qū)自然消落帶，每年隨著三峽大壩的水位變化均經(jīng)歷周期性的水淹—露出的過程。示范基地有純草地、純?nèi)斯ち值亍⒏膊萑斯ち值睾突旖涣值榷喾N不同類型修復(fù)植被區(qū)。純草地有原生區(qū)和多年移栽區(qū)，分布于145～175 m水淹高程，優(yōu)勢種均為狗牙根(Cynodondactylon)，零星可見野古草(Arundinellaanomala)、牛鞭草(Hemarthriacompressa)和蒼耳(Xanthiumsibiricum)等。純?nèi)斯ち值睾透膊萑斯ち值刂饕挥?65～175 m高程，林木均為2012年來陸續(xù)種植的中山杉(Taxodium‘Zhongshanshan’)，其中覆草林地草本優(yōu)勢種為狗牙根。經(jīng)9個(gè)周期性水淹—露出試驗(yàn)，人工林和覆草林地的中山杉成活率超過85%，2012年移栽的純草地和覆草人工林的狗牙根成活率接近100%。2020年4月選擇示范基地165～167 m水淹高程(每年經(jīng)歷最大水淹深度為10～12 m，水淹時(shí)間約為200 d)地勢平緩、露出水面的純草地(A1)、純林地(A2)和覆草林地(A3)為研究對(duì)象，每個(gè)樣地設(shè)置3個(gè)重復(fù)樣帶(5 m×10 m)，各樣帶間隔10 m，3種樣地共有9個(gè)樣帶。

樣帶內(nèi)采取5點(diǎn)取樣法，取5個(gè)樣點(diǎn)表層0—20 cm土壤混合后作為該樣點(diǎn)土樣，樹下土壤采樣在以樹體為原點(diǎn)的50 cm半徑范圍內(nèi)完成。取樣時(shí)首先去除土壤殘枝、落葉和石礫等物，取樣后低溫保存并迅速帶回實(shí)驗(yàn)室。一部分土樣-80℃保存用于微生物多樣性分析，剩余土樣風(fēng)干后用于土壤理化性質(zhì)測定。

1.3 土壤理化性質(zhì)測定

土壤pH值采用水浸提電位法，按土水比為1∶2.5混勻，靜置30 min后測定；土壤有機(jī)碳(soil organic carbon，SOC)采用重鉻酸鉀氧化-外加熱法(NY/T1121.6—2006)測定；土壤全氮(total nitrogen，TN)采用凱氏法(HJ717—2014)測定；土壤全磷(total phosphorus，TP)采用NaOH堿熔-鉬銻抗分光光度法(HJ632—2011)測定。

1.4 土壤DNA提取及16S rDNA測序

用MN NucleoSpin 96 Soi試劑盒(MACHEREY-NAGEL，Germany)提取土壤DNA，并用1%瓊脂糖凝膠電泳和Synergy HTX多功能微孔板檢測儀(BioTek，USA)檢測DNA的完整性和純度。用338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)引物擴(kuò)增細(xì)菌16S rDNA的V3—V4區(qū)。50 μl擴(kuò)增體系：100 ng模板DNA，1.5 μl引物(10 μmol/L)，25 μl 2×PCR buffer for KOD FX Neo(Toyobo，Japan)，1.0 μl KOD FX Neo高效PCR酶(1.0 U/μl) (Toyobo，Japan)和10 μl dNTP(2 mmol/L)。擴(kuò)增條件為：95℃預(yù)變性5 min，95℃變性40 s，55℃退火40 s，72℃延伸40 s，25個(gè)循環(huán)，72℃延伸7 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測后，切膠回收，送至北京百邁客生物科技有限公司用Illumina Hiseq 2500平臺(tái)測序。

1.5 數(shù)據(jù)處理

原始測序數(shù)據(jù)經(jīng)過濾、拼接、嵌合體去除和長度篩選后，在97%相似性水平作OTUs聚類；基于RDP classifier比對(duì)Silva 16S rRNA基因數(shù)據(jù)庫對(duì)所有OTUs代表序列作物種注釋；基于Mothur v.1.30計(jì)算樣品的ACE指數(shù)、Chao1指數(shù)、辛普森指數(shù)和香濃指數(shù)。采用Excel 2019(Microsoftware，USA)作數(shù)據(jù)整理，統(tǒng)計(jì)分析采用R包，其中Kruskal-Wallis法用于評(píng)價(jià)樣本間的微生物多樣性指數(shù)的差異顯著性(α=0.05)，單因素分析和Turkey法用于評(píng)價(jià)樣本間理化因子的差異顯著性(α=0.05)，斯皮爾曼相關(guān)系數(shù)(Spearman correlation coefficient，ρ)用于評(píng)價(jià)土壤理化因子與細(xì)菌多樣性指數(shù)、優(yōu)勢菌屬與土壤理化因子的相關(guān)性；采用Canoco 5.0(Microcomputer power, USA)作冗余分析(redundancy analysis, RDA)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同樣地土壤理化性質(zhì)

由表1可知，純草地(A1)、純林地(A2)和覆草林地(A3)的土壤酸堿度均趨于中性，且三者間無顯著性差異；A1和A3的土壤有機(jī)碳(SOC)含量之間無顯著性差異，但均顯著高于A2(p<0.05)；3種樣地的全氮(TN)和全磷(TP)含量之間無顯著性差異。

表1 不同樣地土壤的理化性質(zhì)

2.2 土壤細(xì)菌群落的α多樣性

對(duì)測序原始數(shù)據(jù)預(yù)處理及OTUs聚類，結(jié)果顯示，A1組共有1 296條OTUs，其中特有OTUs數(shù)目為217；A2共有1 294條OTUs，其中特有OTUs數(shù)目為12；A2共有1 222條OTUs，其中特有OTUs數(shù)目為38；三者共有OTUs數(shù)目為852?；贏CE指數(shù)、Chao1指數(shù)、辛普森指數(shù)和香濃指數(shù)評(píng)估A1，A2和A3的細(xì)菌群落豐富度和多樣性，結(jié)果顯示不同樣地之間的細(xì)菌群落豐富度和多樣性指數(shù)差異均不顯著(表2)。

表2 不同樣地土壤細(xì)菌的α多樣性指數(shù)

2.3 土壤理化因子與細(xì)菌群落多樣性

相關(guān)性分析結(jié)果顯示(表3)，土壤的SOC和TN含量均與細(xì)菌ACE豐富度指數(shù)和香濃多樣性指數(shù)顯著正相關(guān)(p<0.05)，SOC含量與Chao1指數(shù)顯著正相關(guān)(p<0.05)。

表3 土壤理化因子與細(xì)菌群落α多樣性指數(shù)的相關(guān)性

2.4 不同樣地的細(xì)菌群落組成特征

統(tǒng)計(jì)A1，A2和A3樣地在門水平可注釋的相對(duì)豐度排序前10的微生物優(yōu)勢種群依次為變形菌門(Proteobacteria)(36.67%，28.48%，30.67%)、酸桿菌門(Acidobacteria)(20.66%，23.66%，25.79%)、綠彎菌門(Chloroflexi)(13.38%，5.60%，7.61%)、放線菌門(Actinobacteria)(4.27%，11.51%，6.99%)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)(8.21%，8.42%，7.33%)、Rokubacteria(2.69%，6.04%，5.91%)、擬桿菌門(Bacteroidetes)(4.40%，1.07%，1.89%)、Latescibacteria(3.75%，3.00%，3.08%)、硝化螺旋菌門(Nitrospirae)(2.47%，3.46%，3.40%)和厚壁菌門(Firmicutes)(0.95%，3.65%，2.39%)(圖1A)。3種樣地的變形菌門、酸桿菌門、綠彎菌門、放線菌門和芽單胞菌門等種群相對(duì)豐度較高，其中變形菌門和酸桿菌門兩者約占土壤細(xì)菌豐度的52%以上。

如圖1B所示，A1，A2和A3樣地在綱水平上的主要優(yōu)勢種群依次為γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria)(16.53%，12.62%，15.52%)、Subgroup_6(12.28%，6.87%，11.57%)、α-變形桿菌綱(Alphaproteobacteria)(10.61%，9.13%，7.83%)、δ-變形菌綱(Deltaproteobacteria)(9.53%，6.73%，7.32%)、芽單胞菌綱(Gemmatimonadetes)(7.55%，8.30%，7.04%)、NC10(2.69%，6.04%，5.91%)、酸桿菌綱(Acidobacteriia)(2.47%，6.84%，4.47%)、厭氧繩菌綱(Anaerolineae)(8.58%，1.69%，2.83%)、擬桿菌綱(Bacteroidia)(3.98%，0.89%，1.82%)和芽孢桿菌綱(Bacilli)(0.79%，3.20%，1.89%)。3種樣地的γ-變形菌綱、α-變形桿菌綱、δ-變形菌綱和芽單胞菌綱等種群占比較高，其中變形菌門的3種變形菌綱種群占比為30%左右。

2.5 屬水平細(xì)菌優(yōu)勢種群與土壤理化因子的相關(guān)性

在屬水平，A1，A2和A3的群落中平均相對(duì)豐度大于1%的可注釋優(yōu)勢種群有uncultured_bacterium_c_Subgroup_6(12.20%，6.87%，11.56%)，uncultured_bacterium_f_Gemmatimonadaceae(7.25%，7.79%，6.54%)，uncultured_bacterium_o_Rokubacteriales(2.56%，6.01%，5.83%)，RB41(0.58%，5.36%，4.44%)，uncultured_bacterium_p_Latescibacteria(3.40%，2.99%，3.02%)，鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)(3.60%，2.19%，2.31%)，MND1(1.88%，2.34%，3.61%)，硫桿菌屬(Thiobacillus)(3.40%，0.33%，1.14%)，uncultured_bacterium_f_Anaerolineaceae(3.30%，0.54%，1.02%)，芽胞桿菌屬(Bacillus)(0.41%，2.44%，1.00%)。屬水平的細(xì)菌優(yōu)勢種群(相對(duì)豐度大于1%)與土壤理化因子的相關(guān)性分析結(jié)果顯示(表4)，uncultured_bacterium_c_Subgroup_6，硫桿菌屬(Thiobacillus)和uncultured_bacterium_f_Anaerolineaceae等種群的相對(duì)豐度均與土壤SOC和TN含量顯著正相關(guān)(p<0.05)，RB41和芽胞桿菌屬(Bacillus)等種群的相對(duì)豐度均與土壤SOC和TN含量顯著負(fù)相關(guān)(p<0.05)，uncultured_bacterium_o_Rokubacteriales種群的相對(duì)豐度與土壤SOC含量顯著負(fù)相關(guān)(p<0.05)。

圖1 不同樣地細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)

表4 屬水平細(xì)菌優(yōu)勢種群與理化因子的相關(guān)性

進(jìn)一步采取RDA對(duì)土壤理化性質(zhì)和目水平細(xì)菌群落優(yōu)勢種群(相對(duì)豐度Top 10)進(jìn)行限制性排序分析(圖2)，RDA1可解釋總方差的71.85%，RDA2可解釋總方差的5.16%，兩者累積可解釋總方差的77.01%。SOC，TN，pH值和TP均與RDA1負(fù)相關(guān)。條件效應(yīng)分析結(jié)果顯示，SOC是模型的顯著性因子(pseudo-F=10.8，校正p=0.032)，其解釋率為60.7%，即SOC是影響三峽庫區(qū)消落帶土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的主要顯著性因子(p<0.05)。

3 討 論

3.1 消落帶不同修復(fù)植被的土壤理化因子特征

與一般的陸生及水生系統(tǒng)不同的是，消落帶土壤長期處于周期性的淹水—露出環(huán)境中，其土壤理化性質(zhì)不但受土壤植被的影響，也受水文特征及人類活動(dòng)等影響[11-12]。已有研究表明，長期水淹生境下，消落帶酸性或堿性土壤的pH值均逐漸趨于中性，本研究中消落帶不同修復(fù)植被的土壤pH值間無顯著性差異，且均接近中性，其形成可能與消落帶土壤被江水長期浸泡，以及露出時(shí)受雨水沖刷導(dǎo)致的有機(jī)質(zhì)流失有關(guān)[13-14]。土壤SOC儲(chǔ)量不僅受氣候、地形和土壤理化性質(zhì)等自然因素和管理措施、土地利用方式等人為因素的影響，也受植被狀況及其生物凋落物的影響[15-16]。由于純草地(A1)和覆草林地(A3)能提供更多植物凋落物，進(jìn)而導(dǎo)致土壤SOC增加，故這兩種樣地的SOC含量均顯著高于純林地(A2)(p<0.05)，這與已有研究結(jié)果類似[17-18]。土壤TN和TP含量與土母質(zhì)、風(fēng)化淋溶程度、氣候、人為活動(dòng)和植物凋落物等有關(guān)[19-20]。本研究中，3種不同植被樣地的TN和TP含量均較高，且無明顯差別，這與部分研究結(jié)果不符[21]。取樣區(qū)域在三峽水庫蓄水完成前為旱作梯田耕地，且蓄水后在175 m高程以上仍有成片坡菜地，這可能與人工添加的N和P元素遷移有關(guān)。

圖2 目水平土壤細(xì)菌優(yōu)勢種群與理化因子的RDA分析

3.2 消落帶不同修復(fù)植被的土壤細(xì)菌群落特征

土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與植被類型、植物多樣性關(guān)系密切。植物根系分泌物及凋落物為土壤細(xì)菌的生長提供了氨基酸和碳水化合物等重要營養(yǎng)和能源，同時(shí)植物通過根系呼吸作用影響土壤的氣體組分、pH值和氧化還原電位進(jìn)而改善土壤微環(huán)境，共同促進(jìn)土壤細(xì)菌生長及驅(qū)動(dòng)細(xì)菌群落的演替。有研究顯示針葉林、常綠闊葉林、針-闊混交林和竹林4種不同森林植被的土壤細(xì)菌群落顯著不同，不同植被區(qū)土壤均有其特定優(yōu)勢種群[22]。土壤理化性質(zhì)也可單獨(dú)或和植被等共同影響特定土壤環(huán)境下的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)。研究表明，在亞熱帶森林生態(tài)系統(tǒng)早期演替過程中，土壤理化因子、植被類型及多樣性可分別解釋細(xì)菌群落總變異的28%，12%，即兩者共同影響土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)[23]。水淹作為一種非生物脅迫因子，其缺氧和低光環(huán)境可直接影響細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)。此外，水淹環(huán)境影響植被生長，進(jìn)而影響土壤有機(jī)碳等營養(yǎng)組分循環(huán)和累積，也間接影響土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)。有研究顯示，水淹環(huán)境影響三峽庫區(qū)消落帶土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性，其中水位變化是驅(qū)動(dòng)消落帶土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)演替的重要因素[24]。本研究選擇相近水淹高程的消落帶研究樣地，其多年水位變化基本一致，結(jié)果顯示3種修復(fù)植物樣地的細(xì)菌群落豐富度和多樣性無明顯差異。SOC顯著影響屬水平的細(xì)菌Top10優(yōu)勢種群(p<0.05)，結(jié)合表1的土壤理化性質(zhì)，推測相近高程下消落帶的不同修復(fù)植被通過可提供給土壤的有機(jī)碳數(shù)量影響土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)。

3種樣地的優(yōu)勢菌門均為變形菌門(Proteobacteria)和酸桿菌門(Acidobacteria)，且其門、綱水平的Top10優(yōu)勢種群及相對(duì)豐度與多個(gè)相近環(huán)境中土壤細(xì)菌群落組成類似[25]。已有研究表明，變形菌門主要由γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria)、δ-變形菌綱(Deltaproteobacteria和α-變形菌綱(Alphaproteobacteria)等組成，相對(duì)豐度約占土壤細(xì)菌的30%，其可參與土壤的有機(jī)物降解及N元素等養(yǎng)分循環(huán)過程[26]。本研究中，變形菌門(Proteobacteria)γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria)和δ-變形菌綱(Deltaproteobacteria)的平均相對(duì)豐度在純草地(A1)和覆草林地(A3)土壤較高，α-變形菌綱(Alphaproteobacteria)的平均相對(duì)豐度在3種樣地基本一致，顯示不同修復(fù)植被對(duì)消落帶土壤的固氮種群無明顯影響。酸桿菌門(Acidobacteria)具有嗜酸和寡營養(yǎng)等特點(diǎn)，其通過參與纖維素降解和金屬元素循環(huán)等在土壤生態(tài)過程中起重要作用。從A1，A2到A3樣地，土壤的pH值呈下降趨勢，酸桿菌門的相對(duì)豐度呈上升趨勢，這與多個(gè)研究發(fā)現(xiàn)的土壤中酸桿菌的相對(duì)豐度與土壤pH值負(fù)相關(guān)的結(jié)論相符[27]。綠彎菌門(Chloroflexi)厭氧繩菌綱(Anaerolineae)廣泛分布于水生及濕地土壤中，其功能主要與土壤有機(jī)碳的降解有關(guān)[28-29]。純草地(A1)和覆草林地(A3)比純林地(A2)可提供更多植物殘?bào)w，可促進(jìn)與有機(jī)質(zhì)降解的細(xì)菌種群增殖，故這兩種樣地的厭氧繩菌綱(Anaerolineae)相對(duì)豐度較高。

4 結(jié) 論

(1) 相近水淹高程下，三峽庫區(qū)消落帶不同修復(fù)植被類型樣地土壤pH值、TN和TP含量無明顯差別，其中經(jīng)長期淹沒—露出周期后不同樣地土壤的pH值均接近中性。

(2) 相近水淹高程下，三峽庫區(qū)消落帶不同修復(fù)植被類型樣地土壤的細(xì)菌群落豐富度和多樣性無明顯差異。3種樣地土壤的細(xì)菌群落優(yōu)勢種群基本一致，其中變形菌門和酸桿菌門約占門水平土壤細(xì)菌豐度的52%以上，γ-變形菌綱、α-變形桿菌綱、δ-變形菌綱和芽單胞菌綱等約占綱水平土壤細(xì)菌豐度的30%左右。

(3) 消落帶土壤細(xì)菌在屬水平的多個(gè)優(yōu)勢種群與土壤SOC和TN顯著相關(guān)(p<0.05)，其中SOC是三峽庫區(qū)消落帶土壤細(xì)菌群落的主要影響因子(p<0.05)，這可能與不同修復(fù)植被類型可提供的有機(jī)質(zhì)數(shù)量有關(guān)。