曹慧珍，王瑾瑜，王文娟

（清華大學(xué)生物醫(yī)學(xué)測試中心尼康生物影像中心，北京100084）

全內(nèi)反射熒光顯微鏡（Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy，TIRFM）特異性地照亮蓋玻片/樣品界面附近的熒光團(tuán)，抑制來自細(xì)胞更深層的背景[1-2]，廣泛應(yīng)用于質(zhì)膜附近的生物過程研究中，例如細(xì)胞粘附位點、囊泡胞吐和內(nèi)吞作用或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)/質(zhì)膜接觸位點等[3-4]。熒光漂白后恢復(fù)（Fluorescence Recovery After Photobleaching，F(xiàn)RAP）技術(shù)是研究分子遷移特性的技術(shù)?；谌珒?nèi)反射顯微鏡的熒光漂白后恢復(fù)實驗（Total Internal Reflection/Fluorescence Recovery After Photobleaching，IR/FRAP）將TIRFM和FRAP技術(shù)相結(jié)合，測量蓋玻片/樣品界面分子的動力學(xué)數(shù)據(jù)，是研究質(zhì)膜附近分子動力學(xué)的有力工具[5]。

但是目前商品化設(shè)備的TIRFM標(biāo)準(zhǔn)配置不能很好地進(jìn)行TIR/FRAP實驗。在TIRF顯微鏡上進(jìn)行FRAP實驗的通用方案是TIRF狀態(tài)下使用強(qiáng)光對整個成像區(qū)域進(jìn)行光漂白，使用低強(qiáng)度的光照采集漂白前后的TIRF圖像[4，6-11]。這種實驗方法對于研究體外蛋白質(zhì)分子或人工膜的動力學(xué)是可行的，漂白視野即成像視野僅占整個體系的極少的一部分[8]，符合通用FRAP結(jié)果擬合分析中漂白區(qū)域是整個體系一部分的假設(shè)[12]。但是對于細(xì)胞來說，每個細(xì)胞是相對獨立的，即每個細(xì)胞可以成為獨立的體系，漂白整個細(xì)胞后，無法觀察到二維平面的分子運(yùn)動情況；另外，細(xì)胞的被漂白區(qū)域太大也很可能會對細(xì)胞造成光損傷，影響細(xì)胞狀態(tài)，獲取錯誤的實驗結(jié)果。此外FRAP實驗中，圖像采集過程也存在光漂白，在成像視野中需選擇未漂白的區(qū)域作為參考區(qū)域分析，可以很容易地校正這種成像中光漂白對FRAP結(jié)果的干擾，更方便快捷地獲取準(zhǔn)確的樣品動力學(xué)數(shù)據(jù)。因此，發(fā)展能夠進(jìn)行感興趣區(qū)域特異性漂白的基于全內(nèi)反射成像的熒光漂白后恢復(fù)技術(shù)對于研究細(xì)胞質(zhì)膜的分子動力過程有著非常重要的作用。

基于本平臺的成像設(shè)備提出了一種TIR/FRAP技術(shù)的實驗方法，可以僅漂白多個任意位置的感興趣區(qū)域（ROI），并采集漂白前后TIRF圖像。

1 實驗方法

采用一臺搭載了TIRF照明系統(tǒng)和sCMOS相機(jī)（Humamatsu Flash 4.0）的NikonA1R激光掃描共聚焦顯微鏡分別進(jìn)行共聚焦和TIRF實驗，實驗流程如圖1所示（通過分析虛線框中熒光漂白前后的成像數(shù)據(jù)就可以得到FRAP曲線）。首先在全內(nèi)反射成像（TIRF）模式下進(jìn)行全內(nèi)反射成像，再切換到共聚焦模式對ROI進(jìn)行局部光漂白，然后切換到TIRF模式式采集漂白前后全內(nèi)反射圖像。通過分析熒光漂白前后的TIRF圖像就可以得到FRAP曲線。通過編輯NIS-Elements軟件程序?qū)崿F(xiàn)TIRF和共聚焦（Confocal）模式間的快速穩(wěn)定切換，完成TIR/FRAP實驗，獲得質(zhì)膜附近分子動力學(xué)數(shù)據(jù)。

圖1 基于全內(nèi)反射成像的熒光漂白后恢復(fù)技術(shù)的實現(xiàn)路徑

為了滿足TIR/FRAP的實驗需求，對儀器的成像程序進(jìn)行了一系列的調(diào)整，具體實驗流程如下：①打開NIS-Elements成像軟件時，選擇雙驅(qū)動模式，同時打開Nikon confocal和Hamamatsu相機(jī)的驅(qū)動。②確認(rèn)軟件和硬件的關(guān)聯(lián)，建立共聚焦和TIRF成像的OC（Optical Configurations，光學(xué)配置）?？梢砸绘I式地切換光學(xué)配置，節(jié)約實驗時間，減少人工操作錯誤率，簡化并優(yōu)化成像操作。以TIRF488 OC為例，該光學(xué)配置能快速切換儀器狀態(tài)到488 nm激光激發(fā)下采用相機(jī)成像的TIRF成像模式。③根據(jù)樣品熒光信號的強(qiáng)弱和穩(wěn)定性，優(yōu)化OC中的成像參數(shù)，如共聚焦模式中的漂白激光強(qiáng)度和漂白時間，TIRF模式中的激光強(qiáng)度和曝光時間等。④搭建可以實現(xiàn)驅(qū)動自動切換的軟件程序，完成TIR/FRAP實驗。

2 自動切換程序

為了尋找合適的快速穩(wěn)定切換程序，使用NIS-Elements軟件編輯了3種不同類型的軟件程序。它們分別基于ND Sequence Acquisition、Macro和JOBs程序，均可以實現(xiàn)共聚焦模式和TIRF模式間的自動往復(fù)切換。

2.1 基于ND Sequence Acquisition的程序

ND Sequence Acquisition是NIS-Elements軟件的一個控制窗口，它可以定義任意多維圖像序列的獲取，還可以選擇在實驗期間運(yùn)行宏或命令。利用ND Sequence Acquisition將TIRF圖像采集、ROI區(qū)域漂白、Laser interlock解鎖、開啟激光等步驟按照一定順序連接起來，即可完成TIR/FRAP實驗。具體程序如圖2所示，即：①切換OC至TIRF488。②執(zhí)行命令，Stg_RemoveInterlock()，解除激光鎖。③執(zhí)行命令、Stg_SetShutterStateEx(“488 nm”，1)，打開488 nm的激光光閘。①～③步即可成功切換至TIRF OC，并保證出光可以正常進(jìn)行圖像采集，隨后即可進(jìn)行TIRF模式的圖像采集，時間序列、多點序列或多色圖像采集。④ND Acquisition，采集TIRF時間序列圖像，獲取漂白前的TIRF圖像。⑤切換OC至A1，此光學(xué)配置快速將儀器切換到共聚焦成像模式。⑥執(zhí)行命令，Stg_RemoveInterlock()，解除激光鎖。⑦Action選擇Seg.Stimulation，執(zhí)行共聚焦模式下光刺激實驗。④～⑤步即可成功切換至A1 OC，并保證出光可以正常進(jìn)行圖像采集，隨后除執(zhí)行光刺激程序，還可以采集共聚焦圖像，時間序列、多點序列、三維序列等多維圖像，獲取目的蛋白在細(xì)胞中其他位置的定位信息。⑧⑦～⑧步重復(fù)①～③步的程序，成功切換至TIRF OC。⑨NDAcquisition，采集TIRF時間序列圖像，獲取漂白后的TIRF圖像。

圖2 基于ND Sequence Acquisition的TIR/FRAP程序

2.2 基于Macro的程序

Macro（宏）是計算機(jī)語言的一種指令形式，可以組合多個命令，使一系列復(fù)雜任務(wù)可以自動執(zhí)行。在Macro中編輯命令，可以實現(xiàn)TIRF和Confocal的自動切換，完成TIR/FRAP實驗。

詳細(xì)代碼如下：

SelectOptConf("TIRF488");

Stg_RemoveInterlock();

Stg_SetShutterStateEx("488nm",1);

ND_RunExperiment(1);

SelectOptConf("CONFOCAL-FRAP");

Stg_RemoveInterlock();

ND_RunSequentialStimulationExp();

SelectOptConf("TIRF488");

Stg_RemoveInterlock();

Stg_SetShutterStateEx("488nm",1);

ND_AppendTimePhase(5000,300000,"");

ND_RunExperiment(1);

2.3 基于JOBs的程序

在NIS-Elements 4.60以上的軟件版本中提供了JOBs插件。JOBs為用戶提供了輕松創(chuàng)建復(fù)雜的、完全定制實驗?zāi)０宓墓δ埽С种悄芄ぷ髁鞒?，將不同類型的圖像拍攝自動結(jié)合。JOBs用于TIR/FRAP程序，如圖3所示。

圖3 基于JOBs的TIR/FRAP程序

3 系統(tǒng)測試結(jié)果

使用細(xì)胞進(jìn)行測試，上述程序或手動切換均可以完成TIR/FRAP實驗，如圖4所示，獲取任意ROI漂白前后的全內(nèi)反射圖像。從測試結(jié)果中可以看出，手動進(jìn)行TIRF和Confocal模式的切換時，漂白后恢復(fù)TIRF圖像（D4）的采集時間比漂白后Confocal圖像（D3）滯后20 s，漂白區(qū)域內(nèi)的熒光信號強(qiáng)度相對圖D/H/L有明顯的恢復(fù)。因此，手動切換可能會獲取不準(zhǔn)確的光漂白數(shù)據(jù)，在樣品的恢復(fù)速度較快的情況下，還可能會錯失關(guān)鍵數(shù)據(jù)。3種自動切換程序均可以在比較快的時間（15 s）內(nèi)實現(xiàn)Confocal和TIRF模式的切換。測試細(xì)胞由清華大學(xué)俞立課題組提供，是表達(dá)TSPAN4-GFP的NRK細(xì)胞系[13]。

圖4 TIR/FRAP實驗結(jié)果

多次測試后統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，手動由TIRF模式切換至共聚焦模式需要（15.11±5.69）s（n＞6），JOBS程序需要（7.49±1.66）s（n＞6），Macro需要（8.76±0.71）s（n＞6），NDSequenceAcquisition程序需要（7.33±0.78）s（n＞10）；手動由共聚焦模式切換至TIRF模式需要（21.07±3.36）s（n＞6），JOBS程序需要（9.02±0.37）s（n＞6），Macro需要（12.33±0.70）s（n＞6），NDSequence Acquisition程序需要（10.84±0.81）s（n＞10）。

從圖4可以看出，A1～A4基于JOBs程序，B1～B4基于Macro程序，C1～C4基于ND sequence Acquisition程序，D1～D4手動切換TIRF和Confocal模式進(jìn)行TIR/FRAP實驗。第一列是漂白前的TIRF圖像；第二列是漂白前的共聚焦圖像，已完成TIRF至Confocal的切換；第三列是漂白后的共聚焦圖像；第四列是漂白后的TIRF圖像，已完成Confocal至TIRF的切換。標(biāo)尺，10μm；圖中圓形區(qū)域指示漂白區(qū)域。E表示TIRF切換至Confocal所需要的時間，F(xiàn)表示Confocal切換至TIRF所需要的時間。

與手動進(jìn)行模式間的切換相比，自動切換在速度和穩(wěn)定性方面都具有明顯的優(yōu)勢。整個TIR/FRAP實驗中存在2次模式間的切換，第一次將TIRF模式切換至Confocal模式，第二次將Confocal切換至TIRF，后者較復(fù)雜，需要更長的切換時間，基于JOBs的切換程序可以提供更快且穩(wěn)定的切換速度，是TIR/FRAP實驗的較優(yōu)選擇，但這一功能并非NIS-Elements軟件的基礎(chǔ)功能，需要額外購買，且軟件版本需要高于4.60。從模式間切換的速度和穩(wěn)定性上來看，ND Sequence Acquisition程序也是不錯的選擇，而且ND Sequence Acquisition程序可以自動完成3段數(shù)據(jù)的拼接，操作簡單。Macro程序雖然速度和穩(wěn)定性略差于前者，但其對軟件配置和版本沒有要求，是通用型的程序。

4 討論

TIR/FRAP技術(shù)在20世紀(jì)80年代開始于科學(xué)研究中，早期使用光電倍增管而非相機(jī)采集漂白前后的熒光數(shù)據(jù)，僅獲取交界面表面蛋白的動力學(xué)數(shù)據(jù)，沒有空間分辨率數(shù)據(jù)[8，14]。2000年，桑德將TIR/FRAP技術(shù)用于成像領(lǐng)域，既采集空間分辨率的圖像也獲取動力學(xué)數(shù)據(jù)，而且相互印證，動力學(xué)數(shù)據(jù)更加準(zhǔn)確[5]，但漂白區(qū)域為整個視野，不適用精細(xì)定位的蛋白質(zhì)信號。近些年，有一些實驗室會搭建TIRF-近場顯微鏡，可以在TIRF和近場顯微鏡間自由切換，使用分光器或多型聚光鏡實現(xiàn)ROI區(qū)域內(nèi)的TIR/FRAP實驗[15-17]，但這個ROI只能設(shè)定一個且位置大多局限在視野中間[18]。儀器的搭建需要專業(yè)的光學(xué)工程師，不適用于大多數(shù)的實驗室。隨著商品化技術(shù)的發(fā)展，有一些廠家可以提供獨立的FRAP模塊安裝在TIRF顯微鏡上[19]，可以實現(xiàn)任意ROI區(qū)域的光漂白，但這些模塊通常只包含一根激光器，不能滿足使用最佳激發(fā)激光進(jìn)行光漂白實驗的需求，另外一方面也需要額外的經(jīng)濟(jì)和時間成本，以滿足實驗需求。

作為儀器平臺的工作人員，希望及時高效地滿足用戶的實驗需求。本文中TIR/FRAP程序很好地解決了用戶在全內(nèi)反射成像條件下實現(xiàn)特異性光漂白的熒光漂白后恢復(fù)實驗的需求。當(dāng)然本方法也有一定的局限性，例如不適用于快速恢復(fù)的樣品（熒光漂白后恢復(fù)時間小于40 s），但是無需購置新的設(shè)備和等待漫長的訂貨周期，可以輕松實現(xiàn)漂白多個任意位置ROI，并采集漂白前后全內(nèi)反射圖像，直接滿足大多數(shù)的TIR/FRAP實驗需求，操作也比較簡單。

TIR/FRAP實驗的成功進(jìn)行，也為TIRF和共聚焦顯微鏡聯(lián)合使用提供了基礎(chǔ)。激光共聚焦和全內(nèi)反射顯微鏡聯(lián)合使用可以發(fā)揮各自設(shè)備的特點，并兼取二者之長，使其相輔相成，更好地應(yīng)用于科學(xué)研究中。