楊振寰，賈子君，索菲婭，朱曉燃，姚樹坤

(1. 北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029；2. 中日友好醫(yī)院，北京 100029)

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)屬于炎癥性腸病(inflammatory bowel disease，IBD)的范疇，主要表現(xiàn)為腹痛、腹瀉、黏液膿血便，以發(fā)作、緩解及復(fù)發(fā)交替為疾病特點(diǎn)，好發(fā)于直腸和乙狀結(jié)腸，是消化系統(tǒng)的常見病、多發(fā)病、疑難病。目前UC的病因與發(fā)病機(jī)制尚不明確，普遍認(rèn)為環(huán)境、遺傳、免疫和腸道微生物等多種因素在UC的發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵作用[1]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)采用的水楊酸制劑、免疫抑制劑、生物制劑等藥物可緩解UC癥狀，但存在復(fù)發(fā)率高、不良反應(yīng)多、價(jià)格昂貴、患者依從性差等缺點(diǎn)。近年來中醫(yī)藥治療UC取得了較好的效果，存在不良反應(yīng)少、復(fù)發(fā)率低、患者依從性好的優(yōu)勢(shì)，可以明顯改善UC患者癥狀，修復(fù)腸道黏膜，降低疾病活動(dòng)度，提高其生活質(zhì)量。UC 歸屬于中醫(yī)“痢疾”“久痢”“腸澼”等范疇，活動(dòng)期主要病機(jī)為濕熱蘊(yùn)結(jié)、氣血不和，甚則兼挾熱毒、痰濁、瘀血[2]。黃連解毒湯出自《肘后備急方》，但有方無名，名見《外臺(tái)秘要》，由黃連、黃芩、黃柏、梔子按3∶2∶2∶3比例組成，具有清熱燥濕、瀉火解毒的功效，主治實(shí)熱火毒、三焦熱盛之證，可用于治療急性腸炎、膿毒癥等屬熱毒患者?；A(chǔ)研究表明，黃連解毒湯可能通過抑制NF-κB信號(hào)通路，激活Nrf2信號(hào)通路，增強(qiáng)腸屏障功能，降低UC小鼠結(jié)腸組織IL-1β、IL-6和TNF-α水平而發(fā)揮抗炎作用[3-4]。臨床研究表明黃連解毒湯聯(lián)合美沙拉嗪治療后，UC患者變形菌門豐度下降、厚壁菌門豐度升高，還可以顯著改善腸道菌群失調(diào)癥狀[5]，但該方治療 UC 的作用機(jī)制尚不清楚。由于中藥復(fù)方制劑組方復(fù)雜，成分眾多，常規(guī)的藥理學(xué)研究難以全面揭示其潛在的作用機(jī)制，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)符合中醫(yī)藥系統(tǒng)性和整體性的思維模式，可以通過構(gòu)建“疾病-基因-藥物”網(wǎng)絡(luò)分析藥物的潛在作用機(jī)制[6]。崔曉娟等[7]基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析發(fā)現(xiàn)龍血竭可以緩解UC小鼠結(jié)腸黏膜損傷，可能通過黃酮類成分調(diào)控ABL1、JAK2、IL-6、PTGS2蛋白表達(dá)，進(jìn)而干預(yù)JAK2/STAT3、PI3K-AKT-m TOR通路，調(diào)節(jié)炎癥因子的水平?？紤]到中藥治療疾病涉及多成分、多靶點(diǎn)、多通路的特點(diǎn)，本文從網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的角度對(duì)黃連解毒湯治療 UC 的主要有效成分、靶點(diǎn)和通路進(jìn)行了預(yù)測(cè)分析，評(píng)估藥物與相關(guān)基因的作用關(guān)系，為后期臨床研究與基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)提供新的思路與方向，也為治療UC新的中藥單體的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1黃連解毒湯的活性成分及靶點(diǎn) 從中藥系統(tǒng)藥理數(shù)據(jù)庫(TCMSP)(https://tcmspw.com/tcmsp.php)獲取黃連解毒湯的4味中藥“黃連”“黃芩”“黃柏”“梔子”的化學(xué)成分，設(shè)置化合物的類藥性(drug-like，DL)和口服利用度(oral bioavailability，OB)作為篩選參數(shù)，選取DL≥0.18且OB≥30%的藥效成分庫，整理活性成分所涉及的靶點(diǎn)，再通過Uniprot數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org/)進(jìn)行靶點(diǎn)基因注釋。

1.2UC相關(guān)基因的選取 通過人類基因組注釋數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org/)和OMIM(https://www.omim.org/)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索，篩選UC相關(guān)基因，將獲取的UC基因與黃連解毒湯的靶點(diǎn)基因?qū)Ρ?，取兩者交集，篩選出共同基因，利用R軟件制作韋恩圖。

1.3有效成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 將藥物活性成分、共同基因的對(duì)應(yīng)關(guān)系導(dǎo)入網(wǎng)絡(luò)可視化軟件Cytoscape 3.8.0，繪制“黃連解毒湯活性成分-靶點(diǎn)-潰瘍性結(jié)腸炎”網(wǎng)絡(luò)圖。

1.4蛋白與蛋白互相作用(protein-protein interaction，PPI)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與核心靶點(diǎn)的分析 將共同基因?qū)隨TRING數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/)，物種選擇為“homo sapiens”，繪制黃連解毒湯治療UC靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)互作圖，設(shè)置high confidence=0.7作為最低互作分?jǐn)?shù)。使用R語言計(jì)算各主要蛋白之間的互作次數(shù)，找到核心靶點(diǎn)，生成barplot核心靶點(diǎn)圖。

1.5GO功能富集與KEGG通路富集分析 使用R軟件對(duì)黃連解毒湯與UC的共同靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能富集與KEGG通路富集分析，篩選出黃連解毒湯治療UC的主要分子功能和信號(hào)通路。

2 結(jié) 果

2.1黃連解毒湯活性成分和潛在靶點(diǎn) 根據(jù)DL≥0.18且OB≥30%的條件篩選，獲取黃連的有效成分14個(gè)，黃芩36個(gè)，黃柏37個(gè)，梔子15個(gè)，去除重復(fù)的活性成分如MOL000098 quercetin(槲皮素)、MOL000358 beta-sitosterol(β-谷甾醇)、MOL000449 Stigmasterol(豆甾醇)等共獲得86個(gè)活性成分。匯集每個(gè)活性成分所涉及的潛在靶點(diǎn)后，再通過Uniprot數(shù)據(jù)庫比對(duì)校正后去重，共獲得244個(gè)潛在靶點(diǎn)。

2.2UC相關(guān)基因 以“ulcerative colitis”為檢索詞，在Genecards數(shù)據(jù)庫里共找到4 356個(gè)疾病相關(guān)基因，在OMIM數(shù)據(jù)庫里找到199個(gè)疾病相關(guān)基因，與黃連解毒湯活性成分潛在靶點(diǎn)對(duì)比，共有152個(gè)共同基因，韋恩圖見圖1。

2.3黃連解毒湯有效成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò) 將生成的成分-靶點(diǎn)關(guān)系導(dǎo)入Cytoscape 3.8.0軟件，繪制黃連解毒湯有效成分-靶點(diǎn)-疾病的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖，圖中紅的橢圓形為上述152個(gè)共同基因，三角形表示黃連解毒湯中能與這些基因反應(yīng)的有效成分，紫紅色代表黃連、藍(lán)色代表黃芩、黃色代表黃柏，橘色代表?xiàng)d子，共57個(gè)有效成分。其中治療靶點(diǎn)最多的有效成分是來源于黃連、黃柏、梔子的quercetin(槲皮素)，作用靶點(diǎn)為111個(gè)；其次為來源于梔子的kaempferol(山柰酚)，作用靶點(diǎn)37個(gè)；來源于黃芩的wogonin(漢黃芩素)作用靶點(diǎn)35個(gè)、baicalein(黃芩素)作用靶點(diǎn)26個(gè)、acacetin(金合歡素)作用靶點(diǎn)17個(gè)、Moslosooflavone(蘇薺苧黃酮)作用靶點(diǎn)16個(gè)；來源于黃芩、黃柏、梔子的beta-sitosterol(β -谷甾醇)作用靶點(diǎn)16個(gè)；來源于黃柏的rutaecarpine(吳茱萸次堿)作用靶點(diǎn)14個(gè)。具體見圖2、表1。

表1 黃連解毒湯治療潰瘍性結(jié)腸炎的有效成分

續(xù)表

2.4核心靶點(diǎn)互作圖 將上述152個(gè)共同靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫中，選取打分值高于0.7的高置信度蛋白互作關(guān)系數(shù)據(jù)，獲得蛋白相互作用圖，見圖3。圖中圓形節(jié)點(diǎn)表示每個(gè)基因蛋白，節(jié)點(diǎn)之間的直線代表該直線連接的2個(gè)蛋白有相互作用關(guān)系(如共表達(dá)、蛋白質(zhì)同源性、基因鄰接、基因融合等)，線越粗代表作用關(guān)系越強(qiáng)。應(yīng)用R語言得到互作關(guān)系排名前30的靶點(diǎn)。Barplot圖顯示AKT1、TP53、MAPK1、JUN、IL6、TNF、MAPK8、VEGFA、MYC、CXCL8、EGFR、IL1B、MMP9、CCND1、EGF、PTGS2、IL10、IL4、MMP2等基因排名靠前，為核心靶點(diǎn)，具體見圖4。

2.5GO功能富集分析 使用R軟件對(duì)黃連解毒湯與UC的共同靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能富集分析，共富集155個(gè)GO功能。選取富集數(shù)基因靠前的30個(gè)GO條目作圖,Y軸GO條目代表生物過程,X軸代表目標(biāo)基因集中屬于GO的基因比例，氣泡面積大小代表富集的基因數(shù)量,氣泡顏色代表富集顯著性，顏色越深表示P值越小。篩選出30個(gè)富集基因數(shù)靠前的分子功能，見圖5。主要影響DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、細(xì)胞因子受體結(jié)合、DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄激活因子活性及RNA聚合酶Ⅱ特異性、受體配體活性、細(xì)胞因子活性等。

2.6KEGG通路富集分析 使用R軟件對(duì)黃連解毒湯與UC的共同靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG通路富集分析，共篩選出156條信號(hào)通路，其中富集基因數(shù)較多有AGE-RAGE信號(hào)通路、PI3K-AKT信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路、IL-17信號(hào)通路、Th-17細(xì)胞分化、Toll樣受體(TLR)信號(hào)通路和一些癌癥相關(guān)的信號(hào)通路，在炎癥、細(xì)胞增殖、分化和凋亡過程中起著重要的調(diào)節(jié)作用，具體見圖6。與UC相關(guān)性比較大的有25條信號(hào)通路，見表2。采用Cytoscape軟件繪制黃連解毒湯主要有效成分-核心靶點(diǎn)-主要信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)圖,見圖7。其中黃色代表主要有效成分、褐色表示主要信號(hào)通路，綠色表示核心靶點(diǎn)。從圖中可見, 黃連解毒湯的主要活性成分Quercetin(槲皮素)、Kaempferol(山柰酚)、acacetin(金合歡素)、wogonin(漢黃芩素)、baicalein(黃芩素)、Berberine(小檗堿)等作用于不同靶點(diǎn)和信號(hào)通路。

3 討 論

黃連解毒湯具有良好的抗炎、抗氧化、抗動(dòng)脈粥樣硬化作用[8]，動(dòng)物研究表明黃連解毒湯可減輕UC小鼠腸黏膜損傷，通過JAK2/STAT3途徑下調(diào)JAK2、STAT3的表達(dá)，降低結(jié)腸巨噬細(xì)胞免疫反應(yīng)性，減輕炎癥反應(yīng)[9]。本方苦寒，適用于UC活動(dòng)期熱毒熾盛證或大腸濕熱證患者，患者不可多服、久服，應(yīng)根據(jù)患者證候變化隨證加減。鑒于以往研究多是基于單通路，大數(shù)據(jù)的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)已廣泛應(yīng)用于分析復(fù)雜成分的中藥方劑作用機(jī)制，故本研究基于多成分、多靶點(diǎn)作用的研究思路，應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法對(duì)黃連解毒湯中的有效成分進(jìn)行篩選，預(yù)測(cè)治療UC的關(guān)鍵靶點(diǎn)和信號(hào)通路，闡述其治療UC潛在作用機(jī)制。

表2 黃連解毒湯治療潰瘍性結(jié)腸炎的共同靶點(diǎn)主要通路 KEGG 富集分析

既往研究表明黃芩提取物黃芩苷可以減輕氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)[10]。黃連中有效成分小檗堿具有抗炎活性，臨床可用于治療慢性腸炎及腹瀉患者，調(diào)節(jié)Th17細(xì)胞的反應(yīng)，改善上皮屏障功能，抑制脂質(zhì)過氧化來減輕急性或慢性結(jié)腸炎[11-12]。本研究中除了黃芩苷、小檗堿，還發(fā)現(xiàn)了源于黃連、黃柏、梔子的Quercetin(槲皮素)，來源于梔子的Kaempferol(山柰酚)，來源于黃芩的Wogonin(漢黃芩素)、Baicalein(黃芩素)、Acacetin(金合歡素)、Moslosooflavone(蘇薺苧黃酮)，來源于黃芩、黃柏、梔子的beta-sitosterol(β -谷甾醇)，治療UC的靶點(diǎn)也較多，而目前關(guān)于這些中藥單體治療UC的研究仍然較少，值得進(jìn)一步開發(fā)研究。

AKT也被稱為蛋白激酶B(protein kinase B，PKB)，在黃連解毒湯治療UC的關(guān)鍵靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)關(guān)系中處于核心地位。AKT活性是在受體酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinases，RTKs)下游調(diào)節(jié)的，如表皮生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor，EGF)和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)。AKT是PI3K-AKT通路的核心靶點(diǎn)，位點(diǎn)被磷酸化后，結(jié)合在細(xì)胞膜上的AKT即完全激活[13]。MAPK是細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要途徑，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的分化、增殖、分裂和凋亡。除了細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2(extracellular signal-regulated kinase 1/2，ERK1/2)，MAPK家族還有另外兩個(gè)成員，c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)和p38激酶(p38 MAPK)[14-15]。IBD的慢性黏膜炎癥是由于效應(yīng)性免疫細(xì)胞過度激活，產(chǎn)生高水平的促炎細(xì)胞因子，如TNF-α、IL-6和IL-1，導(dǎo)致結(jié)腸組織損傷，NF-κB被認(rèn)為是這一免疫學(xué)環(huán)境中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子之一[16]?；|(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)是一種內(nèi)肽酶，生理?xiàng)l件下，MMPs在組織重塑和創(chuàng)傷修復(fù)中發(fā)揮重要作用，然而表達(dá)失調(diào)會(huì)導(dǎo)致過度和持續(xù)的炎癥反應(yīng)，進(jìn)而損傷腸道。MMP-9是一種由結(jié)腸上皮和中性粒細(xì)胞釋放的明膠酶,參與Ⅳ型膠原的降解，UC患者結(jié)腸表面上皮細(xì)胞MMP-9蛋白表達(dá)增強(qiáng)，可能通過提高腸上皮細(xì)胞肌球蛋白輕鏈激酶(myosin light chain kinase，MLCK)的表達(dá)使腸黏膜通透性增高進(jìn)而參與IBD的發(fā)生[17-18]。所以本研究中發(fā)現(xiàn)的黃連解毒湯治療UC的有效成分如槲皮素、山柰酚、漢黃芩素、黃芩素、金合歡素、蘇薺苧黃酮、β -谷甾醇等調(diào)控AKT1、MAPK1、IL6、TNF、VEGFA、CXCL8、IL1B、MMP9、PTGS2、IL10、IL4等關(guān)鍵靶點(diǎn)表達(dá)，說明黃連解毒湯的有效成分可以降低腸道炎癥、調(diào)控細(xì)胞凋亡、改善腸屏障功能，從而促進(jìn)UC腸黏膜修復(fù)。

PI3K是細(xì)胞內(nèi)信號(hào)的一種脂類第二信使,PI3K/AKT信號(hào)傳導(dǎo)通路在調(diào)控凋亡、調(diào)節(jié)免疫、腸道炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。PI3K/AKT信號(hào)通路是NF-κB的上游激活劑，NF-κB 的活化可以誘導(dǎo)促炎因子、趨化因子、黏附分子以及誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)、環(huán)氧合酶-2(COX-2)的表達(dá)，進(jìn)而趨化大量中性粒細(xì)胞等炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。研究表明氧化苦參堿、黃芩苷能通過PI3K/AKT途徑抗炎、調(diào)控凋亡、下調(diào)Th1和Th17細(xì)胞分化，從而顯著改善UC[19-20]。p38 MAPK信號(hào)通路是MAPK信號(hào)通路之一，在炎癥、細(xì)胞凋亡過程中起重要作用[21]。研究表明參苓白術(shù)散可通過阻斷p38 MAPK信號(hào)通路,降低TNF-α并升高IL-4表達(dá)水平,改善UC大鼠結(jié)腸黏膜炎癥修復(fù)[22]。

先天性和獲得性免疫反應(yīng)是IBD發(fā)生發(fā)展的重要因素。Th17參與了IBD的發(fā)病過程，成為治療IBD的重要靶點(diǎn)[23]。Th17能夠產(chǎn)生IL-17細(xì)胞因子，由于其在黏膜免疫反應(yīng)中的促炎作用，在IBD中起著關(guān)鍵的致病作用。因此，調(diào)節(jié)Th17細(xì)胞的分化和功能目前被認(rèn)為是治療IBD腸炎的一個(gè)潛在的可行靶點(diǎn)。研究表明姜黃素治療組小鼠結(jié)腸組織中的IL-6、p-STAT3、RORγt、IL-17明顯降低，TGF-β含量明顯升高，提示姜黃素可能是通過調(diào)節(jié)Th17細(xì)胞分化，調(diào)控Th17/Treg平衡，從而改善結(jié)腸炎癥[24]。Toll樣受體(Toll-like receptor，TLR)是一類在天然免疫系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用并參與炎癥過程的蛋白質(zhì)，在IBD的發(fā)病機(jī)制中起著核心作用。TLR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活誘導(dǎo)了許多發(fā)揮宿主防御功能的基因，包括炎性細(xì)胞因子、趨化因子和抗原提呈分子[25]。與分泌蛋白MD-2和CD14一起刺激下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，激活NF-κB和激活蛋白-1(AP-1)，誘導(dǎo)效應(yīng)細(xì)胞的炎癥介質(zhì)的表達(dá)[26-27]。

綜上所述，黃連解毒湯治療UC的機(jī)制可能為通過槲皮素、山柰酚、漢黃芩素、黃芩素、金合歡素、蘇薺苧黃酮、β -谷甾醇等成分調(diào)控AKT1、MAPK1、IL6、TNF、VEGFA、CXCL8、IL1B、MMP9、PTGS2、IL10、IL4等靶點(diǎn)表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控PI3K-AKT、MAPK、TNF、IL-17、TLR信號(hào)通路，降低炎癥因子的水平、調(diào)節(jié)腸黏膜免疫、調(diào)控細(xì)胞凋亡、改善腸屏障功能，最終緩解UC結(jié)腸黏膜損傷，體現(xiàn)了黃連解毒湯可以多成分、多靶點(diǎn)、多通路治療UC。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。