魏月娟

滄州中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，河北 滄州 061000

強(qiáng)心湯是滄州中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院心內(nèi)科治療慢性心力衰竭的經(jīng)驗(yàn)方，源于真武湯，由附子、補(bǔ)骨脂、淫羊藿、豬苓、茯苓等藥物組成，臨床治療效果已被證實(shí)，但作用機(jī)制尚不明確。血清鈣調(diào)磷酸酶（calcineurin，CaN）是一種受Ca2+及鈣調(diào)素（calmodulin，CaM）調(diào)節(jié)的多功能信號(hào)酶。CaN的活化能夠使心肌活化T細(xì)胞核因子（nuclear factor activated T3，NFAT3）脫磷酸化，脫磷酸化的NFAT3能夠與心肌細(xì)胞核內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子相互作用，活化心肌肥大的相關(guān)基因，如調(diào)節(jié)心臟中腦利尿鈉肽（brain natriuretic peptide，BNP）、心房利尿鈉肽（atrial natriuretic peptide，ANP）、β-肌球蛋白重鏈（β-myosin heavy chain，β-MHC）等肥大基因特異性表達(dá)，導(dǎo)致心肌細(xì)胞蛋白核酸合成增加，進(jìn)而出現(xiàn)心肌肥厚、心腔擴(kuò)大、心室重構(gòu)等病理過(guò)程［1］。研究［2］顯示，CaN-NFAT3的持續(xù)激活可導(dǎo)致心肌嚴(yán)重肥大并迅速進(jìn)展為心力衰竭或死亡。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選擇正常清潔級(jí)雄性SD大鼠64只，每只體質(zhì)量約200 g，購(gòu)自上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)：SYXK（滬）2006-001：0069937。飼養(yǎng)條件：觀察室溫度23～25℃，濕度50%～70%，光照12 h，黑暗12 h。

1.2 試藥及儀器強(qiáng)心湯，藥物組成：黃芪20 g，川芎10 g，桃仁10 g，紅花10 g，甘草10 g，熟附子3 g，豬苓15 g，茯苓15 g，白術(shù)20 g，白芍15 g，鹿角9 g，骨碎補(bǔ)15 g，由滄州中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院中藥房完成制劑；纈沙坦膠囊（北京諾華制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H20040217，批號(hào)：X1066，規(guī)格：號(hào)：80 mg/粒）。PCR試劑盒Thermo（F-415xl，批K1622）；cDNA合成試劑盒（MBI公司）；改良的小動(dòng)物呼吸機(jī)（奧爾科特科技生物有限公司）；MLT1050/D型高精度壓力換能器（澳大利亞ADI公司）。PowerLab/4SP型生物信號(hào)處理分析系統(tǒng)；Chart v 5.0記錄和分析軟件。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 試藥制備 藥物劑量按大鼠與人體表面積轉(zhuǎn)換系數(shù)計(jì)算，纈沙坦膠囊制成1.6 mg/mL濃度的纈沙坦懸濁液，強(qiáng)心湯制成含生藥濃度2.56 g/mL的制劑。

1.3.2 分組及造模［3］將64只SD雄性大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后備術(shù)，隨機(jī)分為對(duì)照組10只，模型組、纈沙坦組、強(qiáng)心湯組各18只，除對(duì)照組大鼠行假手術(shù)外，其余各組制備慢性心衰大鼠模型，具體方法為：參照《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》［4］采用結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈結(jié)扎法制備慢性心衰大鼠模型，喂養(yǎng)SD雄性大鼠1周備術(shù)，術(shù)前1天禁食不禁水，用氯胺酮行腹腔麻醉，固定大鼠，于手術(shù)部位脫毛，經(jīng)口氣管插管，連接呼吸機(jī)和心電監(jiān)護(hù)。沿左前第3、4肋間切開(kāi)皮膚，長(zhǎng)1.5 cm左右，逐層分離，打開(kāi)胸腔，暴露心臟，在左心耳下2～3 mm處，用絲線穿過(guò)左冠狀動(dòng)脈前降支進(jìn)行結(jié)扎，結(jié)扎后左室壁的顏色變白，同時(shí)會(huì)出現(xiàn)室壁運(yùn)動(dòng)減弱，心電監(jiān)護(hù)顯示Ⅱ?qū)?lián)R波振幅明顯升高，隨后ST段亦明顯抬高，證實(shí)造模成功。待穩(wěn)定后，關(guān)閉胸腔并逐層縫合。對(duì)照組大鼠穿線后不行結(jié)扎術(shù)。所有大鼠術(shù)后均連續(xù)抗感染治療3天。

1.3.3 給藥方法 術(shù)后8周開(kāi)始灌胃給藥治療，模型組和對(duì)照組予蒸餾水灌胃；纈沙坦組予纈沙坦懸濁液灌胃，給藥劑量為8 mg/kg；強(qiáng)心湯組予強(qiáng)心湯水溶液灌胃，給藥劑量為0.9 g/kg。連續(xù)給藥4周，每天給藥1次。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 血流動(dòng)力學(xué)測(cè)定［5］灌胃治療4周后，采用PowerLab/4SP生物信號(hào)處理分析系統(tǒng)測(cè)定大鼠血流動(dòng)力學(xué)，術(shù)前禁食不禁水，稱體質(zhì)量后先用肝素鈉（1200 u/kg）抗凝30 min，用3%戊巴比妥鈉（35 mg/kg）行腹腔麻醉。將大鼠仰臥固定在手術(shù)臺(tái)上，切開(kāi)其頸部皮膚，找到右側(cè)頸動(dòng)脈，分離頸動(dòng)脈和神經(jīng)，結(jié)扎動(dòng)脈遠(yuǎn)心端，在近心端插入PE-50型聚乙烯心導(dǎo)管，通過(guò)PowerLab生物信號(hào)處理和分析系統(tǒng)記錄血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)；當(dāng)心導(dǎo)管在頸總動(dòng)脈中時(shí)觀測(cè)心率，心率穩(wěn)定后，將心導(dǎo)管推入左心室，再待心率穩(wěn)定后，記錄大鼠左心室收縮壓（left ventricular systolic pressure，LVSP）、左室舒張末壓（left ventricular end-diastolic pressure，LVEDP）、左室壓力上升和下降變化最大速度的參數(shù)值（±LVdp/dtmax）。

1.4.2 血漿AngⅡ、血清CaN、心肌NFAT3蛋白表達(dá)水平測(cè)定1）在完成血流動(dòng)力學(xué)測(cè)定后，采集腹主動(dòng)脈血，將抽取的血液分成兩部分，一部分置于抗凝管內(nèi)，用來(lái)分離血漿；另一部分置于普通EP管內(nèi)，用來(lái)分離血清。采用酶聯(lián)法（enzymelinked immunosorbent assay，ELISA）分別測(cè)定血漿血管緊張素Ⅱ（plasma angiotensinⅡ，AngⅡ）含量、大鼠鈣調(diào)磷酸酶（calcineurin，CaN）的含量，步驟按照試劑盒使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。2）提取心肌組織，采用Western blot法測(cè)定NFAT3蛋白表達(dá)量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法使用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以±s表示，采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料以率表示，采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血流動(dòng)力學(xué)與模型組比較，纈沙坦組、強(qiáng)心湯組LVEDP水平降低（P＜0.05），纈沙坦組+LVdp/dtmax、-LVdp/dtmax水平降低（P＜0.01），強(qiáng)心湯組LVSP、+LVdp/dtmax及-LVdp/dtmax水平均升高（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠左室血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)比較（±s）

表1 各組大鼠左室血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)比較（±s）

注：1 mm Hg≈0.133 kPa；與對(duì)照組比較，*表示P＜0.01；與模型組比較，◆表示P＜0.05，◆◆表示P＜0.01

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2.2 血漿AngⅡ、血清CaN、心肌NFAT3蛋白表達(dá)水平與對(duì)照組比較，模型組大鼠血漿血漿AngⅡ、血清CaN、心肌NFAT3蛋白表達(dá)水平均明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，強(qiáng)心湯組、纈沙坦組大鼠血漿AngⅡ、血清CaN、心肌NFAT3蛋白表達(dá)水平均明顯下降（P＜0.01），且強(qiáng)心湯組中上述指標(biāo)下調(diào)程度均大于纈沙坦組（P＜0.01）。見(jiàn)表2 。

表2 各組大鼠血漿AngⅡ、血清CaN、心肌NFAT3蛋白表達(dá)水平比較（±s）

表2 各組大鼠血漿AngⅡ、血清CaN、心肌NFAT3蛋白表達(dá)水平比較（±s）

注：與對(duì)照組比較，*表示P＜0.01；與模型組比較，◆表示P＜0.05，◆◆表示P＜0.01

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3 討論

心肌重構(gòu)是慢性心衰發(fā)生、發(fā)展的基本病理病機(jī)，當(dāng)各種原因?qū)е录?xì)胞內(nèi)鈣離子濃度升高時(shí)，能夠激活鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶-活化的T細(xì)胞核因子（calcineurin-nuclear factor activated T，CaNNFAT）信號(hào)通路，該通路的活化是心室重構(gòu)最重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之一［6］。

心力衰竭屬于中醫(yī)學(xué)“喘證”“水腫”等范疇，病機(jī)常為心腎為本，五臟相因，水飲瘀血，相兼為患。中醫(yī)治療慢性心力衰竭的原則中，多采用溫腎利水、補(bǔ)氣活血之法［7-8］。強(qiáng)心湯組方中附子能補(bǔ)火助陽(yáng)，溫腎通脈，黃芪補(bǔ)氣利水，兩藥相伍，共為君藥；鹿角片、豬苓、茯苓、白術(shù)、骨碎補(bǔ)共為臣藥，有健脾滲濕，利水消腫，溫腎助陽(yáng)之效，既能使?jié)駨男”愣?，減輕心臟前負(fù)荷，又可以輔助君藥增強(qiáng)溫腎功能；川芎、桃仁、紅花行氣活血化瘀為佐藥；白芍與甘草共為使藥。全方通補(bǔ)并施，共奏溫腎助陽(yáng)、化氣利水、活血化瘀之效。

CaN由一個(gè)催化亞基（CnA）和一個(gè)調(diào)節(jié)亞基（CnB）組成，可以受Ca2+及鈣調(diào)素（calmodulin，CaM）的調(diào)節(jié)。其中，CnA分為4個(gè)不同的結(jié)構(gòu)域，包括催化域、CnB結(jié)合域、CaM結(jié)合域及自身抑制域。CnB和CaM上均有4個(gè)Ca2+結(jié)合點(diǎn)位，Ca2+/CaM與CaN結(jié)合后，可以使CaN的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，活化CaN［9］。可見(jiàn)，CaN為Ca2+下游因子，其蛋白表達(dá)水平的改變要早于心肌重構(gòu)的發(fā)生［10］，活化的T細(xì)胞核因子（nuclear factor Activated T，NFAT）為CaN的下游因子，在其介導(dǎo)的心肌重構(gòu)中發(fā)揮著重要作用，對(duì)心肌肥大、心肌細(xì)胞凋亡均有一定的調(diào)節(jié)作用［11］?？傊?，Ca2+-CaN-NFAT信號(hào)通路能夠誘導(dǎo)多種與心肌肥大相關(guān)的基因表達(dá)，最終導(dǎo)致心肌重構(gòu)，發(fā)展為心衰。眾多實(shí)驗(yàn)表明RAS系統(tǒng)中的效應(yīng)分子AngⅡ與心臟擴(kuò)大參數(shù)、心肌肥厚參數(shù)呈正相關(guān)［12］。有研究顯示，CaN的蛋白表達(dá)及其酶的活性與AngⅡ水平有著密切關(guān)系［13］；而ARB類藥物如替米沙坦能夠下調(diào)CaN和NFAT3的蛋白表達(dá)及CaN酶活性，其作用機(jī)制是通過(guò)抑制AngⅡ激活下游的心肌肥大信號(hào)從而影響CaN的活性及表達(dá)，最終減少NFAT3的表達(dá)［14-15］。

本研究結(jié)果顯示，強(qiáng)心湯組、纈沙坦組大鼠血漿CaN活性、AngⅡ含量、NFAT3的蛋白質(zhì)表達(dá)量下降，其中，強(qiáng)心湯組下調(diào)水平優(yōu)于纈沙坦組，其治療慢性心衰的作用機(jī)制可能與抑制CaN-NFAT3信號(hào)通路有關(guān)。