崔業(yè)波 張靖也 馬彧*

（1.四平市食品藥品檢驗所 吉林四平 136000；2四平吉平泌尿肛腸病醫(yī)院）

1 前言

草烏是毛茛科植物北烏頭（Acanitum kusnezoffiiReichb.）的干燥塊根，秋季采挖，除去須根，干燥，即得。其藥用歷史悠久，有大毒，因此在臨床應用中多為炮制品，其炮制有生草烏、制草烏、黑豆制草烏、甘草制草烏等，其目的均為降低草烏中雙酯型生物堿的含量，從而在保持其療效的同時，提高用藥的安全性。

目前，甘草銀花炙草烏是吉林省某企業(yè)生產(chǎn)散結(jié)靈膠囊工藝中的傳統(tǒng)炮制方法，該炮制方法目前無國家標準，僅北京市中藥炮制規(guī)范收載，與吉林省炮炙方法的不同之處在于每100 kg草烏所需甘草與金銀花的用量，且與《中國藥典》2015年版收載的制草烏完全不同。本文按照吉林省中藥炮制規(guī)范項目（計劃編號：44）要求，迎合生產(chǎn)企業(yè)的發(fā)展需求，制訂甘草銀花炙草烏的炮制工藝及質(zhì)量控制標準，為保證藥品的質(zhì)量安全提供技術(shù)支持，為建立完善質(zhì)量控制標準提供依據(jù)。

2 實驗材料

2.1 儀器

可傾式蒸煮鍋（ZYG-0.7型）；熱風循環(huán)烘箱（RXH（ct-c-1）型）；直線往復式切藥機（WFQY-300型）；半自動點樣儀（Linnomat5型）；高效液相色譜儀（Agilent1260）。

2.2 試劑與試藥

新烏頭堿對照品（批號：110799-201608）；次烏頭堿（批號：110798-201609）；苯甲酰新烏頭原堿（批號：111795-201805）；苯甲酰烏頭原堿（批號：111794-201705）；苯甲酰次烏頭原堿（批號：111796-201705）；烏頭雙酯型生物堿提取物（112029-201601）（中國食品藥品檢定研究院）。

甲醇（色譜純），水為超純水，其他試劑均為分析純。硅膠G薄層板（青島海洋化工廠）；色譜柱：Hydrosphere C18（4.6×250 mm，5μm）。

3 方法與結(jié)果

3.1 甘草銀花炙草烏炮制工藝

參考目前的文獻報道[1-8]，草烏炮制旨在降低雙酯型生物堿的含量，因此，本文通過單因素水平試驗，對草烏浸泡時長和煎煮時長進行篩選，詳見表1。

表1 炮制工藝的篩選

具體試驗步驟：將草烏大小分開，清水浸泡至大者切開無干心，浸泡5 d、8 d；按照方案制備甘草金銀花水液；將浸泡好的草烏置于甘草金銀花水液中，煎煮1 h、2 h、3 h至大者切開斷面無白心，并及時補充水液，防止糊鍋底；晾至6~7成干，剪去地上莖，再將其剪成厚片，于60℃條件下干燥。

對不同試驗組樣品中雙酯型生物堿和單酯型生物堿的含量進行測定，試驗結(jié)果表明，當浸泡時長＜5 d時，炮制品中烏頭堿、新烏頭堿和次烏堿的含量依次為0.001 1%、0.032%和0.011%；而當浸泡時長為8 d時，可檢出烏頭堿，雙酯型生物堿總量明顯降低；進一步對甘草銀花水液的煎煮時長進行研究，結(jié)果顯示，煎煮1h，可檢出新烏頭堿和次烏頭堿，含量依次為0.005%、0.000 4%，烏頭堿未檢出；當繼續(xù)煎煮至3 h后，其苯甲酰新烏頭原堿開始水解，故煎煮2 h最佳。因此，最終確定草烏浸泡8 d，甘草銀花水液煎煮2 h，通過飲片生產(chǎn)企業(yè)中試驗證，共計9批樣品。

3.2 性狀

呈不規(guī)則的多角形、類圓形、近三角的厚片，表面呈褐灰褐色或黑褐色；切面觀，形成層環(huán)多呈多角形，可見點狀維管束，空隙明顯，邊緣多皺縮或彎曲；質(zhì)硬易碎；氣微，微辛辣，略有麻舌感。

3.3 顯微鑒別

通過對小試及9批驗證樣品的粉末性狀及顯微特征進行研究，發(fā)現(xiàn)本品粉末呈灰棕色，石細胞為無色或淡黃色；單個散在或數(shù)個成群，呈長圓形、長方形和梭形；胞腔較大，常內(nèi)含棕色物，壁不均勻增厚；紋孔呈短縫狀或“人”字狀，具層紋；后生皮層細胞為黃棕色至深棕色；類方形、長多角形或紡錘形，較大，壁厚不均一，微彎曲；導管多以網(wǎng)紋導管和具緣紋孔導管為主，見圖1。

3.4 薄層色譜

3.4.1 溶液的制備

取本品粉末約2 g，加入氨試液4 mL；充分潤濕藥材粉末，再加入二氯甲烷20 mL，充分混勻；低溫（＜25℃）超聲處理30 min；濾液減壓濃縮至干；加入二氯甲烷1 mL至殘渣中，使其溶解，作為供試品溶液。另取苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿和苯甲酰新烏頭原堿對照約10 mg，置于20 ml量瓶中，用二氯甲烷溶解并稀釋至刻度，作為混合對照品溶液。

3.4.2 TLC條件

按照薄層色譜法進行試驗，取上述混合對照品溶液和供試品溶液，點樣量為10μL，固定相為硅膠G，展開劑為正己烷-乙酸乙醋-甲醇（16∶9∶4），層析缸用氨蒸氣飽和20 min以上，上行展開，顯色劑為稀碘化秘鉀試液，結(jié)果見圖2。

3.5 檢查

3.5.1水分

取各批次甘草銀花炙草烏粉末2~3 g，平行試驗2次，精密稱定，采用烘干法（通則0832）測定，樣品水分結(jié)果見表2。

3.5.2 總灰分

取各批次的甘草銀花炙草烏粉末2~3 g，采用灰分測定法（通則2302），樣品總灰分結(jié)果見表2。

3.6 浸出物

按照浸出物測定法（《中國藥典》2015年版四部通則2201）中的浸出物測定方法，以稀乙醇為溶劑，采用熱浸法，測定結(jié)果見表2。

表2 水分、總灰分及浸出物試驗結(jié)果

3.7 生物堿的含量測定

3.7.1 色譜條件

以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙睛-四氫呋喃（4∶3）的混合溶液為流動相A，以7.7g·L-1乙酸酸銨溶液為流動相B，梯度洗脫：0~48 min，15%→26%（A）；48.0~48.1 min，26%→35%（A）；48.1~58.0 min，35%（A）；58~65 min，35%→15%（A）；檢測波長為235 nm。理論板數(shù)以苯甲酰新烏頭原堿色譜峰計算應≥5 000。

3.7.2 對照品溶液的制備

分別取苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿和苯甲酰新烏頭原堿對照品和烏頭雙酯型生物堿對照提取物適量，精密稱定，用異丙醇-三氯甲烷（1∶1）混合溶液溶解并稀釋制成每ml含2 mg的溶液，依次量取上述對照品溶液各1 mL、1 mL、7.5 mL和4 mL，置于100 mL量瓶中，用異丙醇-三氯甲烷（1∶1）混合溶液稀釋至刻度，制得每1 mL含苯甲酰烏頭原堿20μg、苯甲酰次烏頭原堿20μg、苯甲酰新烏頭原堿0.15 mg、烏頭雙酯型生物堿對照提取物80 μg的混合溶液，即得。

3.7.3 供試品溶液的制備

取本品粉碎，過3號篩；精密稱取2 g，置于錐形瓶中；加入氨試液3 mL，潤濕藥材粉末；加入異丙醇-乙酸乙酯（1∶1）混合溶液50 mL，混勻；密封并稱定重量；低溫（＜25℃）超聲處理30 min；放置至室溫，再稱定重量；用異丙醇-乙酸乙酯（1∶1）混合溶液補足減失的重量，搖勻，濾過；量取25 mL續(xù)濾液，減壓濃縮至干；殘渣精密加入異丙醇-三氯甲烷（1∶1）混合溶液3 mL溶解，即得。

3.7.4 專屬性試驗

空白溶劑為異丙醇-三氯甲烷（1∶1）的混合溶液，精密量取上述混合對照品溶液和供試品溶液各10μl，注入液相色譜儀中，記錄色譜圖。結(jié)果顯示，各色譜峰形良好，且與相鄰峰分離度均＞1.5，見色譜圖3。

3.7.5線性試驗

精密稱取苯甲酰新烏頭原堿對照品20 mg，置于10 ml量瓶中，用異丙醇-三氯甲烷（1∶1）混合溶液使溶解并稀釋刻度，再取“3.7.2”中的苯甲酰烏頭原堿對照品、苯甲酰次烏頭原堿對照品及烏頭雙酯型生物堿對照提取物（20 mg→10 ml）溶液，作為標準品儲備液，精密取標準儲備適量，適當稀釋得系列標準混合溶液，見表3。

表3 線性試驗各生物堿成分濃度

按照“3.7.1”中的色譜條件進行測定，記錄色譜圖，以峰面積（Y）為縱坐標，各對照品質(zhì)量濃度（X，μg/mL）為橫坐標，得線性回歸方程，苯甲酰烏頭原堿線性方程為Y=11.65X+2.405，相關(guān)系數(shù)為0.998，線性范圍為0~19.98μg/mL；苯甲酰次烏頭原堿線性方程為Y=12.41X－0.186，相關(guān)系數(shù)為0.999，線性范圍為0~17.22μg/mL；苯甲酰新烏頭原堿線性方程為Y=13.04X+9.286，相關(guān)系數(shù)為0.999，線性范圍為0~134.18μg/mL；新烏頭堿線性方程為Y=11.69X－1.375，相關(guān)系數(shù)為0.998，線性范圍為0~24.46μg/mL；次烏頭堿線性方程為Y=12.15X+1.784，相關(guān)系數(shù)為0.999，線性范圍為0~23.15μg/mL；烏頭堿線性方程為Y=11.71X+1.129，相關(guān)系數(shù)為0.998，線性范圍為0~24.51μg/mL；各生物堿類成分線性良好。

3.7.6 重復性試驗

取同一批樣品 （批號：20190503）6份，按照“3.7.1”和“3.7.2”中的條件進行測定，結(jié)果顯示，苯甲酰新烏頭堿的含量為0.41 mg/g（RSD=2.5%）；苯甲酰次烏頭堿的含量為0.03 mg/g（RSD=4.1%）；苯甲酰烏頭原堿的含量為0.03 mg/g（RSD=3.4%）；新烏頭堿的含量為0.01 mg/g（RSD=3.5%）；次烏頭堿的含量為0.02 mg/g（RSD=3.6%）；未檢出烏頭堿。

3.7.7 穩(wěn)定性試驗

取同一批樣品（批號：20190503），按照供試品溶液的制備方法，制備穩(wěn)定性溶液，分別放置0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、12 h，按照“3.7.1”中的色譜條件進行分析，苯甲酰新烏頭原堿在12 h內(nèi)的RSD=1.9%，樣品穩(wěn)定性良好；苯甲烏頭原堿在6 h內(nèi)峰面積變化不明顯，6 h后峰面積開始下降；苯甲酰次烏頭原堿在2 h內(nèi)穩(wěn)定，2 h后峰面積逐漸呈下降趨勢。雙酯型生物堿各成分穩(wěn)定性欠佳，樣品處理后應及時測定。

3.7.8 加樣回收率試驗

取樣品（批號：20190503）粉末（過3號篩）約2g，精密稱定，共計處理9份，取線性試驗中的各標準儲備液，按1∶0.5、1∶1、1∶1.5的比例加入各標準儲備液，分別置于具塞錐形瓶中，按照“3.7.3”中的方法進行處理，按上述色譜條件進行分析，計算回收率（n=9）。結(jié)果顯示，苯甲酰新烏頭堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿、烏頭堿的回收率分別為98.3%、101.0%、100.7%、89.3%、100.7%、95.0%。

3.7.9 樣品測定

取甘草銀花炙草烏樣品，按照擬定的方法測定，測定結(jié)果見表4。

表4 樣品測定結(jié)果

4 討論

4.1 生產(chǎn)工藝的研究

本文通過單因素水平試驗，對草烏的浸泡時長和煎煮時間進行篩選，確定了最佳生產(chǎn)工藝，并通過生產(chǎn)工藝驗證，證明該工藝參數(shù)合理，生產(chǎn)工藝穩(wěn)定，連續(xù)生產(chǎn)的9批樣品，性狀基本一致，質(zhì)量均一穩(wěn)定，確認該 工藝具有重現(xiàn)性及可靠性。

4.2 鑒別

本文通過對比草烏炮制前后的顯微特征[9]，建議將導管、石細胞及后生皮層細胞的顯微特征列入標準，而對其不易觀察的淀粉粒不列入標準；薄層色譜鑒別，本文通過試驗證明，甘草銀花水液中均可檢出甘草酸銨和綠原酸成分[10]，但是在甘草銀花炙草烏樣品中，同條件下很難檢測到甘草和金銀花中成分，可能與工藝中甘草和金銀花的用量相關(guān)。因此，本文對雙酯型生物堿類成分進行了充分研究，分別進行了點樣量、環(huán)境的溫度和濕度、不同廠家的薄層板進行了考察，研究結(jié)果表明當供試品溶液點樣量至少為10μL時，方可檢出含量較低的苯甲酰次烏頭原堿和苯甲酰烏頭原堿，故確定供試品溶液的點樣量為10μL；溫濕度的改變對薄層展開效果影響不大，各成分斑點均清晰分離，斑點Rf值適宜；不同生產(chǎn)廠家的薄層板的展開效果無明顯差異，斑點清晰，分離效果好，表明所建立的薄層色譜方法耐用性好。

4.3 生物堿含量測定

本文參考文獻[11-15]及2015年版《中國藥典》[16]對供試品溶液的制備方法進行了篩選，異丙醇而增加了提取溶劑與流動相的兼容性；在超聲處理過程中，當溫度升高時，試劑揮發(fā)嚴重，不利于生物堿的提取，因此在制備供試品的過程中應嚴格控制超聲時的溫度。在建立含量測定方法的過程中，分別考察3款不同的色譜柱，試驗結(jié)果表明其耐用性良好，在該色譜條件下，各色譜峰的分離度均滿足檢查要求。研究中9批樣品單酯型生物堿的含量范圍為0.32 mg/g～0.51 mg/g，雙酯型生物堿的含量范圍為0.001 mg/g～0.031mg/g，可見甘草銀花炙草烏的傳統(tǒng)炮制方法能明顯的降低其毒性成分，確保用藥安全。