李 丹，胡曉紅，徐新娟，杜德兵，吳文艷，王德成，莊 倩，陳志杰，金 柱

(1. 宜昌市第三人民醫(yī)院肺病科，湖北 宜昌 443003；2. 三峽大學(xué)感染與炎癥損傷研究所，湖北 宜昌 443002；3. 三峽大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖北 宜昌 443002)

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌感染引起的一種危害嚴(yán)重的傳染病，根據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)最新報(bào)道，2020年全球新發(fā)結(jié)核病病例約1 000萬，我國超過83萬，依然是全球30個(gè)結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國家之一[1]。在結(jié)核分枝桿菌感染與傳播過程中，某些基因型菌株致病性強(qiáng)、傳播速度快且適應(yīng)性強(qiáng)，容易引起大范圍廣泛傳播和流行，對(duì)結(jié)核病的流行至關(guān)重要。大量數(shù)據(jù)證實(shí)北京基因型菌株是具有相似遺傳背景和高致病性與傳播力的代表，該菌株已在世界多地傳播和流行[2-4]，我國也屢有相關(guān)報(bào)道[5-11]。北京基因型菌株是結(jié)核分枝桿菌家族中傳播迅速和致病性強(qiáng)的一類優(yōu)勢菌株，由于不同地域結(jié)核病的流行病學(xué)差異，不同地域來源的北京家族菌株的特征也不盡相同。Supply等根據(jù)結(jié)核分枝桿菌基因組DNA中特定位點(diǎn)的數(shù)目可變串連重復(fù)序列技術(shù)(variable-number tandem repeat, VNTR)建立的基因型分型方法[12]，經(jīng)過不斷改進(jìn)和優(yōu)化后已廣泛應(yīng)用于結(jié)核病分子流行病學(xué)研究[6-8, 10-11, 13-15]。聯(lián)合VNTR分型結(jié)果、臨床信息及流行病學(xué)數(shù)據(jù)，可將結(jié)核病的傳播鏈與分子流行病學(xué)研究有機(jī)連接，對(duì)了解結(jié)核病的傳播動(dòng)態(tài)十分有價(jià)值。

宜昌位于我國中西部地區(qū)，結(jié)核病歷年位居地區(qū)傳染病報(bào)告發(fā)病率前三位，已成為威脅本地區(qū)人民健康和社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展的重大公共衛(wèi)生問題。北京基因型菌株是結(jié)核分枝桿菌家族最重要的成員。收集本地區(qū)結(jié)核分枝桿菌菌株進(jìn)行鑒定和分型，研究本地區(qū)北京基因型菌株的多態(tài)性，既能揭示本地區(qū)北京基因型菌株的分子流行病學(xué)特征，也能認(rèn)識(shí)和預(yù)測結(jié)核病的發(fā)生和傳播模式，最終為建立適宜本地區(qū)的結(jié)核病監(jiān)測平臺(tái)和制定相應(yīng)的結(jié)核病防控策略提供科學(xué)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 菌株來源 收集2018年1月—2019年12月宜昌地區(qū)(含下轄區(qū)縣)的結(jié)核分枝桿菌菌株，納入標(biāo)準(zhǔn)為痰抗酸染色陽性或痰結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)陽性，并根據(jù)菌株信息核對(duì)患者的流行病學(xué)資料、年齡、性別、病史資料等信息[16]，最終獲得具有完整患者信息的菌株共計(jì)298株。標(biāo)準(zhǔn)菌株H37Rv購自中國藥品生物制品檢定所。

1.2 藥敏試驗(yàn) 所有菌株接種羅氏培養(yǎng)基復(fù)種后，采用比例法對(duì)4種抗結(jié)核藥物進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，培養(yǎng)基內(nèi)藥物的終濃度分別為：異煙肼(INH)0.2 μg/mL，利福平(RFP)40 μg/mL，乙胺丁醇(EMB)2 μg/mL，鏈霉素(SM)4 μg/mL。耐藥標(biāo)準(zhǔn)：含藥培養(yǎng)基菌落數(shù)/對(duì)照培養(yǎng)基菌落數(shù)≥1%即為耐藥。

1.3 北京基因型菌株鑒定 所有菌株接種羅氏培養(yǎng)基復(fù)種，采用煮沸法提取細(xì)菌基因組DNA。按照下述方法操作鑒定菌株是否為北京基因型。第一步設(shè)計(jì)4條引物(表1中1～4號(hào))，PCR擴(kuò)增后，凝膠電泳比較產(chǎn)物大小，如果擴(kuò)增出850 bp和361 bp兩條帶，則說明標(biāo)本DNA屬于人型結(jié)核分枝桿菌，據(jù)此篩選出298個(gè)標(biāo)本中人型結(jié)核分枝桿菌并進(jìn)行北京基因型菌株的鑒定。RD105區(qū)域缺失是北京基因型菌株所特有，針對(duì)RD105區(qū)域設(shè)計(jì)引物進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增鑒定北京基因型菌株。根據(jù)Chen等[17]建立的RD105缺失片段的DTM-PCR檢測方法，設(shè)計(jì)3條引物序列(表1中5～7號(hào))，PCR擴(kuò)增后比較電泳產(chǎn)物，如果只能擴(kuò)增出1 495 bp條帶，則是非北京基因型菌株；如果擴(kuò)增出786 bp的條帶，該標(biāo)本則是北京基因型。電泳結(jié)束后在紫外凝膠成像分析系統(tǒng)下觀察結(jié)果，以國際參考菌株 H37Rv作為對(duì)照。

表1 PCR引物序列

1.4 數(shù)據(jù)分析

1.4.1 分析方法 將所有北京基因型菌株VNTR位點(diǎn)的重復(fù)次數(shù)輸入https://www.miru-vntrplus.org/MIRU/index網(wǎng)站，獲得VNTR分型結(jié)果，各VNTR位點(diǎn)的分辨率和總分辨率用Hunter-Gaston指數(shù)表示，計(jì)算公式為：

其中，n為總的菌株數(shù)，s為獲得的基因型總數(shù)，nj為某基因型的菌株數(shù)。

1.4.2 成簇結(jié)果分析VNTR分型根據(jù)文獻(xiàn)[18-20]方法進(jìn)行優(yōu)化 VNTR重復(fù)單元數(shù)目計(jì)算公式如下，各VNTR重復(fù)單元數(shù)目=(PCR產(chǎn)物長度-各VNTR側(cè)翼片段長度)/重復(fù)單元長度。兩個(gè)或兩個(gè)以上的北京基因型菌株具有完全相同的VNTR圖譜，既認(rèn)為是成簇菌株。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理分析 應(yīng)用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)資料以百分率(%)表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，P≤0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 北京基因型菌株鑒定結(jié)果 共獲得298株臨床菌株，其中260株(占87.25%)鑒定為人型結(jié)核分枝桿菌，見圖1；DTM-PCR分型結(jié)果發(fā)現(xiàn)，260株結(jié)核分枝桿菌中，140株(53.85%)屬于北京基因型菌株，見圖2。

注：M為DNA Marker，1～10為結(jié)核分枝桿菌的標(biāo)本，電泳檢測出現(xiàn)850、361 bp 兩條帶，說明模板DNA 是人型結(jié)核分枝桿菌，只擴(kuò)增出850 bp條帶的標(biāo)本4和10則屬于結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群，不是人型結(jié)核分枝桿菌。

注：M為DNA Marker，1～10為結(jié)核分枝桿菌的標(biāo)本，電泳檢測出現(xiàn)786 bp條帶的標(biāo)本，則為北京基因型菌株，而出現(xiàn)1 495 bp的標(biāo)本為非北京基因型菌株。

2.2 臨床菌株基本信息 分析260株人型結(jié)核分枝菌株來源的患者信息，其中162例男性，98 例女性患者；年齡范圍為 14～82歲，平均年齡49歲。<30歲、30～歲、45～歲和>60歲患者分別為24、60、97、79例，各年齡組感染北京基因型菌株的比率分別為9.28%、22.86%、36.43%、31.43%，北京基因型菌株和非北京基因型菌株感染患者性別、年齡以及治療史各組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)，見表2。

2.3 臨床菌株藥敏試驗(yàn)結(jié)果 對(duì)260株人型結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行一線抗結(jié)核藥藥敏試驗(yàn)，4種抗結(jié)核藥中，總體耐藥率由高至低依次為：INH>RFP>EMB>SM；北京基因型菌株耐藥率 (32.14%) 高于非北京基因型菌株耐藥率(10.83%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.007)。見表3。

2.4 VNTR基因分型 VNTR-9位點(diǎn)(QUB-11b、QUB-18、QUB-26、MIRU26、MIRU31、MIRU40、Mtub21、Mtub04、VNTR2372)的分辨能力見表4，其中QUB-11b、QUB-18、QUB-26顯示較高的HGI，而VNTR2372顯示較低的HGI，VNTR-9位點(diǎn)的HGI為0.998 5。VNTR-9位點(diǎn)的分型結(jié)果顯示，140株北京基因型菌株呈明顯的多態(tài)性(見圖3)，根據(jù)MIRU-VNTR位點(diǎn)規(guī)則，發(fā)現(xiàn)有3組成簇菌株，其中一個(gè)基因簇包含8株菌株，成簇率為12.15%。

圖3 140株北京基因型菌株聚類分析圖譜

3 討論

結(jié)核分枝桿菌北京基因型家族易導(dǎo)致大范圍感染與流行，基因型鑒定和分型相關(guān)研究引起了廣泛關(guān)注。相較于傳統(tǒng)針對(duì)IS6110序列的RFLP和spoligotyping鑒定手段，Chen等[17]建立的DTM-PCR鑒定方法操作簡單。北京基因型家族菌株缺乏RD105區(qū)域，而非北京基因型菌株保留有該區(qū)域，因此針對(duì)RD105區(qū)域設(shè)計(jì)引物進(jìn)行多重?cái)U(kuò)增，能獲得不同長度的DNA片段，以區(qū)分北京基因型或非北京基因型。該方法簡單、高效，已廣泛應(yīng)用于北京基因型菌株的鑒定[8-10, 21-25]。本研究對(duì)260株人型結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行DTM-PCR檢測，發(fā)現(xiàn)140株為北京基因型菌株，與丁冰冰等[26]報(bào)道武漢地區(qū)所選的85株菌株中91.8%(78株)為北京基因型菌株存在一定差異。本研究首次對(duì)宜昌地區(qū)北京基因型菌株進(jìn)行鑒定，結(jié)果表明北京基因菌株在該地區(qū)的感染與發(fā)病中占據(jù)優(yōu)勢地位，同時(shí)也需要關(guān)注非北京基因型菌株相關(guān)研究。

北京基因型菌株是耐藥結(jié)核病流行的重要原因。本研究結(jié)果顯示，北京基因型菌株耐藥率 (32.14%)，與全國的調(diào)查結(jié)果基本一致(33.10%)，高于非北京基因型菌株耐藥率(10.83%)，結(jié)果顯示宜昌地區(qū)結(jié)核分枝桿菌的耐藥性以北京基因型菌株為主，研究結(jié)果對(duì)指導(dǎo)本地耐藥結(jié)核病的防控具有重大意義。由于結(jié)核分枝桿菌受宿主因素和環(huán)境因素等多因素影響，關(guān)于宜昌地區(qū)北京基因型菌株的生物學(xué)特征還需進(jìn)一步探索。

VNTR已廣泛應(yīng)用于對(duì)北京基因型菌株的分型和成簇的研究。Mazars選擇了VNTR-12位點(diǎn)對(duì)來自美國的72株結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行分型，發(fā)現(xiàn)VNTR-12位點(diǎn)的分辨率高于IS6110-RFLP[27]。Supply基于全球結(jié)核分枝桿菌菌株信息大量數(shù)據(jù)，對(duì)VNTR-12分型技術(shù)進(jìn)行了改進(jìn)，推出了VNTR-15及-24位點(diǎn)的分型技術(shù)[12]。隨著VNTR-12、15及24位點(diǎn)分型技術(shù)的應(yīng)用，研究者發(fā)現(xiàn)這些位點(diǎn)是針對(duì)所有來源的菌株，但對(duì)北京基因型菌株的識(shí)別能力尚有不足。Zhang等[20]針對(duì)北京基因型菌株的特點(diǎn)，比較45個(gè)用于北京基因型菌株分型的VNTR位點(diǎn)的分辨率，最后推薦VNTR-7和VNTR-16位點(diǎn)可作為北京基因型菌株的分型。后續(xù)研究對(duì)VNTR-7和VNTR-16位點(diǎn)進(jìn)一步進(jìn)行優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)VNTR-9位點(diǎn)對(duì)結(jié)核分枝桿菌北京基因型菌株具有較好的識(shí)別能力[18]，目前已得到廣泛應(yīng)用[28-30]。本研究中發(fā)現(xiàn)QUB-11b位點(diǎn)的識(shí)別能力最強(qiáng)，且總HGI為0.998 5，說明該方法對(duì)本地區(qū)北京基因型菌株具有較高的分辨能力。

本研究首次運(yùn)用DTM-PCR和VNTR-9位點(diǎn)技術(shù)對(duì)宜昌地區(qū)的北京基因型菌株進(jìn)行鑒定和分型，相對(duì)于劉曉俊等[31]采用的VNTR-24位點(diǎn)對(duì)2016—2017年宜昌地區(qū)收集的367株結(jié)核分枝桿菌的分型結(jié)果，本研究重點(diǎn)對(duì)該地區(qū)北京基因型菌株進(jìn)行了鑒定和分型，結(jié)果表明目前本地區(qū)的北京基因型菌株仍然處于流行的優(yōu)勢地位。另外，使用VNTR-24分型方法，位點(diǎn)多、操作繁瑣，且部分位點(diǎn)不適合于本地區(qū)菌株的檢測。本研究中采用DTM-PCR和VNTR-9位點(diǎn)對(duì)北京基因型菌株具有較高的鑒定和分型能力，操作簡單，節(jié)約時(shí)間和操作成本，適用于本地區(qū)結(jié)核分枝桿菌北京基因型菌株的快速鑒定和分型，為宜昌地區(qū)北京基因型菌株分子流行病學(xué)的研究和結(jié)核病防治提供科學(xué)依據(jù)。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。