肖軼卉,樊安方,2,王道遠(yuǎn),張浩睿,任凱群*

(1.湖南師范大學(xué)醫(yī)學(xué)院模式動(dòng)物與干細(xì)胞湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,中國(guó)湖南 長(zhǎng)沙 410013;2.攀枝花學(xué)院,中國(guó)四川 攀枝花 617000)

肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是原發(fā)性肝癌中一種高死亡率的惡性腫瘤,是全球范圍內(nèi)癌癥相關(guān)死亡的最常見(jiàn)原因之一[1]。隨著醫(yī)學(xué)的進(jìn)步,雖然HCC的治療有所進(jìn)展,但它仍是目前死亡率最高的3種癌癥之一[2]。早期HCC的治療主要是手術(shù)切除、移植等[3～4],化療是晚期HCC治療的主要手段,一些肝動(dòng)脈灌注化療結(jié)合新型藥物的聯(lián)合方案也正在開(kāi)發(fā)中[5]。另外,分子靶向藥物聯(lián)合免疫抑制劑正在成為治療HCC的一種新興手段[6～7]。然而,手術(shù)治療的高復(fù)發(fā)率和移植治療的短缺限制了肝癌的治療水平[8]。理想的分子標(biāo)記物和有效的分子靶向肝癌藥物在現(xiàn)階段仍然是基礎(chǔ)研究的難點(diǎn),為新藥的開(kāi)發(fā)尋找可靠的關(guān)鍵分子靶標(biāo),提高肝癌的診斷和輔助治療水平,仍是肝癌臨床治療的重要研究?jī)?nèi)容。

KCTD10是鉀離子四聚體通道蛋白,屬于DNA聚合酶δ相互作用蛋白1(polymerase delta-interacting protein 1,PDIP1)家族;它最初被報(bào)道在神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育過(guò)程中具有關(guān)鍵作用[9]。Wang等[10]發(fā)現(xiàn),KCTD10與增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)相互作用,KCTD10下調(diào)可以抑制A549細(xì)胞的增殖能力。Kubota等[11]發(fā)現(xiàn),KCTD10的表達(dá)受到抑制后,可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和浸潤(rùn),提示KCTD10具有腫瘤抑制作用。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),KCTD10的敲低能調(diào)控肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)[12]。但針對(duì)KCTD10在肝癌臨床組織中的表達(dá)仍然缺乏分析。

本研究旨在分析KCTD10在人肝癌組織及肝癌細(xì)胞中的表達(dá),并建立小鼠模型探討肝損傷對(duì)KCTD10的影響,為肝癌的臨床治療提供分子理論基礎(chǔ),并為早期肝癌的診斷和分子靶向藥物的開(kāi)發(fā)提供重要依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

C57BL/6小鼠,雄性,33～37天齡,體重(16±1.0)g,購(gòu)買自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司[生產(chǎn)許可證編號(hào):SCXK(湘)2016-0002]。動(dòng)物飼養(yǎng)于湖南師范大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心屏障環(huán)境[許可證編號(hào):SYXK(湘)2020-0012],設(shè)施內(nèi)溫度恒定在23℃左右,濕度控制在40%～70%,動(dòng)物照度實(shí)現(xiàn)12 h/12 h明暗交替。本動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)湖南師范大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(倫審科2015第146號(hào))。

其他實(shí)驗(yàn)材料和試劑包括:肝癌組織芯片(Novus,加拿大,含50例肝癌和10例鄰近非腫瘤標(biāo)本),患者的基本臨床病理資料見(jiàn)表1;人HCC細(xì)胞系MHCC97H和Hep3B(上海復(fù)祥生物科技有限公司),LX2、Huh7和HepG2(中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù));免疫組化試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司);3,5-二乙酯基-1,4-二氫三甲基吡啶(3,5-diethoxycarbonyl-1,4-dihydrocollidine,DDC)(梯希愛(ài)化成工業(yè)發(fā)展有限公司);抗KCTD10抗體(課題組制備);anti-actin(Sigma-Aldrich公司,美國(guó));anti-α-tubulin(Abbkine公司,美國(guó));anti-rabbit IgG和HRP-linked antibody(Cell Signaling Technology公司,美國(guó));磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline,PBS)、DMEM 培養(yǎng)基和青/鏈霉素(Hyclone 公司,美國(guó));胎牛血清(Biowest公司,美國(guó));PMSF和強(qiáng)RIPA裂解液(北京索萊寶科技有限公司);蛋白質(zhì)抽提試劑盒和BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司);聚偏二氟乙烯(polyvinylidene difluoride,PVDF)膜(Millipore公司,美國(guó));TRIzol試劑(Invitrogen公司,美國(guó));5×蛋白質(zhì)上樣緩沖液、超敏化學(xué)發(fā)光試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和AceQqPCR SYBR Green Master Mix(南京諾唯贊生物科技有限公司);天狼猩紅染液和中性樹膠(武漢賽維爾生物科技有限公司)。

表1 50例肝細(xì)胞癌患者的臨床病理特點(diǎn)Table 1 Clinicopathological characteristics of 50 cases with HCC

1.2 KCTD10的差異表達(dá)分析

利用UALCAN數(shù)據(jù)庫(kù)(http://ualcan.path.uab.edu/)分析HCC中KCTD10的表達(dá)水平。篩選條件如下:gene symbol=KCTD10;TCGA dataset=HCC。選定參數(shù):based on=sample types,滿足條件的正常組織樣本50例,HCC組織樣本371例。選定參數(shù):based on=tumor grade,進(jìn)一步分析KCTD10與腫瘤分期的關(guān)系。

1.3 免疫組織化學(xué)(immunohistochemistry,IHC)

用4%多聚甲醛固定小鼠肝臟后,對(duì)其進(jìn)行包埋,制成石蠟切片。肝癌組織芯片和小鼠肝組織切片經(jīng)脫蠟、水化、抗原熱修復(fù),消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶和堿性磷酸酶活性,用KCTD10的多克隆抗體作為一抗在4℃以1︰200稀釋后孵育過(guò)夜。用PV-9002兩步法和聚HRP抗兔IgG抗體孵育切片60 min。另外,小鼠肝組織切片經(jīng)脫蠟、水化、抗原熱修復(fù)后,用天狼猩紅染液進(jìn)行染色。細(xì)胞核用蘇木素復(fù)染后,切片脫水,二甲苯透明,中性樹膠封片。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)

所有細(xì)胞株均使用含10%胎牛血清和1%100 U/mL青/鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng),培養(yǎng)箱條件:濕度 95%、37 ℃、5% CO2。

1.5 蛋白質(zhì)的抽提

細(xì)胞蛋白質(zhì)的抽提:每種細(xì)胞系的使用量是2×106個(gè),用PBS洗1遍,10 000 r/min離心5 min,盡可能吸盡上清,留下沉淀備用。加入200 μL添加了PMSF的細(xì)胞質(zhì)蛋白質(zhì)抽提試劑A,最高速劇烈振蕩5 s,使細(xì)胞沉淀完全懸浮分散,冰浴10～15 min;加入10 μL細(xì)胞質(zhì)蛋白質(zhì)抽提試劑B,最高速劇烈振蕩5 s,冰浴1 min;最高速劇烈振蕩5 s,4℃15 000g離心5 min;吸取上清至預(yù)冷的1.5 mL EP管中,即為抽提得到的細(xì)胞質(zhì)蛋白質(zhì);吸盡殘余上清,加入50 μL添加了PMSF的細(xì)胞核蛋白質(zhì)抽提試劑;最高速劇烈振蕩20 s,使細(xì)胞沉淀完全懸浮分散;放回冰上,每隔2 min再最高速劇烈振蕩20 s,共30 min;4℃15 000g離心10 min;吸取上清至預(yù)冷的1.5 mL EP管中,即為抽提得到的細(xì)胞核蛋白質(zhì)。

小鼠肝組織蛋白質(zhì)的抽提:以20︰1的比例混合細(xì)胞質(zhì)蛋白質(zhì)抽提試劑A和B,同時(shí)加入終濃度為1 mmol/L的PMSF,配制成組織勻漿液;每60 mg組織加入200 μL組織勻漿液,用電動(dòng)研磨棒將組織充分勻漿;冰浴15 min;4℃1 500g離心5 min,吸取上清至預(yù)冷的1.5 mL EP管中,即為抽提得到的部分細(xì)胞質(zhì)蛋白質(zhì)。對(duì)于沉淀的操作,采用同細(xì)胞的抽提方法,將兩次抽提到的細(xì)胞質(zhì)蛋白質(zhì)合并成一管。

所有的操作均在冰上進(jìn)行,抽提的所有蛋白質(zhì)使用BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒測(cè)定濃度。

1.6 免疫印跡分析

用25 mm的培養(yǎng)瓶培養(yǎng)細(xì)胞,待細(xì)胞生長(zhǎng)密度為90%～100%時(shí),收集細(xì)胞,加入含1%PMSF的RIPA細(xì)胞裂解液,冰上裂解30 min;使用BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)濃度;根據(jù)濃度取100 μg蛋白質(zhì),加入5×蛋白質(zhì)上樣緩沖液,100℃金屬浴變性10 min;經(jīng)10%SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上,5%脫脂牛奶室溫封閉2 h;4℃一抗(課題組制備的抗KCTD10抗體、anti-actin和anti-α-tubulin,1︰1 000)孵育過(guò)夜后,用二抗(antirabbit IgG 和 HRP-linked antibody,1︰5 000)在室溫下孵育1 h;TBS-T漂洗3次,每次10 min。

1.7 RNA提取和實(shí)時(shí)熒光定量PCR

使用TRIzol試劑從所有的細(xì)胞株中提取總RNA,并根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。使用SYBR Green Supermix和Bio-Rad熒光定量PCR儀進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。所有數(shù)據(jù)相對(duì)36B4(內(nèi)參)基因的表達(dá)進(jìn)行了標(biāo)準(zhǔn)化。引物由擎科生物技術(shù)有限公司合成,序列見(jiàn)表2。

表2 熒光定量PCR引物序列Table 2 Primers used for real-time quantitative PCR analysis

1.8 DDC誘導(dǎo)急性肝損傷模型

檢疫室適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后進(jìn)行實(shí)驗(yàn),將10只小鼠隨機(jī)分為兩組,每組5只。按照質(zhì)量比1︰1 000的比例將DDC與正常飼料混合備用,其中任選一組喂食0.1%DDC飼料作為實(shí)驗(yàn)組,另外一組喂食正常飼料作為對(duì)照組,連續(xù)喂食4周。麻醉后處死小鼠,取部分肝臟組織保存?zhèn)溆谩?/p>

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用GraphPad Prism 9.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,所有數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。使用t檢驗(yàn)(和非參數(shù)檢驗(yàn))分析比較兩組之間的差異,P<0.05被認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 基于UALCAN數(shù)據(jù)庫(kù)分析HCC中KCTD10的表達(dá)

應(yīng)用UALCAN數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)來(lái)自TCGA(The Cancer Genome Atlas)的50例正常組織樣本和371例HCC組織樣本中KCTD10的表達(dá)水平進(jìn)行了分析,結(jié)果顯示:相對(duì)于癌旁組織,KCTD10在HCC組織中的表達(dá)明顯增強(qiáng)(P<0.05)(圖1A)。進(jìn)一步分析KCTD10與腫瘤分期的關(guān)系,結(jié)果顯示:與癌旁組織相比,1 級(jí)(T1)、2 級(jí)(T2)、3 級(jí)(T3)和 4 級(jí)(T4)HCC樣本中KCTD10的表達(dá)隨著級(jí)別進(jìn)程呈逐漸增強(qiáng)趨勢(shì),對(duì)比分析結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖1B)。

圖1 UALCAN數(shù)據(jù)庫(kù)分析KCTD10在正常肝組織及肝癌組織中的表達(dá)(A)KCTD10在癌旁和腫瘤組織中的相對(duì)表達(dá);(B)KCTD10在癌旁組織和不同等級(jí)腫瘤組織中的相對(duì)表達(dá)。**:P<0.01,***:P<0.001 vs.癌旁組織。Fig.1 The expression of KCTD10 in normal human liver tissues and liver cancer tissues analyzed with UALCAN database(A)Relative expression of KCTD10 in normal and tumor tissues;(B)Relative expression of KCTD10 in para-carcinoma tissues and different grades of tumor tissues.**:P<0.01 and***:P<0.001 vs.normal tissue.

2.2 KCTD10的表達(dá)與HCC的進(jìn)展及惡性程度高度相關(guān)

為了進(jìn)一步明確KCTD10在HCC中的表達(dá),我們采用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)了50例臨床肝癌組織和10例鄰近非腫瘤組織中KCTD10的含量。每個(gè)樣本根據(jù)著色深淺進(jìn)行評(píng)分,評(píng)分結(jié)果分為5級(jí)(Grade 1～Grade 5)(圖2A)。大多數(shù)正常肝臟組織中KCTD10低表達(dá),著色接近1級(jí)(Grade 1),而HCC切片中KCTD10高表達(dá)的比例超過(guò)90%。KCTD10免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示,隨著HCC分級(jí)(T1～T4)的增加,著色得分(Grade 1～Grade 5)也逐漸升高(圖2B,P<0.05)。為了進(jìn)一步證實(shí)KCTD10在肝癌組織中的表達(dá),采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR及免疫印跡技術(shù)檢測(cè)KCTD10在肝癌細(xì)胞系 HepG2、Huh7、Hep3B、MHCC97H 和人肝星形細(xì)胞株LX2中的mRNA水平(圖2C)和蛋白質(zhì)水平(圖2D),發(fā)現(xiàn)KCTD10在轉(zhuǎn)移性肝癌細(xì)胞系Hep3B、Huh7和MHCC97中的表達(dá)顯著高于低分化細(xì)胞系HepG2和人肝星形細(xì)胞株LX2(P<0.05)。

圖2 KCTD10在肝癌組織和細(xì)胞系中的表達(dá)分析(A)免疫組織化學(xué)檢測(cè)KCTD10在50例肝癌和10例鄰近正常組織中的表達(dá)。對(duì)每一樣本的著色程度進(jìn)行評(píng)分,根據(jù)顏色深淺將結(jié)果分為等級(jí)1～5(Grade 1～Grade 5),KCTD10在轉(zhuǎn)移性肝細(xì)胞癌中檢測(cè)到強(qiáng)表達(dá)(棕色染色),蘇木素將細(xì)胞核染成藍(lán)色(標(biāo)尺:50 μm);(B)KCTD10在不同分級(jí)肝癌(T1～T4)和正常組織中表達(dá)的免疫組織化學(xué)評(píng)分。染色強(qiáng)度為1～5級(jí),應(yīng)用SPSS和GraphPad軟件對(duì)肝細(xì)胞癌與正常組織進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,**:P<0.01 vs.正常組織;(C)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)正常肝細(xì)胞及肝癌細(xì)胞系中KCTD10 mRNA的相對(duì)水平;(D)免疫印跡法檢測(cè)KCTD10蛋白在不同肝癌細(xì)胞系中的含量。Fig.2 Expression analysis of KCTD10 in liver cancer tissues and cell lines(A)KCTD10 expression in 50 hepatocellular tumors and 10 adjacent normal tissues analyzed by IHC.The coloring degree of each sample was scored and divided into grades 1～5(Grade 1～Grade 5).Strong expression of KCTD10(stained brown)was detected in metastatic HCC.The nucleus was stained blue by hematoxylin(scale bar:50 μm);(B)IHC score of KCTD10 expression in HCC(T1～T4)and normal tissues.The staining intensity was scored with grades 1～5.Each symbol represents an individual sample.Statistical comparisons between HCC and normal tissues were performed by SPSS and GraphPad software.**:P<0.01 vs.normal tissue;(C)The relative levels of KCTD10 mRNA in normal hepatocytes and liver cancer cell lines detected by real-time quantitative PCR;(D)KCTD10 protein levels in different HCC cell lines detected by Western-blot.

2.3 KCTD10在HCC組織和肝癌細(xì)胞系中的表達(dá)部位發(fā)生變化

針對(duì)臨床病例和癌旁組織免疫組化結(jié)果的統(tǒng)計(jì)分析表明:相對(duì)癌旁組織,KCTD10在HCC組織細(xì)胞質(zhì)中的表達(dá)雖然增強(qiáng),但在細(xì)胞核中的表達(dá)降低。進(jìn)一步的分析顯示:KCTD10在肝癌組織細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中均有表達(dá)(圖3A),但與癌旁組織相比,肝癌組織中KCTD10的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量明顯減少,核陽(yáng)性細(xì)胞比例約占正常肝細(xì)胞核的40%(圖3B)。為了驗(yàn)證KCTD10在細(xì)胞的表達(dá)部位是否發(fā)生了改變,我們采用免疫印跡法對(duì)KCTD10在不同肝癌細(xì)胞系細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中的表達(dá)進(jìn)行了檢測(cè),結(jié)果顯示:在所有細(xì)胞系中,相對(duì)于細(xì)胞質(zhì),KCTD10在細(xì)胞核中均高表達(dá);KCTD10在高轉(zhuǎn)移潛能肝癌細(xì)胞系MHCC97H細(xì)胞質(zhì)中的表達(dá)水平明顯高于低轉(zhuǎn)移潛能肝癌細(xì)胞系HepG2、Hep3B和Huh7(圖3C)。由此推測(cè),細(xì)胞核內(nèi)外KCTD10的表達(dá)與肝癌的發(fā)生發(fā)展可能有密切關(guān)系。

圖3 KCTD10在HCC組織細(xì)胞核中的表達(dá)降低(A)免疫組織化學(xué)結(jié)果。與癌旁組織相比,HCC組織中KCTD10在細(xì)胞核中的表達(dá)減少(標(biāo)尺:50 μm);(B)核KCTD10陽(yáng)性細(xì)胞率的定量分析。每個(gè)組織計(jì)數(shù)5個(gè)以上視野并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,***:P<0.001 vs.癌旁組織;(C)免疫印跡法檢測(cè)KCTD10在不同肝癌細(xì)胞系細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中的表達(dá)水平。Fig.3 Decreased expression of KCTD10 in the nucleus of HCC cells(A)IHC analysis of normal and HCC livers.The expression of KCTD10 in the nucleus of HCC cells was reduced compared with that in the nucleus of adjacent tissue cells(scale bar:50 μm);(B)Quantitative analysis of the ratio of cells with a KCTD10-positive nucleus.More than 5 visual fields per tissue slice were counted and analyzed statistically.***:P<0.001 vs.normal liver;(C)The expression levels of KCTD10 in the cytoplasm and nucleus in different liver cancer cell lines detected by Western-blot.

2.4 DDC飲食誘導(dǎo)的急性肝損傷減弱了KCTD10在肝臟的表達(dá)

DDC飲食小鼠肝臟的天狼猩紅染色結(jié)果表明,與對(duì)照組相比,DDC處理后小鼠肝臟中膠原纖維增多(圖4A);實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示:Ⅰ型膠原 α1(collagen type I alpha 1,Col1a1)、Ⅲ型膠原α1(collagen type Ⅲ alpha 1,Col3a1)和金屬蛋白酶組織抑制因子(tissue inhibitor of metalloproteinases 1,Timp1)的表達(dá)水平在肝損傷后比對(duì)照組增加10倍以上(圖4B),因此我們認(rèn)為DDC引起的急性肝損傷是有效的。據(jù)此,我們用免疫組織化學(xué)方法來(lái)分析KCTD10在肝損傷前后的表達(dá),結(jié)果顯示:KCTD10在正常組織的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中均高表達(dá),DDC誘導(dǎo)4周后,小鼠肝細(xì)胞核明顯增大(圖4C),與對(duì)照組相比,KCTD10在細(xì)胞核的表達(dá)明顯降低,DDC處理后的核染色強(qiáng)度為對(duì)照組的80%左右(圖4C～D)。進(jìn)一步檢測(cè)小鼠肝組織細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中KCTD10蛋白的表達(dá),結(jié)果顯示:KCTD10在損傷的肝組織細(xì)胞核中的表達(dá)相對(duì)于正常組織明顯減少(圖4E～F)。上述結(jié)果表明,在DDC誘導(dǎo)的急性肝損傷模型中,肝細(xì)胞受損減弱了肝細(xì)胞核中KCTD10的表達(dá)。

圖4 KCTD10在受損的肝組織的細(xì)胞核中表達(dá)降低(A)天狼猩紅染色結(jié)果顯示,DDC處理后,肝臟的膠原纖維增加(標(biāo)尺:500 μm);(B)DDC處理后,纖維化相關(guān)因子Col1a1、Col3a1和Timp1的mRNA表達(dá)上調(diào)。***:P<0.001 vs.對(duì)照組;(C)DDC誘導(dǎo)急性肝損傷小鼠模型中KCTD10的免疫組織化學(xué)染色結(jié)果(標(biāo)尺:50 μm);(D)Image Pro Plus檢測(cè)細(xì)胞核內(nèi)KCTD10的表達(dá)。每只小鼠計(jì)數(shù)5個(gè)視野以上,*:P<0.05 vs.對(duì)照組;(E)免疫印跡法檢測(cè)KCTD10在DDC處理前后小鼠肝組織細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中的表達(dá)水平;(F)細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中KCTD10蛋白表達(dá)水平的灰度分析。ns:P＞0.05 vs.對(duì)照組。Fig.4 Decreased expression of KCTD10 in the nucleus of damaged liver cells(A)Increased collagen fibers of the liver after DDC treatment detected by picrosirius red staining(scale bar:500 μm);(B)Upregulated mRNA levels of fibrosis-related factors Col1a1,Col3a1 and Timp1 after DDC treatment.***:P<0.001 vs.control;(C)IHC results of KCTD10 in a mouse model of DDC-induced acute liver injury(scale bar:50 μm);(D)Expression of KCTD10 in the nucleus detected by Image Pro Plus.More than 5 fields of view in each group were counted.*:P<0.05 vs.control;(E)Expression of KCTD10 in the cytoplasm and nucleus of liver tissues in mice before and after DDC treatment;(F)Gray scale analysis of KCTD10 levels in the cytoplasm and nucleus.ns:P＞0.05 vs.control.

3 討論

目前,針對(duì)HCC的治療方式仍然以手術(shù)、放療、化療等保守治療為主[13],臨床上尚缺乏理想的分子標(biāo)記和有效的分子靶向治療藥物,因此,有必要研究并開(kāi)發(fā)新的治療靶標(biāo)和分子靶向治療藥物,以提高其診斷和輔助治療水平。

孫吉康等[14]研究發(fā)現(xiàn),KCTD10在小鼠胚胎的神經(jīng)管和背根神經(jīng)節(jié)的神經(jīng)上皮細(xì)胞中高表達(dá);張敏等[15]進(jìn)行臨床研究發(fā)現(xiàn),與正常腦組織相比,KCTD10在人類神經(jīng)膠質(zhì)瘤標(biāo)本中的表達(dá)水平明顯升高;黃亮等[16]的研究報(bào)道KCTD10在上皮型腦膜瘤中高表達(dá),而在正常腦組織中無(wú)表達(dá),這些都提示KCTD10在神經(jīng)膠質(zhì)瘤和上皮型腦膜瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要作用。但是,其他腫瘤疾病中不僅缺乏針對(duì)臨床標(biāo)本的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),KCTD10在其中是否發(fā)揮重要作用也仍待研究。HCC患者中,目前尚缺乏針對(duì)KCTD10在臨床組織中表達(dá)情況的數(shù)據(jù)分析,因此我們利用UALCAN數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)HCC患者肝組織中的KCTD10進(jìn)行了分析。結(jié)果表明,與癌旁組織相比,HCC組織中KCTD10的表達(dá)水平更高,其表達(dá)水平隨臨床分期的等級(jí)增加而遞增(圖1)。這種臨床病例表達(dá)分析的研究為KCTD10在臨床上的應(yīng)用提供了可靠的思路依據(jù),并為其臨床應(yīng)用提供了參考。隨后,組織芯片檢測(cè)結(jié)果也顯示,KCTD10在50例肝癌組織樣本中表達(dá)較高,并且與HCC的發(fā)生發(fā)展以及惡性程度高度相關(guān)(圖2A～B),這與UALCAN數(shù)據(jù)庫(kù)的結(jié)果一致。同時(shí),我們還利用常見(jiàn)的肝癌細(xì)胞系 HepG2、Huh7、Hep3B、MHCC97H,采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR及免疫印跡技術(shù)從mRNA和蛋白質(zhì)水平檢測(cè)了KCTD10的表達(dá)。結(jié)果顯示,KCTD10在肝癌細(xì)胞Hep3B和MHCC97H中的表達(dá)水平高于LX2細(xì)胞(圖2C～D)。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果充分說(shuō)明,在HCC組織和細(xì)胞水平上KCTD10均高表達(dá),且與HCC的進(jìn)展關(guān)系密切。

一般認(rèn)為,真核生物的轉(zhuǎn)錄過(guò)程主要是在細(xì)胞核內(nèi)進(jìn)行,當(dāng)其受到影響時(shí),可導(dǎo)致疾病發(fā)生[17～18]。本研究采用免疫組織化學(xué)方法對(duì)KCTD10的表達(dá)進(jìn)行定位分析,發(fā)現(xiàn)與正常組織相比,肝癌組織細(xì)胞核中KCTD10的表達(dá)明顯下降(圖3A)。進(jìn)一步提取各肝癌細(xì)胞系的核質(zhì)蛋白質(zhì),免疫印跡結(jié)果顯示,KCTD10在各細(xì)胞系的細(xì)胞核中的表達(dá)都較高(圖3C),與肝癌組織免疫組化結(jié)果存在一定差異,其原因之一可能是細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)的蛋白質(zhì)抽提分離得不夠徹底,細(xì)胞質(zhì)中的高表達(dá)可能在一定程度上影響了細(xì)胞核中蛋白質(zhì)水平的真實(shí)反映;原因之二可能是細(xì)胞系和臨床肝癌組織存在一定差異性。同時(shí),免疫印跡結(jié)果顯示,KCTD10在高轉(zhuǎn)移肝癌細(xì)胞株MHCC97H細(xì)胞質(zhì)中的表達(dá)明顯高于其他肝癌細(xì)胞株,這仍舊能夠說(shuō)明癌癥的惡性程度影響了KCTD10表達(dá)部位的變化。這種由KCTD10表達(dá)部位發(fā)生變化引起的表達(dá)失調(diào)提示,KCTD10可作為檢測(cè)HCC發(fā)生的一種早期分子標(biāo)志物,為肝癌的早期診斷提供了新的思路。

肝癌的發(fā)展過(guò)程主要是肝損傷、肝硬化和肝癌[19]。本研究用DDC飲食誘導(dǎo)小鼠建立了肝損傷的模型,結(jié)果顯示與小鼠正常肝組織相比,KCTD10在受損肝組織的細(xì)胞核中表達(dá)減弱(圖4),這進(jìn)一步說(shuō)明了KCTD10的表達(dá)紊亂與肝臟疾病的發(fā)生密切相關(guān)。

綜上所述,KCTD10在HCC中高表達(dá),隨著HCC級(jí)別增加其表達(dá)水平呈遞增趨勢(shì),并出現(xiàn)了從細(xì)胞核到細(xì)胞質(zhì)的轉(zhuǎn)移,這種變化與KCTD10在肝損傷組織細(xì)胞核中的表達(dá)減少相一致。以上信息提示,KCTD10可能參與HCC發(fā)生發(fā)展過(guò)程,并可作為HCC早期診斷的分子標(biāo)記物,這為臨床早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷和評(píng)價(jià)肝癌的發(fā)生發(fā)展提供了線索。