查艷芳，楊雯雯，戶守鑫，崔克樂，胡世蓮，程民,

1.中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)附屬第一醫(yī)院西區(qū)(安徽省腫瘤醫(yī)院)腫瘤分子實(shí)驗(yàn)室，合肥 230031；2.中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)附屬第一醫(yī)院(安徽省立醫(yī)院)

呼吸道共生菌在維持肺臟免疫穩(wěn)態(tài)以及肺臟疾病發(fā)生發(fā)展過程中均具有重要作用。腸道共生菌與肺臟關(guān)系密切，在體內(nèi)形成“腸-肺”軸，遠(yuǎn)端調(diào)控肺臟免疫穩(wěn)態(tài)及免疫應(yīng)答。核轉(zhuǎn)錄因子κB(NF-κB)、抑制性κB激酶α/β(IKK-α/β)及磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)等信號(hào)通路分子參與多種細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)，與炎癥、腫瘤、哮喘等多種肺臟疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。共生菌對肺臟組織中NF-κB、IKK-α/β及PI3K等分子表達(dá)水平的調(diào)控值得深入研究。本研究通過檢測共生菌缺失小鼠及正常小鼠肺臟組織中NF-κB、IKK-α/β、PI3K的表達(dá)量及其磷酸化水平，探討共生菌對肺臟NF-κB、IKK-α/β、PI3K表達(dá)的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 C57BL/6小鼠(SPF級(jí))購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物責(zé)任有限公司，5～6周齡，雌性，共12只，按體重隨機(jī)分為兩組(實(shí)驗(yàn)組和對照組)，6只/組；飼養(yǎng)條件為22 ℃、55%相對濕度、晝/夜(12 h/12 h)節(jié)奏，飼養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)操作均遵循中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理規(guī)范條例執(zhí)行。

1.1.2 抗菌藥物 萬古霉素(貨號(hào)：S17059)購自上海源葉生物科技有限公司。氨芐青霉素(貨號(hào)：A610028)、新霉素(貨號(hào)：A610366)和甲硝唑(貨號(hào)：A600633)購自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.1.3 組織蛋白提取及定量試劑 Western及IP細(xì)胞裂解液(貨號(hào)：P0013)及BCA蛋白濃度測定試劑盒(貨號(hào)：P0010)購自碧云天生物技術(shù)有限公司；磷酸酶抑制劑片(貨號(hào)：4906845001)及蛋白酶抑制劑混合片(貨號(hào)：04693124001)購自Roche公司。

1.1.4 抗體 NF-κB p65 (L8F6) mouse mAb(貨號(hào)：6956)、IKK-α antibody(貨號(hào)：2682)、IKK-β (2C8) rabbit mAb(貨號(hào)：2370)、PI3 Kinase p85 Antibody(貨號(hào)：4292)、phospho-NF-κB (Ser536) (93H1) rabbit mAb(貨號(hào)：4025)、phospho-IKK-α/β (Ser176/180) (16A6) rabbit mAb(貨號(hào)：2697)、phospho-PI3K p85 (Tyr458)/p55 (Tyr199) antibody(貨號(hào)：4228)、β-actin antibody(貨號(hào)：4967)、anti-rabbit IgG HRP-linked antibody(貨號(hào)：7074)、anti-mouse IgG HRP-linked antibody(貨號(hào)：7076)均購自Cell Signaling公司。

1.1.5 SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜及顯色試劑 SDS-PAGE凝膠配制試劑盒(貨號(hào)：P0012A)、彩色預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)(貨號(hào)：P0068)及極超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(貨號(hào)：P0018FM)均購自碧云天生物技術(shù)有限公司；PVDF膜(貨號(hào)：IPVH00010)購自Miilipore公司。

1.2 方法

1.2.1 共生菌缺失小鼠模型的建立 使用含萬古霉素(0.5 g/L)、氨芐青霉素(1.0 g/L)、甲硝唑(1.0 g/L)及新霉素(1.0 g/L)4種抗菌藥物的飲用水連續(xù)飼喂實(shí)驗(yàn)組C57BL/6小鼠(5～6周齡，雌性，SPF級(jí)，共6只)5周，構(gòu)建共生菌缺失小鼠模型[1]。實(shí)驗(yàn)過程中對照組小鼠使用不含抗菌藥物的飲用水進(jìn)行飼喂。

1.2.2 肺臟標(biāo)本獲取 將共生菌缺失小鼠及正常對照小鼠(各6只)摘眼球取血后，脫臼處死，解剖小鼠。取100 mg肺臟組織，放入1.8 mL凍存管中，保存于-80 ℃冰箱中，備用。

1.2.3 肺臟組織蛋白提取及定量 取-80 ℃保存的小鼠肺臟組織，每管加入500 μL Western及IP細(xì)胞裂解液(含蛋白酶及磷酸酶抑制劑)，60 Hz，研磨2 min，冰上放置10 min。12 000 g，4 ℃，離心10 min。將上清轉(zhuǎn)移至1.5 mL無菌EP管中，12 000 g，4 ℃，離心10 min。吸取上清液，使用BCA試劑盒進(jìn)行蛋白定量，并將定量后的肺臟蛋白分裝至0.5 mL無菌EP管中，-80 ℃保存，備用。

1.2.4 Western blot檢測 將待測的蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳(8%濃縮膠，10%分離膠)，上樣量50 μg總蛋白/孔，濃縮膠80 V，電泳30 min；分離膠120 V，電泳1 h。利用半干法將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜；之后進(jìn)行封閉、一抗標(biāo)記、二抗標(biāo)記等，用ECL發(fā)光試劑盒進(jìn)行顯色，化學(xué)發(fā)光儀成像，用Image J軟件進(jìn)行條帶分析。

2 結(jié)果

2.1 共生菌缺失小鼠及正常小鼠肺臟組織中NF-κB的表達(dá)情況及其磷酸化水平 利用Western blot方法檢測NF-κB蛋白的表達(dá)情況及其磷酸化水平，結(jié)果顯示，共生菌缺失小鼠肺臟中NF-κB蛋白的相對表達(dá)量為1.609±0.084，較正常小鼠肺臟(1.000±0.000)升高(t=7.287，P<0.01)，磷酸化NF-κB蛋白(pho-NF-κB)的相對表達(dá)水平為2.039±0.133，亦高于正常小鼠肺臟(1.000±0.000)(t=7.812；P<0.01)。見圖1。

圖1 Western blot方法檢測共生菌缺失小鼠肺臟組織中NF-κB蛋白的電泳條帶(n=6)

2.2 共生菌缺失小鼠及正常小鼠肺臟組織中IKK-α、IKK-β的表達(dá)情況及其磷酸化水平 利用Western blot方法檢測IKK-α、IKK-β蛋白的表達(dá)情況及其磷酸化水平，結(jié)果顯示，共生菌缺失小鼠肺臟中IKK-α蛋白的相對表達(dá)量為1.206±0.095，與正常小鼠肺臟(1.000±0.000)相比無明顯變化(t=2.170；P=0.055)，IKK-β蛋白的相對表達(dá)量為3.389±0.184，較正常小鼠肺臟(1.000±0.000)升高(t=13.012，P<0.01)，磷酸化IKK-α/β蛋白(pho-IKK-α/β)的相對表達(dá)水平為1.433±0.053，亦高于正常小鼠肺臟(1.000±0.000)(t=8.203，P<0.01)。見圖2。

圖2 Western blot方法檢測共生菌缺失小鼠肺臟組織中IKK-α、IKK-β蛋白的電泳條帶(n=6)

2.3 共生菌缺失小鼠及正常小鼠肺臟組織中PI3K的表達(dá)情況及其磷酸化水平 利用Western blot方法檢測PI3K蛋白的表達(dá)情況及其磷酸化水平，結(jié)果顯示，共生菌缺失小鼠肺臟中PI3K蛋白的相對表達(dá)量為1.414±0.024，較正常小鼠肺臟(1.000±0.000)升高(t=17.206；P<0.01)，磷酸化PI3K蛋白(pho-PI3K p85/p55)的相對表達(dá)水平為3.171±0.237亦高于正常小鼠肺臟(1.000±0.000)(t=9.160；P<0.01)。見圖3。

圖3 Western blot方法檢測共生菌缺失小鼠肺臟組織中PI3K蛋白的電泳條帶(n=6)

3 討論

共生菌在維持黏膜免疫系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮著重要的作用，共生菌與免疫系統(tǒng)之間存在錯(cuò)綜復(fù)雜的關(guān)系與精妙的平衡[2]。呼吸道共生菌在維持肺臟免疫穩(wěn)態(tài)以及肺臟疾病發(fā)生發(fā)展過程中均具有重要作用[3-5]。腸道共生菌亦可遠(yuǎn)端調(diào)控肺臟免疫穩(wěn)態(tài)及免疫應(yīng)答[6]。本課題組前期的研究發(fā)現(xiàn)，共生菌缺失小鼠較正常小鼠更易發(fā)生肺部腫瘤，共生菌缺失導(dǎo)致肺臟γδT細(xì)胞及肺泡巨噬細(xì)胞功能變化，進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤進(jìn)展[1,7]，但共生菌缺失對小鼠肺臟組織中信號(hào)通路分子，特別是NF-κB、IKK-α/β及PI3K等分子表達(dá)及其磷酸化水平的影響尚不明確。

在哺乳動(dòng)物中，NF-κB由5個(gè)普遍表達(dá)的成員(p50、p52、p65/RelA、RelB和c-Rel)組成，形成同源或異二聚體[8]。在非活性狀態(tài)下，NF-κB存在于胞漿內(nèi)，并與IκB家族(IKKs)的抑制蛋白相結(jié)合。細(xì)菌脂多糖、病毒、氧化劑、細(xì)胞因子等與細(xì)胞膜上的受體蛋白結(jié)合，活化IKK并釋放NF-κB二聚體，自由的NF-κB進(jìn)入細(xì)胞核，調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)[9]。IKK作為NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的重要成員，包括催化亞基IKKα、IKKβ及調(diào)節(jié)亞基IKKγ 3個(gè)亞基。IKK/NF-κB信號(hào)通路在哮喘、神經(jīng)退行性變、炎癥和癌癥等的發(fā)病機(jī)制中起著至關(guān)重要的作用。IKK-α信號(hào)可通過活化Erk、p38和mTor等蛋白，或上調(diào)EGFR和NF-κB活性及激活c-Myc、Smad2/3和Snail信號(hào)進(jìn)而加速肺臟腫瘤的進(jìn)展[10]。IKK-β/NF-κB信號(hào)通過調(diào)控癌細(xì)胞的生存、凋亡和遷移等改變多種腫瘤的致癌能力[11]。

磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)是一類調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、代謝、蛋白質(zhì)合成和存活的胞內(nèi)磷脂酰肌醇激酶[12]，參與增殖、分化、凋亡和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)等多種細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)。PI3K信號(hào)通路過度活化與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。目前，多項(xiàng)臨床試驗(yàn)均證實(shí)了PI3K抑制劑在實(shí)體瘤中的療效，包括子宮內(nèi)膜癌、乳腺癌、前列腺癌、非小細(xì)胞肺癌等[13]。在肺癌中，PI3K信號(hào)上調(diào)表達(dá)可促進(jìn)肺癌細(xì)胞增殖、存活和組織侵襲等，PI3K信號(hào)上調(diào)與口腔部位的共生菌在下呼吸道富集密切相關(guān)[4]。

本研究通過檢測共生菌缺失小鼠及正常小鼠肺臟NF-κB、IKK-α/β及PI3K的表達(dá)情況及其磷酸化水平，發(fā)現(xiàn)共生菌缺失小鼠肺臟中NF-κB蛋白的表達(dá)量及其磷酸化水平均較正常小鼠肺臟升高(P<0.01)；IKK-α蛋白的表達(dá)水平與正常小鼠肺臟相比無明顯變化(P>0.05)，但I(xiàn)KK-β蛋白的表達(dá)水平及IKK-α/β蛋白的磷酸化程度均高于正常小鼠肺臟組織(P<0.01)；PI3K蛋白的表達(dá)水平及PI3K蛋白(p85/p55)的磷酸化程度亦高于正常小鼠肺臟組織(P<0.01)。上述結(jié)果表明共生菌可以調(diào)控肺臟組織中NF-κB、IKK-α/β及PI3K等分子表達(dá)量及其磷酸化水平，本研究結(jié)果為進(jìn)一步探索共生菌在肺臟免疫穩(wěn)態(tài)維持、肺臟疾病發(fā)生發(fā)展過程中的作用及作用機(jī)制提供了新的依據(jù)和參考。