柳有財，蔡 俊

(湖北工業(yè)大學 發(fā)酵工程教育部重點實驗室，工業(yè)發(fā)酵湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，工業(yè)微生物湖北省重點實驗室，武漢 430068)

0 引 言

葡萄糖酸鈉是葡萄糖的一種深加工產(chǎn)品，可以用于制備葡萄糖酸鹽(銅、鋅、亞鐵鹽)與葡萄糖酸內(nèi)酯等產(chǎn)品[1]，在建筑[2-4]、食品[5]、醫(yī)藥[6]、飼料[7]與洗滌劑[8-9]等方面有著廣泛的應用。生產(chǎn)葡萄糖酸鈉的方法有生物發(fā)酵法[10-11]、均相化學氧化法[12]、電解氧化法[13]以及多相催化氧化法[14]，相較于傳統(tǒng)的化學催化工藝，酶催化反應更加綠色、環(huán)保[15]，為此本團隊擬采用葡萄糖氧化酶與過氧化氫酶的級聯(lián)催化作用將葡萄糖高效轉(zhuǎn)化為葡萄糖酸鈉。葡萄糖氧化酶和過氧化氫酶能夠在溫和的條件下對特定的生化反應進行高效催化。但游離酶在體外反應過程中性能不穩(wěn)定且難于回收，反應后與產(chǎn)物的分離困難，難以進行連續(xù)化的使用，在實際工業(yè)領域的應用往往受到限制，我們常將酶進行固定化處理來解決這些問題[16-17]，良好的載體材料是固定化酶成功的重要因素。具有多孔結構的磁性高分子微球有良好的生物相容性，其合成成本低、來源廣泛、化學穩(wěn)定性好且磁響應性優(yōu)良，是提高酶的應用范圍的理想材料。目前已報道有多種天然高分子材料被用作固定化酶載體材料，如纖維素[18]、透明質(zhì)酸[19]、多巴胺[20]、聚乙二醇[21]等。殼聚糖作為一種功能性生物材料，具有成本低、生態(tài)友好、無毒、可再生等優(yōu)異的性能，且其C2位上的氨基在水溶液中會發(fā)生質(zhì)子化而帶正電荷[22-23]，可通過靜電吸附以及共價鍵的作用將帶負電荷的葡萄糖氧化酶牢固結合。此外，還可以通過修飾其側鏈基團而得到具有新的生物活性的衍生物，這為其作為酶的固定化材料打下基礎[24-25]。

殼聚糖上含有-NH2、-OH、N-乙酰氨基等官能團，其中-NH2上含有一對孤電子對，這使其反應活性較其他基團更高[26]，也是殼聚糖通過共價鍵與酶結合的關鍵基團，但是殼聚糖分子上可參與反應的氨基基團有限，這在一定程度上限制了它的應用。目前，大部分研究通過化學改性來提高天然高分子材料的載酶量以及生物催化穩(wěn)定性[18]。張敏等[27]通過化學接枝改性將聚乙烯亞胺引入瓊脂糖微球上，結果表明改性后的固定化酶儲存效率更高，其對外界環(huán)境的耐受性也得到增強。Han研究團隊[28]制備得到一種含有羧基的磁性納米微球并將其用于固定化木瓜蛋白酶，得到的固定化酶系統(tǒng)擁有更高的催化活性和載酶量。然而，關于用羧基修飾殼聚糖微球的文章卻很少。

本文在實驗室前期實驗基礎上通過APTES改性多孔磁性殼聚糖微球，使其-OH轉(zhuǎn)化為-NH2，然后在GA的作用下部分轉(zhuǎn)化為-COOH。在1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)與N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)的活化作用[29]下共固定化葡萄糖氧化酶與過氧化氫酶，形成了一種新型生物催化劑并進行了酶學性質(zhì)研究。多孔磁性殼聚糖微球載體的改性及其共固定化GOD與CAT的制備流程如圖1所示。隨后，采用掃描電子顯微鏡(SEM)、傅里葉紅外光譜(FTIR)和X射線衍射(XRD)對固定化酶進行了表征，探討了固定化雙酶體系的生物催化性能及穩(wěn)定性，并對游離酶與共固定化酶進行二級結構分析。

圖1 PMCSM-COOH@GOD@CAT的制備流程圖Fig 1 Preparation process diagram of PMCSM-COOH@GOD@CAT

1 實 驗

1.1 材料與試劑

殼聚糖、冰醋酸、液體石蠟、吐溫-80、戊二醛、無水乙醇、氫氧化鈉、濃鹽酸、N,N-二甲基甲酰胺均來自國藥集團化學試劑有限公司；納米四氧化三鐵、過氧化氫酶、EDC、NHS、3-氨丙基三乙氧基硅烷、戊二酸酐均來自上海麥克林生化試劑有限公司；去離子水、葡萄糖氧化酶均由實驗室自制。

1.2 儀器與設備

AR1140電子分析天平：奧豪斯國際貿(mào)易(上海)有限公司；IKA RW20數(shù)顯電動攪拌器：艾卡(廣州)儀器設備有限公司；D27-6090真空干燥箱：上海精宏實驗設備有限公司；FD-2真空冷凍干燥箱：北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司；BTI酶標儀：基因有限公司；RESERVOIR TRAY高效液相色譜儀：SHIMADZU CORRORATION；VEGA 3LMU掃描電子顯微鏡：TESCAN, Czech Repulic；TNZ1-5700傅里葉紅外光譜儀：Nicolet Co, America；D-Advance X-射線衍射儀：Bruker, USA。

1.3 方法

1.3.1 多孔磁性殼聚糖微球的制備

稱取一定量的殼聚糖粉末溶于1%冰醋酸溶液中，制備得1%的殼聚糖溶液，在常溫下高速攪拌4 h，攪拌結束后再在70 ℃下加熱降解4 h，隨后濾除不溶物，將濾液超聲降解20 min后，得到殼聚糖溶液，放入4 ℃冰箱中儲存。取12 mL上述殼聚糖溶液，加入0.2 g Fe3O4，超聲分散10 min。在250 mL燒杯中加入108 mL液體石蠟和3.24 mL吐溫-80，在常溫下充分攪拌30 min后加入上述Fe3O4-殼聚糖溶液(轉(zhuǎn)速為600 r/min)。攪拌1 h后加入0.5 mL 25%的戊二醛溶液，繼續(xù)反應2 h。反應結束后用磁鐵將產(chǎn)物分離，再依次用石油醚、丙酮、無水乙醇和去離子水洗滌數(shù)次，洗去表面活性劑和有機溶劑，真空冷凍干燥后得多孔磁性殼聚糖微球，記PMCSM。

1.3.2 羧基修飾多孔磁性殼聚糖微球的制備

羧基修飾多孔磁性殼聚糖微球是利用3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)與戊二酸酐(GA)制備獲得。具體方案如下，在250 mL燒杯中加入1.74 mL APTES，0.84 g 戊二酸酐以及60 mL N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液，在常溫下攪拌3 h。隨后加入1.2 g多孔磁性殼聚糖微球，9 mL去離子水以及100 mL DMF溶液，在常溫下繼續(xù)攪拌5 h，最后在外部磁鐵的作用下，用去離子水與無水乙醇清洗依次洗滌若干次，真空冷凍干燥后保存于干燥器中。記PMCSM-COOH。

1.3.3 共固定化葡萄糖氧化酶與過氧化氫酶

取100 mg上述制備好的PMCSM-COOH置于PB緩沖液中，加入200 μL EDC，震蕩30 min后加入200 μL NHS，繼續(xù)震蕩30 min后加入一定體積的葡萄糖氧化酶溶液(0.6～1.6 mL)。反應一定時間后，通過外加磁場將固定化酶與反應液分離，去離子水洗滌3次，得到載葡萄糖氧化酶的羧基修飾多孔磁性殼聚糖微球，記PMCSM-COOH@GOD。取上述得到的PMCSM-COOH@GOD于三角瓶中，加入NHS溶液，震蕩30 min后加入一定體積的過氧化氫酶溶液(0.6～1.6 mL)，反應一定時間后，通過外加磁場將固定化酶與反應液分離，去離子水洗滌3次，最終得到載葡萄糖氧化酶與過氧化氫酶的多孔磁性殼聚糖微球，記PMCSM-COOH@GOD@CAT。

1.3.4 葡萄糖氧化酶酶活的測定

用pH值=6.5緩沖液配制濃度為20 g/L的葡萄糖溶液，分別在兩個250 mL三角瓶中加入25 mL上述溶液，其中一組加入待測固定化酶，立即放在搖床上于30 ℃，180 r/min震蕩反應1 h，取出后加入0.1 mol/L標準NaOH 20 mL使氧化反應停止。在上述混合液中加入2滴酚酞指示劑，用0.1 mol/L標準HCl溶液滴定剩余的NaOH，當紅色恰好消失不見的時候停止滴定，記錄滴定開始和結束時酸式滴定管的刻度，計算HCl溶液消耗的體積，平行測定3組，取平均值(V)?？瞻捉M不加固定化酶而且不用在搖床上震蕩，其他操作與樣品組相同，記錄空白組所消耗的鹽酸體積數(shù)(V0)。

酶活單位定義：上述反應條件下，1 min催化β-D-葡萄糖氧化，生成1 μmol葡萄糖酸所需的酶量為一個酶活單位。

葡萄糖氧化酶酶活(EGOD)計算公式：

(1)

式中：V0為空白組消耗HCl標準溶液的體積(mL);V為樣品消耗HCl標準溶液的體積(mL);c為HCl標準溶液的濃度(mol/L);60為反應時間(min);1 000為單位換算系數(shù);n為液稀釋倍數(shù)。

1.3.5 蛋白含量的測定

采用BCA蛋白濃度測定法，將0.5 mg/mL BSA標準蛋白按0、0.025、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL 20 μL加到96孔板中，隨后各孔加入200 μL BCA工作液，37 ℃放置30 min，在OD562處測其吸光度，以BSA標準蛋白濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制曲線。將數(shù)據(jù)經(jīng)過回歸處理，得出回歸方程為

y=0.5433x+0.0402R2=0.9991

(2)

1.3.6 掃描電子顯微鏡

將干燥好的改性多孔殼聚糖微球粘附在銅臺表面，噴金5 min。將樣品臺放置在載物臺上，在掃描電子顯微鏡下觀察各樣品的表面結構，加速電壓為20 kV。

1.3.7 傅里葉紅外光譜儀

將Fe3O4、CS粉末、PCSM、PMCSM、PMCSM-COOH、游離GOD、游離CAT、PMCSM-COOH@GOD以及PMCSM-COOH@GOD@CAT研磨成粉末，烘干后進行檢測。取適量KBr進行壓片，測得背景值；之后取少量樣品與KBr共混，研磨均勻并用壓力機制成具有一定透光性的壓片，最后在傅立葉紅外光譜儀上測其紅外光譜圖，掃描范圍設置為4 000～400 cm-1。

1.3.8 X射線衍射

將干燥好的Fe3O4、CS粉末、PCSM、PMCSM以及PMCSM-COOH分別鋪平樣品槽，隨后分別置于在X射線衍射儀上進行測試，設置條件為40 kV，40 mA，試樣掃描范圍5～60°，掃描速率4°/min。

1.3.9 共固定化酶酸堿、溫度穩(wěn)定性的研究

分別將游離GOD與PMCSM-COOH@GOD@CAT這兩組酶放入不同的pH(5.0～10.0)以及不同溫度(10～60 ℃)的反應液中孵育，3 h后測其葡萄糖氧化酶酶活，平行做3組實驗。

相對酶活(RE1%)計算公式：

(3)

式中，E為葡萄糖氧化酶在穩(wěn)定性試驗后酶活；E0為試驗中葡萄糖氧化酶最高酶活。

1.3.10 共固定化酶的重復使用性及其儲藏穩(wěn)定性

PMCSM-COOH@GOD@CAT催化葡萄糖氧化生產(chǎn)葡萄糖酸，反應結束后在外部磁鐵的作用下，將反應體系中的固定化酶進行回收，并用去離子水清洗數(shù)次，測其酶活，重復上述步驟，共測10次酶活，平行做3組實驗。

相對酶活(RE2%)計算公式：

(4)

式中，En為每次收集后所測葡萄糖氧化酶酶活；E1為葡萄糖氧化酶初始酶活。

分別取16組GOD與PMCSM-COOH@GOD@CAT，放入4℃冰箱中儲存30天每隔兩天測一次酶活，平行做3組實驗。

相對酶活(RE3%)計算公式：

(5)

式中，En為第n天葡萄糖氧化酶酶活酶活；E0為第0天葡萄糖氧化酶酶活。

2 結果與分析

2.1 多孔殼聚糖微球掃描電鏡圖

圖2為不同放大倍數(shù)的多孔殼聚糖微球的SEM圖像。由圖可知，微球粒徑大小在10～30 μm之間，分布較為均勻，均呈球形或橢球形。圖2(b、c)可清楚觀察到微球內(nèi)部的多孔結構，較多空腔使微球外部呈凸起狀，微球內(nèi)可見錯落的孔隙層和多孔壁。多孔壁的一定厚度((354.81±32.57)nm)保證了固定化酶載體材料的機械強度，為酶促反應的不斷進行提供有力的機械支撐。大小毗鄰的孔洞提高了微球的比表面積，可為更多酶的附著提供位點，該多孔殼聚糖微球具備較好的固定化酶載體特性。

圖2 多孔殼聚糖微球掃描電鏡圖 Fig 2 SEM of porous chitosan microspheres

2.2 PMCSM-COOH的傅里葉紅外光譜分析

圖3是Fe3O4、CS粉末、PCSM、PMCSM與PMCSM-COOH的紅外光譜圖。如圖所示，F(xiàn)e3O4在582 cm-1處存在很強的特征峰為強吸收峰。3 432 cm-1處是殼聚糖微球的-OH振動吸收峰，2 924與2 857 cm-1處是脂肪族-C-H振動峰。1 642 cm-1處出現(xiàn)了明顯的Schiff堿的特征吸收峰，是由C=N基團的伸展造成的，說明戊二醛與-NH2發(fā)生了反應[30]。1375 cm-1處是CH3的C-H變形振動峰，這是因為殼聚糖沒有完全去乙?；隆? 549 cm-1處是殼聚糖微球的—N—H振動吸收峰，PMCSM-COOH在1 549 cm-1處的吸收峰強度增大且在1 415 cm-1處出現(xiàn)了新的特征峰，此處為—COO—的對稱伸縮振動吸收帶[31-32]，這說明羧基成功修飾在了殼聚糖微球上。由圖可知，羧基基團的出現(xiàn)并沒有使體系中原本的氨基基團減少，反而氨基的吸收峰強度增大，這可能是因為殼聚糖微球上的—OH發(fā)生反應轉(zhuǎn)化為—NH2后只有部分被修飾為—COOH，這些結果表明本文所制得的羧基改性殼聚糖微球較未改性前擁有更多的活性官能團，可參與GOD與CAT的固定化。

圖3 Fe3O4、CS、PCSM、PMCSM與PMCSM-COOH的紅外光譜圖Fig 3 FT-IR spectra of Fe3O4, CS, PCSM, PMCSM and PMCSM-COOH

2.3 PMCSM-COOH的X-射線衍射分析

圖4是Fe3O4、CS粉末、PCSM、PMCSM與PMCSM-COOH的XRD圖。如圖所示，CS粉末在2θ=19.2°和28.4°處顯示出2個衍射峰，分別對應于殼聚糖(110)和(130)晶面。PCSM中(130)晶面衍射峰消失，表面殼聚糖在再生過程中分子鏈發(fā)生重構。同時，MCSM在2θ=30.9°、36.2°、43.8°和57.7°處顯示出4個不同的峰，分別為Fe3O4在(220)、(400)、(422)和(511)處的晶面衍射峰。這些結果表明，多孔磁性殼聚糖微球的成功制備。PMCSM-COOH主要衍射峰的位置與PMCSM主要衍射峰的位置是一致的，這說明改性后的磁性殼聚糖微球晶體結構沒有發(fā)生顯著改變[31]。通過FT-IR與XRD的結構分析表明，本文成功制備得到羧基修飾的磁性殼聚糖微球。

圖4 Fe3O4、CS、PCSM、PMCSM與PMCSM-COOH的X射線衍射圖Fig 4 XRD patterns of Fe3O4, CS, PCSM, PMCSM and PMCSM-COOH

2.4 GOD與CAT的添加量對GOD酶活的影響

在固定化酶的過程中，酶與載體的相對用量對其相對酶活有一定的影響。在材料的用量一定時，酶的裝載量過多會導致酶的聚集，從而產(chǎn)生較大的空間位阻，這會在很大程度上降低其相對酶活，影響催化效果；相反，當酶的添加量過少時會導致有些材料沒有載酶，造成材料的浪費。本文采用GOD與CAT這一經(jīng)典的級聯(lián)催化反應，旨在進一步提高GOD的催化活性，因此本文通過檢測GOD的相對酶活來評估二者的相對用量對固定化酶的酶活影響，如下圖5、6所示。在PMCSM-COOH用量一定時，為研究GOD的最適添加量，探討了PMCSM-COOH@GOD的相對酶活與載蛋白量隨著GOD用量增加而變化的情況。其中，GOD酶液濃度為8.72 mg/mL，相對酶活是指PMCSM-COOH@GOD酶活與其固定在PMCSM上同等數(shù)量游離GOD所對應的酶活之比。如圖5所示，隨著GOD用量的增加，PMCSM-COOH的載GOD量隨之增加，在GOD用量達到1.2 mL(10.46 mg)之后，載GOD量稍有下降，這可能是因為過多的酶分子之間發(fā)生交聯(lián)聚集，并未固定在載體上。此時PMCSM-COOH@GOD相對酶活變化不大，甚至有些許的下降，這可能是因為PMCSM-COOH載蛋白能力達到飽和狀態(tài)，GOD用量過多會導致酶的聚集，產(chǎn)生較大的空間位阻，影響底物傳遞效率。因此，在接下來的實驗中選擇PMCSM/GOD質(zhì)量比為100/9.34為最適比例來固定GOD，此時，PMCSM@GOD載GOD量為(93.43±1.12 )mg/g，是未改性之前的1.55倍，相對酶活為(90.09±1.29)%，與未改性之前相比差異不大，表明在大幅度提高載酶量的同時，并沒有因團聚現(xiàn)象或傳質(zhì)阻力等問題而降低固定化酶的相對酶活，即羧基修飾后確實提高了殼聚糖微球的有效載酶容量。

圖5 GOD添加量對GOD的相對酶活與載GOD量的影響Fig 5 Influence of the amount of GOD on the relative enzyme activity and protein loading of GOD

圖6是在上述GOD與PMCSM-COOH最適比例條件下，PMCSM-COOH@GOD@CAT相對酶活隨著CAT用量增加而變化的曲線。其中，CAT酶液濃度為11.25 mg/mL，相對酶活是指PMCSM@GOD@CAT中GOD酶活與其固定在PMCSM上同等數(shù)量游離GOD所對應的酶活之比。如圖6所示，隨著CAT的加入，PMCSM@GOD@CAT相對酶活有明顯的提升，CAT的共固定化及時清除了有害副產(chǎn)物H2O2，防止由于H2O2的氧化作用而引起的GOD失活，此外CAT分解H2O2產(chǎn)生的O2可以被GOD再次利用，這在一定程度上提高了PMCSM-COOH@GOD@CAT的活性。CAT用量超過1.0 mL(11.25 mg)之后，其相對酶活稍有下降，這可能是因為過多的CAT占據(jù)體系中更多的空間，酶的活性位點被遮蔽。綜上，本實驗選擇PMCSM-COOH/GOD/CAT質(zhì)量比為100/9.34/10.78為最佳比例來制備固定化酶，此時，PMCSM-COOH@GOD@CAT相對酶活為(131.91±0.58)%，與PMCSM@GOD相比提高了1.46倍。

2.5 PMCSM-COOH@GOD@CAT的溫度穩(wěn)定性

為了研究溫度對固定化酶穩(wěn)定性的影響，測試了它們在不同溫度下的催化活性，圖7是游離GOD與PMCSM-COOH@GOD@CAT在10～60 ℃溫度下孵育3 h后的相對酶活，相對酶活是指酶在不同溫度下孵育3 h后的酶活與最高酶活之比。如圖所示，固定化酶在40 ℃下孵育3 h后仍然具有較高的相對酶活，為(90.52±1.07)%，而游離酶相對酶活只有(74.70±0.32)%。隨著溫度的繼續(xù)升高，游離酶與固定化酶的相對酶活之間的差異越來越顯著。當溫度為60 ℃時，游離酶酶活只保留了(15.13±2.39)%，大部分都已失活，而固定化酶酶活保留了(65.28±1.58)%。這可能是經(jīng)過固定化之后，酶的穩(wěn)定性有所增加，較高的溫度為固定住的酶和底物分子提供一定的能量參與反應，因而與游離酶相比更加耐高溫，這為今后在食品工業(yè)方面的發(fā)展打下了一定的基礎。

圖6 CAT添加量對GOD的相對酶活與載CAT量的影響Fig 6 Influence of the amount of CAT on the relative enzyme activity of GOD and protein loading of CAT

圖7 游離GOD與PMCSM-COOH@GOD@CAT的溫度穩(wěn)定性Fig 7 Temperature stability of free GOD and PMCSM-COOH@GOD@CAT

2.6 PMCSM-COOH@GOD@CAT的酸堿穩(wěn)定性

為了研究pH對固定化酶穩(wěn)定性的影響，測試了它們在不同pH下的催化活性，圖8是游離GOD與PMCSM-COOH@GOD@CAT在pH值=5～10的條件下孵育3 h后的相對酶活，相對酶活是指酶在不同pH下孵育3 h后的酶活與最高酶活之比。如圖所示，在弱酸的條件下，各組中GOD保留的酶活都相對較高，這是因為GOD的最適pH是偏酸性的，因此在弱酸的條件下，各組GOD都保持著較好的酶活，在pH值=6附近，游離GOD與固定化GOD都有著最高的相對酶活。在堿性的條件下，游離GOD失活較為嚴重，在pH值=10時，游離GOD相對酶活僅為(2.96±1.10)%，PMCSM-COOH@GOD@CAT的相對酶活仍有(70.72±1.73)%，這可能是游離GOD經(jīng)過固定化后，其酶分子活性構象更加穩(wěn)定，并且殼聚糖微球表面存在著不同電荷，這些電荷的存在使得固定化酶在堿性條件下有一定的緩沖作用，pH的變化對其影響較小。這為PMCSM-COOH@GOD@CAT的應用奠定了良好的基礎。

圖8 游離GOD與PMCSM-COOH@GOD@CAT的酸堿穩(wěn)定性Fig 8 pH stability of free GOD and PMCSM-COOH@GOD@CAT

2.7 PMCSM-COOH@GOD@CAT的重復使用性

圖9是PMCSM-COOH@GOD@CAT重復催化葡萄糖氧化10次每一次對應的相對酶活，相對酶活是指每次催化氧化后的酶活與最初酶活之比。如圖所示，重復使用10次后PMCSM-COOH@GOD@CAT保留著較高的相對酶活，為(79.16±1.98)%。

圖9 PMCSM-COOH@GOD@CAT的重復使用性Fig 9 Reusability of PMCSM-COOH@GOD@CAT

2.8 PMCSM-COOH@GOD@CAT的儲藏穩(wěn)定性

圖10是游離GOD與PMCSM-COOH@GOD@CAT在4℃冰箱中儲存，每隔兩天測一次酶活，得到的相對酶活隨時間變化的曲線。相對酶活是指某天的酶活與第0天酶活之比。如圖所示，與游離GOD相比，固定化酶有著更好的保留原始酶活的能力。經(jīng)過30的儲存，PMCSM@GOD@CAT維持了最初活性的(80.41±2.49)%，而游離GOD只有(62.21±1.00)%。這可能是因為GOD經(jīng)過交聯(lián)后，形成了不可逆的穩(wěn)健的化學結構。

圖10 游離GOD與PMCSM-COOH@GOD@CAT的儲藏穩(wěn)定性Fig 10 Storage stability of free GOD and PMCSM-COOH@GOD@CAT

2.9 PMCSM-COOH@GOD@CAT的Lineweaver-Burk動力學研究

為了研究酶與底物親和力的關系，本實驗在不同葡萄糖溶液濃度下進行了Lineweaver-Burk動力學研究，以1/V為橫坐標，1/[s]為縱坐標，可繪制出一條直線，將數(shù)據(jù)經(jīng)過線性回歸處理，可得出回歸方程，如圖11所示。根據(jù)雙倒數(shù)作圖可得游離GOD與PMCSM-COOH@GOD@CAT的Km和Vmax，如表1所示。PMCSM-COOH@GOD@CAT的Km值(572.06 mmol/L)遠低于游離GOD的Km值(765 mmol/L)，說明PMCSM-COOH@GOD@CAT與底物親和力較大。PMCSM-COOH@GOD@CAT的Vmax(45.11 mmol/(L·min))高于游離GOD(37.61 mmol/(L·min))，Vmax略高的主要原因是PMCSM-COOH@GOD@CAT活性升高。PMCSM-COOH@GOD@CAT的Vmax/km值高于游離GOD的Vmax/km值，說明PMCSM-COOH@GOD@CAT容易與底物發(fā)生相互作用，表現(xiàn)出較高的催化效率[33-34]。

2.10 PMCSM-COOH@GOD@CAT二級結構分析

傅里葉紅外光譜數(shù)據(jù)分析是測定酶二級結構的有效方法之一，酰胺Ⅰ帶(1 600 ～1 700 cm-1)對酶任何二級結構變化都非常敏感，該頻帶中每個子分量帶可代表特定的二級結構，如α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角以及無規(guī)則卷曲結構[35]。有研究表明，可通過觀察紅外中酰胺Ⅰ帶和酰胺Ⅱ帶的光譜來分析酶的固定情況和活性，

表1 游離GOD與PMCSM-COOH@GOD@CAT的動力學參數(shù)Table 1 Kinetics parameters of free GOD and PMCSM-COOH@GOD@CAT

其中酰胺Ⅰ帶的二級結構分析可用來確定固定化酶仍然具有活性[36]。本實驗對游離GOD、PMCSM-COOH@GOD、游離CAT以及PMCSM-COOH@GOD@CAT的紅外光譜進行處理，采用基線校正，Gaussian去卷積，二階導數(shù)擬合，然后在origin軟件中進行多峰擬合，根據(jù)峰面積計算各二級結構的相對含量。圖12是游離GOD(a，c)與PMCSM-COOH@GOD(b，d)的FT-IR吸收光譜以及其在酰胺Ⅰ帶擬合結果，1 620.02 cm-1附近歸屬于β-折疊，1 636 cm-1附近歸屬于無規(guī)則卷曲，1 649.99 cm-1附近歸屬于α-螺旋，1 664.40與1 681.30 cm-1附近歸屬于β-轉(zhuǎn)角。所有樣品峰值位置都在1 645 cm-1左右，據(jù)文獻報道這表明酶活性得以保留，因為酶失活的最相關特征之一是酰胺Ⅰ峰值的變化[37]，這在我們的樣品中沒有發(fā)生。圖13是游離GOD與PMCSM-COOH@GOD的二級結構相對含量。由圖可知，α-螺旋和β-轉(zhuǎn)角含量在二者中占主導，PMCSM-COOH@GOD的α-螺旋相對含量高于游離GOD，α-螺旋結構的構象得益于較強的氫鍵以及電荷相互作用，其在酶分子的剛性結構和穩(wěn)定性方面起著重要作用，這一結果表明PMCSM-COOH@GOD具有更好的結構剛性，其穩(wěn)定性優(yōu)于游離酶[38-40]。

圖12 游離GOD(a，c)與PMCSM-COOH@GOD(b，d)的FT-IR吸收光譜以及其在酰胺Ⅰ帶擬合結果Fig 12 FT-IR absorption spectra and amide I fitting results of free GOD (a, c) and PMCSM-COOH@GOD (b, d)

圖13 游離GOD與PMCSM-COOH@GOD的二級結構含量Fig 13 Secondary structure content of free GOD and PMCSM-COOH@GOD

為了探討PMCSM-COOH@GOD@CAT的結構，圖14研究了游離CAT(a，c)與PMCSM-COOH@GOD@CAT(b，d)的FT-IR吸收光譜及其在酰胺Ⅰ帶擬合結果，二者峰值位置都在1 645cm-1左右，均保留有較好的酶活。圖15是游離CAT與PMCSM-COOH@GOD@CAT的二級結構相對含量，由圖可知，二者之間的二級結構相對含量稍有波動，未發(fā)生太大變化。其中，PMCSM-COOH@GOD@CAT的α-螺旋相對含量要略高于游離CAT，即CAT的固定化使其結構剛性在一定程度上得到增強，提高了酶分子的硬度與穩(wěn)定性，可更好地抵抗極端反應微環(huán)境，為雙酶級聯(lián)反應的進行提供有力保障。

圖14 游離CAT(a，c)與PMCSM-COOH@GOD@CAT(b，d)的FT-IR吸收光譜以及其在酰胺Ⅰ帶擬合結果Fig 14 FT-IR absorption spectra and amide I fitting results of free CAT (a, c) and PMCSM-COOH@GOD@CAT (b, d)

圖15 游離CAT與PMCSM-COOH@GOD@CAT的二級結構含量Fig 15 Secondary structure content of free CAT and PMCSM-COOH@GOD@CAT

3 結 論

成功制備了一種新型的羧基修飾的多孔磁性殼聚糖微球并對其進行相關表征。當PMCSM-COOH/GOD/CAT質(zhì)量比為100/9.34/10.78時，GOD相對酶活達到最高，為(131.91±0.58)%，與PMCSM@GOD相比提高了1.46倍，且其載酶量相較于未改性前得到提高。PMCSM-COOH@GOD@CAT表現(xiàn)出良好的溫度穩(wěn)定性與pH穩(wěn)定性，當溫度為60℃時，游離GOD酶活只保留了(15.13±2.39)%，大部分都已失活，而PMCSM-COOH@GOD@CAT酶活保留了(65.28±1.58)%。在pH值=10時，游離GOD相對酶活僅為(2.96±1.10)%，PMCSM-COOH@GOD@CAT的相對酶活仍有(70.72±1.73)%。重復使用10次后PMCSM-COOH@GOD@CAT保留著較高的相對酶活，為(79.16±1.98)%；經(jīng)過30的儲存，PMCSM@GOD@CAT維持了最初活性的(80.41±2.49)%，而游離GOD只有(62.21±1.00)%。通過對游離GOD與PMCSM-COOH@GOD的FT-IR中酰胺Ⅰ帶進行分析，PMCSM-COOH@GOD的α-螺旋含量高于游離GOD，即PMCSM-COOH@GOD有著更好的結構剛性以及穩(wěn)定性，可體現(xiàn)在固定化酶比游離酶具有更好的溫度穩(wěn)定性與pH穩(wěn)定性。同理，通過對游離CAT與PMCSM-COOH@GOD@CAT的二級結構分析，PMCSM-COOH@GOD@CAT的α-螺旋含量略高于游離CAT，固定化提高了酶分子的結構剛性及穩(wěn)定性。綜上所述，本文所制備得到的羧基修飾雙酶共固定化體系在提高載酶量的同時仍保留有較好的催化活性和穩(wěn)定性，為固定化酶在將來的化工以及食品工業(yè)應用打下一定的基礎。