陳玉珍 胡翮 何碩 郭沛 趙子冰

（湘潭市食品藥品檢驗(yàn)所 湖南湘潭 411100）

1 前言

桶裝水的微生物污染是影響桶裝水安全生產(chǎn)的潛在隱患[1]，雖然桶裝水在潔凈環(huán)境中進(jìn)行生產(chǎn)，但是在設(shè)備維護(hù)和原材料運(yùn)輸?shù)倪^程中，會(huì)不可避免地?cái)y帶部分塵埃和微生物。有研究表明，操作人員攜帶的塵埃和微生物是潔凈環(huán)境最大的污染源。一般情況下，成年人在活動(dòng)中會(huì)源源不斷地向周圍排放含菌粒子，按每分鐘計(jì)算，女性一般在750個(gè)以上，男性則能達(dá)到1 000個(gè)以上[2]。人體在著裝整齊的靜止?fàn)顟B(tài)時(shí)，每分鐘的發(fā)菌量為10~300個(gè)；處于運(yùn)動(dòng)狀態(tài)時(shí)，每分鐘的發(fā)菌量為為900~2 500個(gè)；在打噴嚏或忽然咳嗽時(shí)，發(fā)菌量為70~700個(gè)。通常情況下，水廠中的操作人員可以說是潔凈區(qū)最大的潛在污染源[3-4]。

銅綠假單胞菌（Pseudomonas Aeruginosa）是一種條件致病菌，常見的有水源性和食源性2種，其廣泛存在于各種水體中。在含水量較高的食品中也可以存活，并且對(duì)不良環(huán)境因子和物理化因子具有較強(qiáng)的抵抗力，如空氣干燥、消毒劑、紫外線等[5]。銅綠假單胞菌能夠?qū)е氯祟惓霈F(xiàn)皮膚炎癥、敗血癥、腦膜炎和多種急性腸道炎癥。其在水、土壤、空氣中廣泛存在，甚至在人和動(dòng)物的皮膚和腸道中也存在，還能產(chǎn)生多種致病因子，如粘附素、內(nèi)毒素和外毒素，能夠直接影響人體健康[6]。

桶裝水是指采用現(xiàn)代新型工藝技術(shù)，將地下水或自來水進(jìn)行加工得到的礦泉水或純凈水。隨著近年來我國(guó)經(jīng)濟(jì)的不斷發(fā)展，包裝飲用水受到更多消費(fèi)者的青睞，但近年來國(guó)內(nèi)外有關(guān)銅綠假單胞菌污染飲用水的報(bào)道越來越多[7]。2019年1月的《消費(fèi)者報(bào)道》顯示，2014—2018年，國(guó)家市場(chǎng)監(jiān)督管理總局和各省級(jí)市場(chǎng)監(jiān)督管理局對(duì)市售桶裝水進(jìn)行抽檢，檢出不合格批次2 350批，其中銅綠假單胞菌的檢出批次為1 551批，占比高達(dá)60.8%[8]。

目前，國(guó)內(nèi)關(guān)于包裝飲用水的研究相對(duì)較少，其中純凈水和其他飲用水中關(guān)于銅綠假單胞菌污染的文獻(xiàn)研究極少，且對(duì)于污染源沒有深入探究，尤其缺乏對(duì)其生產(chǎn)過程中，不同階段的水樣、成品及生產(chǎn)環(huán)境樣品等污染的系統(tǒng)性調(diào)查與分析[9]。本文選擇湖南省湘潭市內(nèi)曾檢出銅綠假單胞菌的10家成品水生產(chǎn)企業(yè)，采集109份水樣，監(jiān)測(cè)桶裝水生產(chǎn)過程中各個(gè)環(huán)節(jié)的污染情況，以便為包裝飲用水生產(chǎn)企業(yè)和食品安全監(jiān)管部門防控銅綠假單胞菌污染提供依據(jù)。

2 材料與方法

2.1 樣品

選取湘潭市10家曾檢出銅綠假單胞菌的包裝飲用水生產(chǎn)企業(yè)，在包裝飲用水生產(chǎn)的各個(gè)階段（水源、粗濾、臭氧處理、精濾）采集水樣，并從包裝容器、生產(chǎn)環(huán)境、操作人員體表采集樣品，共計(jì)109份。

2.2 試劑

CN瓊脂（批號(hào)：191101）；乙酰胺液體培養(yǎng)基（批號(hào)：190520）；金氏B培養(yǎng)基（批號(hào)：200612）；綠膿菌素測(cè)定培養(yǎng)基（批號(hào)：200729）；營(yíng)養(yǎng)瓊脂（批號(hào)：190321）；鈉氏試劑（批號(hào)：6106236）（北京陸橋技術(shù)股份有限公司）。所有試劑均在有效期內(nèi)使用。

2.3 方法

按照GB 8538-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 飲用天然礦泉水檢驗(yàn)方法》，量取250 mL水樣，采用0.45 μm孔徑的濾膜進(jìn)行過濾；使用鑷子將濾膜轉(zhuǎn)移至CN瓊脂培養(yǎng)基上，置于培養(yǎng)箱中，36℃培養(yǎng)48 h。CN瓊脂平板屬于選擇性培養(yǎng)基，典型菌落能夠在其上生長(zhǎng)繁殖，并伴有綠膿菌素的產(chǎn)生。也可以在選擇性培養(yǎng)基溴化十六烷基三甲銨上生長(zhǎng)，使氧化酶呈陽性，采用360 nm的紫外光進(jìn)行照射，能夠看到明顯的熒光。乙酰胺產(chǎn)氨試驗(yàn)的革蘭氏陰性桿菌，無芽孢，經(jīng)過試驗(yàn)證明為銅綠假單胞菌，則桶裝水檢測(cè)結(jié)果為陽性[10]。依據(jù)GB4789.2-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測(cè)定》[11]、GB4789.3-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 大腸菌群計(jì)數(shù)》進(jìn)行測(cè)定[12]。

2.4 生化鑒定及測(cè)序

采用革蘭氏染色鏡檢法，對(duì)桶裝水生產(chǎn)各個(gè)環(huán)節(jié)的樣品，在CN瓊脂平板及PCA瓊脂平板上獲取的環(huán)境菌的新鮮培養(yǎng)物進(jìn)行革蘭氏陰陽性菌的鑒定；根據(jù)結(jié)果選擇GN、GC、BCL鑒定卡，并采用Vitek2 Compact鑒定系統(tǒng)進(jìn)行鑒定；之后采用3500 MicroSeq系統(tǒng)配套試劑，對(duì)120株細(xì)菌及6株霉菌分別對(duì)其進(jìn)行細(xì)菌16S rDNA和霉菌LSU rDNA測(cè)序鑒定[13]；并對(duì)120株細(xì)菌及6株霉菌的TSA瓊脂平板培養(yǎng)物分別進(jìn)行DNA提取、PCR擴(kuò)增和純化、標(biāo)記反應(yīng)、標(biāo)記反應(yīng)純化；最后進(jìn)行毛細(xì)血管電泳測(cè)序。

3 結(jié)果

3.1 銅綠假單胞菌檢出情況

在桶裝水生產(chǎn)企業(yè)共收集水樣87份，其中，銅綠假單胞菌的檢出率為39.1%，檢出水樣34份。其中，活性炭過濾后水樣的檢出率為80%；精濾后水樣的檢出率為60%；石英砂過濾后水樣的檢出率為50%；水源水、臭氧殺菌后水樣和成品水樣的檢出率均為40%；包裝容器樣品（清洗前）的檢出率為30%，詳見表1。

表1 包裝飲用水生產(chǎn)各個(gè)環(huán)節(jié)銅綠假單胞檢出情況（cfu/250ml）

3.2 菌株來源統(tǒng)計(jì)

本文試驗(yàn)共分離菌株126株，包括120株細(xì)菌和6株霉菌。其中，大部分菌株的來源為：水樣（78株），占全部分離菌株的61.9%；環(huán)境沉降微生物（18株），占全部分離菌株的14.3%；環(huán)境浮游微生物（13株），占全部分離菌株的10.3%；設(shè)備和材料表面微生物（11株），占全部分離菌株的6.9%。所有霉菌均來源于沉降菌的收集。

3.3 測(cè)序結(jié)果分析

結(jié)合測(cè)序和Vitek2鑒定的結(jié)果可知，葡萄球菌屬最多，占全部分離菌株的24.6%；少動(dòng)鞘氨醇桿菌占19.8%；銅綠假單胞菌15.1%；大腸埃希氏菌10.3%。環(huán)境沉降菌和空氣浮游菌共收集到31株微生物，占污染微生物總數(shù)的24.6%。占比最高的是表皮葡萄球菌、沃氏葡萄球菌、溶血葡萄球菌、馬尾葡萄球菌等常見的環(huán)境菌，詳見表2。

4 討論

近年來，桶裝水中銅綠假單胞菌的檢出率總體呈下降趨勢(shì)，但是經(jīng)現(xiàn)場(chǎng)調(diào)研發(fā)現(xiàn)，這些容易受到銅綠假單胞菌污染的生產(chǎn)企業(yè)，都存在規(guī)模較小、工藝控制不嚴(yán)格、車間衛(wèi)生差、自動(dòng)化程度低、功能區(qū)劃分不明顯、清洗消毒不及時(shí)、交叉污染等情況[14]。桶裝水的生產(chǎn)過程一般包括以下環(huán)節(jié)：粗濾、精濾、去離子化、反滲透或其他膜、過濾殺菌或除菌[15]。

從10家桶裝水生產(chǎn)企業(yè)各個(gè)生產(chǎn)環(huán)節(jié)取得水樣，對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)分離發(fā)現(xiàn)，活性炭過濾后水樣的銅綠假單胞菌檢出率高達(dá)80%、精濾后水樣為60%、石英砂過濾后水樣為為50%，檢出率都比水源水的檢出率高，說明部分企業(yè)的過濾裝置清理更換不及時(shí)，使銅綠假單胞菌的檢出率升高。因此，應(yīng)該定期采取措施保證濾膜的質(zhì)量，如更換濾膜、更換濾料、定期反沖洗和清洗[16]。同時(shí)，大部分桶裝水生產(chǎn)企業(yè)存在回收桶，回收桶在運(yùn)輸和使用的過程中，容易受到微生物的污染，因此，企業(yè)應(yīng)保證回收桶的驗(yàn)收、消毒，清洗過程符合GB 19298《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)包裝飲用水》中的要求[17]。

銅綠假單胞菌在淡水和土壤中較為常見，在自然界廣泛存在。通過檢測(cè)結(jié)果和現(xiàn)場(chǎng)考察，本文發(fā)現(xiàn)在生產(chǎn)條件相同的情況下，微生物在桶裝水中的數(shù)量會(huì)隨著季節(jié)的變化而變化，尤其是銅綠假單胞菌，其適宜生長(zhǎng)溫度在25℃~42℃，抽檢結(jié)果表明，在夏季和秋季，桶裝水中銅綠假單胞菌的檢出率較高，需要加強(qiáng)防范，控制風(fēng)險(xiǎn)[18]。

根據(jù)測(cè)序和Vitek2鑒定結(jié)果可知，本文采樣分離共得到126株分離菌株，其中120株細(xì)菌，6株霉菌。120株細(xì)菌的大部分菌株來源于水樣（78株），6株霉菌均來源于沉降菌收集。銅綠假單胞菌在水樣菌株中占比最高，其次是少動(dòng)鞘氨醇桿菌，大腸埃希氏菌，泛菌屬等；剩余菌株中，葡萄球菌占比最高（31株），占總分離菌株的24.6%，主要從生產(chǎn)環(huán)境和操作人員體表樣品中分離得到，說明桶裝水的生產(chǎn)車間并未做到無菌生產(chǎn)，存在車間消毒不嚴(yán)格、操作人員著裝不夠整潔等原因[19-20]。

綜上所述，對(duì)于桶裝水生產(chǎn)過程中的微生物控制應(yīng)重點(diǎn)關(guān)注4個(gè)方面：水源關(guān)鍵點(diǎn)、過濾環(huán)節(jié)及成品水的儲(chǔ)存；灌裝車間污染；回收桶等設(shè)備污染；工作人員自身攜帶原因[21]。

建議監(jiān)管部門加強(qiáng)對(duì)桶裝水生產(chǎn)企業(yè)的監(jiān)管，生產(chǎn)企業(yè)應(yīng)當(dāng)嚴(yán)格按照GB 19304《包裝飲用水生產(chǎn)衛(wèi)生規(guī)范》中的要求，加強(qiáng)對(duì)源頭水的衛(wèi)生監(jiān)督與防護(hù)；同時(shí)要加強(qiáng)對(duì)生產(chǎn)環(huán)境的清潔和對(duì)設(shè)備的維護(hù)，建立消毒劑濃度實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)系統(tǒng)，既能進(jìn)行有效監(jiān)控，又能保證消毒質(zhì)量[22]。水源、制水過程使用的活性炭、濾膜的更換頻次、滅菌的方式、消毒劑的濃度和消毒時(shí)間、生產(chǎn)記錄、生產(chǎn)人員的健康檢查等，都是質(zhì)量安全控制的重要環(huán)節(jié)[23]。