李 靜，胡同平，張文蘭，李雅倩，李洪甫

(包頭醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院檢驗科，內(nèi)蒙古 包頭 014010)

金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus， SA)作為一種侵襲性細菌，可存在于不同組織類型中而引起多種疾病[1]，從淺表皮膚損傷到危及生命的中毒或菌血癥。SA廣泛的致病性和對抗菌藥物的耐藥性均由所攜帶的毒力基因所致。毒力基因編碼產(chǎn)物可以表達分泌多種與細胞表面相關的毒力因子，從而促進SA與宿主細胞外基質(zhì)成分黏附、對宿主細胞的損傷、與宿主免疫系統(tǒng)的對抗[2]。已知SA至少有25種不同的毒素、15種微生物表面成分、20種免疫逃避分子和其他幾種毒力因子。同時SA菌株又是異質(zhì)性的，不同的耐藥性和毒力模式?jīng)Q定宿主不同的臨床感染程度和結(jié)局。鑒于SA，尤其是耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin-resistantStaphylococcusaureus， MRSA)對多種抗菌藥物的耐藥性，給臨床治療帶來極大困難，因此，從基因水平闡述SA的致病機制，對于制定新的治療措施至關重要?，F(xiàn)將臨床分離SA的臨床特征、毒力基因攜帶情況及耐藥情況報告如下。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 收集2018年1月—2020年12月包頭市參加全國細菌耐藥監(jiān)測網(wǎng)11所成員醫(yī)院臨床分離的SA，標本主要來源于上述醫(yī)院門診及住院患者的臨床送檢標本，所有標本均來源于不同患者。將收集到的菌株按照醫(yī)院進行分層抽樣，從中抽取樣本作為試驗菌株進行毒力基因檢測。質(zhì)控菌株：金黃色葡萄球菌ATCC 25923，購于衛(wèi)生部臨床檢驗中心。

1.2 資料來源 回顧性分析納入菌株來源患者的病歷資料，收集臨床資料，包括年齡、性別、基礎疾病、住院時間、預后和感染相關指標。

1.3 分組 根據(jù)患者預后情況的不同將預后分為治愈：治愈出院；未治愈：自動出院(包括轉(zhuǎn)院)；死亡。

1.4 儀器及試劑 XN-10(B4)全自動模塊式血液體液分析儀、ACLTOP700全自動血凝儀、PA-990特定蛋白儀、Cobas e411羅氏電化學發(fā)光儀、PCR擴增儀(美國Bio-Rad)、凝膠成像儀及凝膠電泳儀(美國Bio-Rad)、VITEK 2 Compact微生物分析儀(法國梅里埃)；MH瓊脂和含5%脫纖維羊血MH瓊脂為英國OXOID公司產(chǎn)品、抗菌藥物紙片和利奈唑胺E試驗條為法國生物梅里埃公司產(chǎn)品、青霉素和萬古霉素E試驗條為鄭州安圖生物工程股份有限公司產(chǎn)品；基因組提取試劑盒、PCR試劑、DNA marker 以及PCR引物均來自北京瀚海拓新公司產(chǎn)品。

1.5 方法

1.5.1 感染相關指標的檢測 采用XN-10(B4)全自動模塊式血液體液分析儀檢測白細胞數(shù)(WBC)、C反應蛋白(CRP)、中性粒細胞計數(shù)(N)、中性粒細胞百分比(N%)、血小板計數(shù)(PLT)；ACLTOP700全自動血凝儀檢測纖維蛋白原(FIB)、D-二聚體(D-D)、纖維蛋白原降解產(chǎn)物(FDP)、凝血酶原時間(PT)；PA-990特定蛋白儀檢測血清淀粉樣蛋白(SAA)；Cobas e411羅氏電化學發(fā)光儀檢測降鈣素原(PCT)、白細胞介素-6(IL-6)。

1.5.2 細菌鑒定與藥敏試驗 參照美國臨床和實驗室標準協(xié)會(CLSI)2019年版[3]文件推薦的方法進行判斷，采用KB法聯(lián)合全自動藥敏儀法。采用法國生物梅里埃VITEK 2 Compact或美國BD公司的全自動細菌鑒定和藥敏儀及配套檢測卡進行細菌鑒定和藥敏試驗。

1.5.3 DNA提取 將收集的金黃色葡萄球菌接種到血平板37℃過夜培養(yǎng)，挑取菌落至裂解液中制成菌懸液后，按照基因組提取試劑盒說明提取金黃色葡萄球菌基因組，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.4 毒力基因的檢測 采用PCR法檢測毒力基因的表達情況。反應程序為預變性94℃ 5 min，變性94℃ 60 s，退火55℃ 60 s，延伸72℃ 60 s，共25個循環(huán)，最后延伸72℃ 10 min。同時設置陽性對照和陰性對照，陽性對照為人工合成的目標基因DNA片段，陰性對照為蒸餾水。PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠成像儀觀察和保存擴增結(jié)果。PCR引物序列及產(chǎn)物長度見表1。

表1 PCR 引物序列和擴增片段大小

1.5.5 統(tǒng)計學方法 應用WHONET 5.6及SPSS 22.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行分析。采用χ2檢驗或χ2分割法進行比較；符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差表示，非正態(tài)計量資料以中位數(shù)表示。P≤0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 收集菌株情況 2018年1月—2020年12月共收集SA 2 452株。2 452例SA感染患者中外科感染(包括膿腫、傷口感染)932例，呼吸道感染504例，血流感染172例，其他類型感染844例。

2.2 不同感染類型患者的臨床特征 2 452例SA感染患者以男性為主(68.23%)，不同感染類型SA的患者人群分布也以男性為主。不同性別、年齡SA感染患者的感染類型分布情況比較，差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.001)。外科感染、呼吸道感染、血流感染主要以<60歲患者為主。外科感染患者住院時間>2周的比率較高，占39.21%。呼吸道感染SA患者的病死率較高，為76.39%。見表2。

表2 不同感染類型SA感染患者的臨床特征

2.3 不同感染類型患者的感染相關指標特征 無論何種感染類型，WBC、N%、PLT、CRP、IL-6均高于正常范圍。不同感染類型患者的WBC、N、N%、PLT、PT水平比較，差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)，見表3。不同感染類型患者的CRP、PCT、IL-6、D-D、FDP水平比較，差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)，見表4。

表3 不同感染類型患者的感染相關指標特征

表4 不同感染類型患者的感染相關指標特征[M(P25, P75)]

2.4 不同感染類型SA毒力基因檢出情況 將2 452株SA按照醫(yī)院進行分層抽樣，從中抽取一個容量為80的樣本作為試驗菌株進行毒力基因檢測。其中38株SA來源于外科感染標本，9株來源于呼吸道感染標本，10株來源于血流感染標本，23株來源其他感染標本。80株菌株幾乎都攜帶clfa(100.00%)、

clfb(98.75%)、scn(93.75%)、coa(97.50%)、nuc(100.00%)、hla(100.00%)、hld(100.00%)基因。sak基因陽性株72株(90.00%)，fnbB基因陽性株39株(48.75%)，eno基因陽性株69株(86.25%)，ebps基因陽性株12株(15.00%)，chp基因陽性株63株(78.75%)，cna基因陽性株24株(30.00%)。bbp基因僅存在于外科感染和血流感染(共3株，3.75%)，eta基因僅在其他感染中攜帶(1株，1.25%)，pvl和seb基因陽性株分別為23株(28.75%)、26株(32.50%)，tsst基因僅在外科感染和呼吸道感染中攜帶(2株，2.50%)，seh基因存在于外科感染和血流感染(5株，6.25%)。LukED基因陽性株26株(32.50%)，且在外科感染中的檢出率高于其他3種感染類型，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表5。毒力基因電泳圖見圖1。

表5 不同感染類型SA毒力基因檢出情況[株(%)]

圖1 毒力基因pvl擴增產(chǎn)物電泳圖

Figure1Electrophoretic map of amplified product ofpvlvirulence gene

表6 不同感染類型檢出MRSA與MSSA對常用抗菌藥物的耐藥率(%)

3 討論

本研究中，不同感染類型的SA感染患者人群分布以男性為主。Katoulis等[4]研究發(fā)現(xiàn)，化膿性汗腺炎/痤瘡是一種好發(fā)于腋窩、腹股溝和肛門生殖器汗腺承載區(qū)域的毛囊皮膚病，患有該類疾病的人群，其SA定植率略高于普通人群。與女性相比，男性因雄激素作用，毛發(fā)長，油脂分泌多，使SA定植率更高[5]，從而好發(fā)SA感染。研究[6]表明，SA感染隨年齡增長而增加，而Anderson等[7]表明SA感染在年輕患者中更常見。本研究發(fā)現(xiàn)SA感染患者多數(shù)<60歲，此結(jié)果是否與SA體表攜帶有關還有待研究。

本研究發(fā)現(xiàn)，外科感染SA患者住院日數(shù)>2周的比率較高，其次為呼吸道感染；呼吸道感染SA患者的病死率較高，其次為血流感染。本研究2 452例病例中，血流感染SA患者多數(shù)患有血液病、免疫缺陷疾病等全身反應性疾??；而呼吸道感染SA患者多數(shù)合并其他疾病，如腦卒中、腦外傷等，多數(shù)長期臥床，易增加治療難度，延長住院時間。國外研究[8-9]表明，長時間住院、中心靜脈置管等是MRSA感染的危險因素，因此呼吸道感染及血流感染SA患者增加了MRSA感染的風險，常常預后不佳，病死率高。

血流感染SA患者感染時常導致全身炎癥反應，使WBC、N、N%、PT、PLT等感染指標發(fā)生變化。本研究發(fā)現(xiàn)，血流感染W(wǎng)BC、N、N%、PT、CRP、PCT、IL-6和FDP水平均高于其他三種感染類型。研究[10]表明PCT水平能反映膿毒癥患者病情的嚴重程度及評價后續(xù)治療效果；而D-D、FDP水平在血流感染中升高后續(xù)可預測彌散性血管內(nèi)凝血(DIC)。因此，積極監(jiān)測血流感染SA患者的CRP、PCT、IL-6、D-D和FDP等感染指標，對感染的診斷及治療具有重要意義。

本研究對80株SA的20個毒力基因進行檢測，發(fā)現(xiàn)80株SA均攜帶clfa、nuc、hla、hld基因，90%以上的菌株攜帶clfb、scn、coa、sak基因。其中黏附素基因fnbB基因檢出率為48.75%，bbp基因檢出率為3.75%，白細胞毒素pvl基因檢出率為28.75%，LukED基因在外科感染中的檢出率高于其他三種感染類型。

SA生物被膜的形成可以使細菌躲避人體免疫系統(tǒng)的攻擊，從而導致慢性感染和復發(fā)感染。研究[11]表明，70%以上的感染與生物膜的形成有關，而致病性的SA在表面形成生物膜的能力則更強。生物膜的形成通常被描述為兩個主要階段：黏附和增殖。黏附階段主要由黏附素基因所介導，該基因主要包括clfa、clfb、fnbA、fnbB、cna、bbp、ebps和eno。clfa基因所表達的纖維蛋白原結(jié)合蛋白，能夠與血小板結(jié)合，并促進SA在血漿中的聚集[12]。而clfb基因的表達使SA具有定植于鼻上皮細胞的能力[13]，同時，該基因也是導致膿毒癥轉(zhuǎn)移性感染的關鍵毒力因子。本研究中，clfa基因的檢出率為100%，與研究[14]結(jié)果一致。clfa和clfb基因的高流行率表明該基因在SA的致病性以及不同表面的定植中起決定性作用。

fnbA和fnbB基因表達的纖維連接蛋白結(jié)合蛋白可以作為信號細胞和肌動蛋白細胞骨架重排的中介物，同時該基因能夠促進SA在組織中的侵襲[15]。fnbB基因在角膜炎、骨髓炎、醫(yī)療器械表面陽性率較高，在骨科感染患者分離的菌株中也常檢測到。本研究fnbB基因的檢出率為48.75%，在Soltani等[16]的研究中其檢出率為43.6%，而在一項關于血流感染的研究[17]中其檢出率為29.5%，表明fnbB基因具有異質(zhì)性特點，在不同的臨床標本中其檢出率具有差異。

本研究bbp基因的檢出率僅為3.75%，與Kot等[18]結(jié)論類似。既往研究[19]表明，SA攜帶bbp基因比攜帶其他生物膜相關的基因產(chǎn)生更強的生物膜，但由于其流行率較低導致研究受到限制。bbp基因可以編碼一種與骨涎蛋白有親和力的蛋白質(zhì)，也有研究[20]表明其與血源性骨髓炎或關節(jié)炎顯著相關。這一發(fā)現(xiàn)也解釋了本研究中攜帶bbp基因的3例患者，其中2例腰椎管狹窄，另外1例患有急性骨髓炎。

白細胞毒素pvl是臨床感染的內(nèi)源性宿主，對中性粒細胞有重要的細胞毒作用[21]。在低濃度時會導致細胞凋亡，高濃度時會導致壞死。相關報道[22]顯示，pvl基因的陽性率為2%～35% ，本研究中28.75%的陽性率接近類似研究的上限。同時pvl基因表達水平的提高能增加MRSA的毒性，引起病死率高達75%的壞死性肺炎[22]。白細胞毒素LukED通過形成低聚孔隙樣結(jié)構導致中性粒細胞和淋巴細胞的死亡。研究[23]表明，LukED基因在不同SA感染類型中的檢出率存在差異，如血流感染中LukED基因的檢出率高于呼吸道感染。本研究中LukED基因在外科感染(44.74%)和血流感染(40.00%)中的檢出率均高于呼吸道感染(0)和其他類型感染(21.74%)。說明相比于呼吸道感染和其他類型感染，血流感染和外科感染的SA更容易攜帶LukED基因，可能具有更高的致病性。

綜上所述，不同感染類型SA攜帶多種毒力基因，且對多種抗菌藥物耐藥。臨床醫(yī)務人員應加強SA的耐藥及毒力動態(tài)監(jiān)測，合理選擇抗菌藥物，有效控制SA感染流行。同時本研究也存在一定的局限性，進行毒力基因檢測的菌株數(shù)量少，僅對SA的耐藥特點、臨床特征及毒力基因的攜帶情況進行闡述，對SA產(chǎn)生高毒力的原因仍不明確，還需結(jié)合流行病學特征以及毒力調(diào)控系統(tǒng)等方面對SA致病機制進一步探索。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。