周 浩，王慧潔，趙媛媛，王 歡，張士博

（正大天晴藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司，南京 211100）

藥品中的水分包括結(jié)晶水和吸附水，水分含量對(duì)藥品的合成、理化性質(zhì)、制劑工藝、儲(chǔ)藏條件和療效均有影響，控制藥品的水分可預(yù)防藥品吸潮、霉變、水解、氧化等［1］334。在化學(xué)藥的合成過(guò)程中，反應(yīng)體系的水分控制對(duì)反應(yīng)結(jié)果和產(chǎn)品質(zhì)量的影響至關(guān)重要［2］。由于化學(xué)結(jié)構(gòu)和晶型的特殊性，一些原料藥的穩(wěn)定性受水分影響較大，在生產(chǎn)和制備過(guò)程中需控制環(huán)境濕度并盡量避免水分的影響。鮑興嘉等［3］通過(guò)引濕性試驗(yàn)、影響因素試驗(yàn)和長(zhǎng)期/加速穩(wěn)定性試驗(yàn)研究了濕度對(duì)達(dá)比加群酯甲磺酸鹽無(wú)定形轉(zhuǎn)晶的影響。很多藥用輔料及原料藥均含有結(jié)晶水，結(jié)晶水的比例直接影響藥品的理化性質(zhì)、溶出和藥效等，測(cè)定結(jié)晶水的含量對(duì)化學(xué)藥的結(jié)構(gòu)確證和晶型表征有重要作用。水分對(duì)青霉素類抗生素的穩(wěn)定性影響也很大，含水量越高，青霉素越易降解，越易失效。國(guó)內(nèi)外藥典對(duì)幾種常用青霉素類抗生素含水量均作出規(guī)定：《歐洲藥典》青霉素鈉干燥失重限度為1. 0%、青霉素V鉀及苯氧甲基青霉素水分限度分別為1. 0%、0. 5%［4］1958-3534；《中華人民共和國(guó)藥典》青霉素V 鉀水分限度為1. 5%、青霉素鈉及其注射劑干燥失重限度分別為0. 5%、1. 0%［5］730-737。因此，在藥物研發(fā)階段，需開(kāi)發(fā)可靠的水分測(cè)試方法對(duì)起始物料、中間體、原料藥和制劑產(chǎn)品進(jìn)行水分檢查并結(jié)合藥品自身特點(diǎn)、生產(chǎn)工藝、包裝形式、儲(chǔ)存和使用方式制訂合理的限度，以保證藥品質(zhì)量。

由表1 和表2 可知，藥典收載的水分測(cè)試方法可以歸納為4類，即費(fèi)休氏法、重量分析法（包括常壓干燥法、減壓干燥法和熱重分析法）、甲苯法和氣相色譜法，各通則均對(duì)方法測(cè)試原理、試液、溶劑、方法適用性、供試品含水量和取樣量等進(jìn)行了詳細(xì)闡述。與其他方法相比，費(fèi)休氏法是唯一基于化學(xué)定量反應(yīng)的水分測(cè)試方法，具有專屬性強(qiáng)、重復(fù)性好、準(zhǔn)確度高和適用范圍廣等優(yōu)點(diǎn)，是國(guó)際上通用的水分測(cè)試方法。雖然費(fèi)休氏法水分測(cè)試方法有諸多優(yōu)點(diǎn)，但應(yīng)用此法進(jìn)行藥品水分測(cè)試依舊存在很多問(wèn)題。這些問(wèn)題主要包括：（1）反應(yīng)性問(wèn)題；（2）溶解度問(wèn)題；（3）供試品處理問(wèn)題。針對(duì)以上問(wèn)題，本文重點(diǎn)介紹費(fèi)休氏法，并結(jié)合供試品的理化性質(zhì)和藥典實(shí)例總結(jié)藥品水分測(cè)試方法的選擇與研究思路。

表1 各國(guó)藥典收載的水分測(cè)試方法

表2 各種水分測(cè)試方法對(duì)比[1]334-343

1 費(fèi)休氏法水分測(cè)試方法

費(fèi)休氏法是Karl Fischer 在1935 年提出的水分測(cè)試方法，根據(jù)碘的來(lái)源，分為容量滴定法和庫(kù)侖滴定法，二者均以卡爾費(fèi)休氏反應(yīng)為基礎(chǔ)。本法是根據(jù)碘和二氧化硫在合適的醇和堿的存在下與水定量反應(yīng)來(lái)測(cè)定水分，碘和水的化學(xué)計(jì)量比為1∶1，反應(yīng)通式如下［1］334-335：

容量滴定法中，碘是作為滴定劑通過(guò)滴定管加入，從消耗碘的量可測(cè)定水分含量，計(jì)量原理為體積計(jì)量。庫(kù)侖滴定法中，碘是由含有碘離子的陽(yáng)極電解液電解產(chǎn)生，根據(jù)法拉第定律，產(chǎn)生碘的量與通過(guò)的電量成正比，從消耗的總電量可測(cè)定水分含量，計(jì)量原理為電量計(jì)量。

容量滴定法根據(jù)滴定方式分為直接滴定法和剩余滴定法（返滴定法）。根據(jù)供試品處理方法分為直接投樣法、外部溶解法、外部萃取法和卡式爐水分測(cè)定法。有大量文獻(xiàn)報(bào)道使用費(fèi)休氏法進(jìn)行藥品水分測(cè)試并對(duì)測(cè)試方法進(jìn)行了優(yōu)化和改進(jìn)［9-14］。因此，采用費(fèi)休氏法進(jìn)行水分測(cè)試時(shí)，需結(jié)合供試品特性、測(cè)試環(huán)境及水分含量選擇合理的供試品處理方法，以獲得準(zhǔn)確的測(cè)試結(jié)果。

1. 1 費(fèi)休氏法-直接投樣法

直接投樣法是最常用的測(cè)試方法，常用溶劑為無(wú)水甲醇，可添加合適的助溶劑進(jìn)行增溶，此法適用于溶解性好、無(wú)副反應(yīng)或采取合適的措施可抑制相關(guān)副反應(yīng)發(fā)生的供試品水分測(cè)試，各國(guó)藥典收錄的大部分品種均采用此法進(jìn)行水分檢查。

1. 2 費(fèi)休氏法-外部溶解法

外部溶解法采用無(wú)水甲醇或混合溶劑將供試品溶解后進(jìn)行水分測(cè)試，適用于水分含量不均勻、黏度大、稱量困難、水分釋放緩慢和吸水性極強(qiáng)的供試品水分測(cè)試。使用本法進(jìn)行水分測(cè)試時(shí)，空白溶劑的選擇至關(guān)重要，首先空白溶劑不與供試品和費(fèi)休氏試劑發(fā)生反應(yīng)，其次空白溶劑的含水量必須遠(yuǎn)小于供試品。應(yīng)用此法需關(guān)注環(huán)境溫濕度對(duì)測(cè)試結(jié)果的影響并做空白校正，各國(guó)藥典收錄的外部溶解法水分測(cè)試大部分采用庫(kù)侖滴定法。張才煜等［15］報(bào)道葉酸在甲醇中不溶，測(cè)定時(shí)水分釋放緩慢，測(cè)定時(shí)間較長(zhǎng)，《中華人民共和國(guó)藥典》收錄的葉酸水分測(cè)試方法為容量法外部溶解法，溶劑為三氯甲烷-無(wú)水甲醇（4∶1）的混合溶液［5］232。格列美脲在甲醇中極微溶解，《美國(guó)藥典》收錄的格列美脲用二甲基甲酰胺為溶劑，采用庫(kù)侖法外部溶解法進(jìn)行水分測(cè)試［16］。

1. 3 費(fèi)休氏法-外部萃取法

外部萃取法是通過(guò)無(wú)水甲醇或混合溶劑將供試品中的水分萃取出來(lái)，適用于溶解性較差、水分分布不均勻和輔料有干擾的供試品水分測(cè)試。本法對(duì)空白溶劑及溫濕度的要求同外部溶解法，推薦使用庫(kù)侖滴定法測(cè)試。富馬酸喹硫平在甲醇中微溶，《日本藥典》收錄其水分測(cè)試用甲醇4 mL 溶解供試品約0. 1 g，劇烈振搖1 min，2 000 r/min 離心5 min，精密量取上清液1 mL 用庫(kù)侖滴定法測(cè)試，同法制備空白溶液并校正［8］1493。固體制劑由于輔料眾多，直接投樣很難保證完全溶解且不發(fā)生副反應(yīng)，外部萃取法是其最合適的水分測(cè)試方法。例如《美國(guó)藥典》收錄的奧比沙星片水分測(cè)試：取供試品5 片，置50 mL 離心管中，精密加入無(wú)水甲醇25 mL 并密封，振搖16 h，離心，取一定體積的上清液（含水量約為1 000 ~ 1 500 μg）用庫(kù)侖滴定法測(cè)試，并做空白校正［17］。

1. 4 費(fèi)休氏法-剩余滴定法（返滴定法）

剩余滴定法通過(guò)向供試品中加入過(guò)量已標(biāo)定的費(fèi)休氏滴定液，利用已標(biāo)定的水-甲醇標(biāo)準(zhǔn)溶液中微量水分對(duì)過(guò)量部分的費(fèi)休氏滴定液進(jìn)行返滴定。剩余滴定法適用于儀器響應(yīng)精度不佳的情況下測(cè)定結(jié)晶水釋放緩慢和含水量較低的供試品。《美國(guó)藥典》收錄的葡萄糖酸鎂［18］和《日本藥典》收錄的硫酸小諾霉素［8］1251都因結(jié)晶水釋放緩慢，采用剩余滴定法進(jìn)行水分測(cè)試。

1. 5 費(fèi)休氏法-卡式爐法

卡式爐法是在適宜的溫度下加熱供試品，通過(guò)一定流速的氮?dú)?，將蒸發(fā)出來(lái)的水分導(dǎo)入滴定杯中進(jìn)行測(cè)試。本法適用于溶解性較差、成分復(fù)雜、存在副反應(yīng)、水分釋放緩慢和吸濕性較強(qiáng)的供試品水分測(cè)試。該方法的準(zhǔn)確度主要取決于系統(tǒng)排除大氣水分的程度，必須監(jiān)控基線漂移值，并對(duì)氣體轉(zhuǎn)移造成的誤差進(jìn)行校正。測(cè)試參數(shù)應(yīng)慎重選擇，需考察氣體流速、稱樣量、加熱溫度及加熱時(shí)間對(duì)測(cè)試結(jié)果的影響，防止供試品水分蒸發(fā)不完全或分解產(chǎn)生水?！稓W洲藥典》收錄的阿托伐醌采用卡式爐法進(jìn)行水分測(cè)試，加熱溫度為160 ℃、加熱時(shí)間為3 min、氣體流量為50 mL/min［4］1601。

2 供試品理化性質(zhì)分析

2. 1 供試品反應(yīng)性分析

供試品可能會(huì)與費(fèi)休氏試劑及測(cè)試過(guò)程生成的氫碘酸發(fā)生各種反應(yīng)，為了獲得準(zhǔn)確的測(cè)試結(jié)果，應(yīng)避免或盡量減少這些副反應(yīng)。常見(jiàn)副反應(yīng)有羥醛縮合反應(yīng)、酯化反應(yīng)、氧化還原反應(yīng)、中和反應(yīng)和復(fù)分解反應(yīng)等，反應(yīng)類型、反應(yīng)方程式及反應(yīng)方式詳見(jiàn)表3。

表3 費(fèi)休氏法水分測(cè)試過(guò)程常見(jiàn)副反應(yīng)

與甲醇反應(yīng)：部分醛、酮、強(qiáng)酸、硅醇基團(tuán)和硼化合物可以與甲醇發(fā)生反應(yīng)并生成水，生成水的速率取決于所使用的試劑和供試品。此類供試品水分測(cè)試可以使用醛酮專用試劑或鹵化醇作為溶劑。《美國(guó)藥典》收錄的馬來(lái)酸吡格列酮的水分測(cè)試中注明馬來(lái)酸與甲醇反應(yīng)產(chǎn)生水，滴定劑和溶劑都必須不含甲醇［19］。

與碘反應(yīng)：還原劑和氧化劑會(huì)直接或間接與費(fèi)休氏試劑中的碘發(fā)生反應(yīng)，影響供試品的原始含水量，例如硫醇、苯酚、抗壞血酸、青霉素副產(chǎn)物等。此類供試品水分測(cè)試可在測(cè)試體系中加入水楊酸抑制碘的氧化或采用快速費(fèi)休氏試劑減少副反應(yīng)的發(fā)生［20］。Sherman 等［21］提出在非水介質(zhì)中使用一種由碘、碘化鉀和醋酸鈉組成的新試劑，可準(zhǔn)確測(cè)試維生素C片劑的水分。

與滴定反應(yīng)生成的弱酸反應(yīng)：含有碳酸鹽、氫氧化物、氧化物、羰基和過(guò)氧化物的供試品易與反應(yīng)生成的氫碘酸和亞硫酸氫鹽反應(yīng)。此類供試品可通過(guò)卡式爐進(jìn)行水分測(cè)試或在溶劑中加入適量的堿（咪唑、吡啶）消除副反應(yīng)。Cachet等［22］報(bào)道采用10% 咪唑無(wú)水甲醇溶液可有效抑制紅霉素酸降解生成紅霉素烯醇醚和水的副反應(yīng)?！吨腥A人民共和國(guó)藥典》收錄的紅霉素，采用10% 咪唑無(wú)水甲醇溶液溶解供試品后進(jìn)行水分測(cè)試［5］521。

藥品研發(fā)過(guò)程中涉及水分測(cè)試的樣品眾多，由于結(jié)構(gòu)和成分的復(fù)雜性，部分副反應(yīng)的機(jī)制暫未明確。根據(jù)理論知識(shí)和藥品水分測(cè)試經(jīng)驗(yàn)，總結(jié)出以下副反應(yīng)判斷依據(jù)：（1）測(cè)試體系溶液的顏色（供試品溶解后呈無(wú)色），正常測(cè)試結(jié)束時(shí)溶液呈淡黃色，若呈深紅棕色或其他顏色，則可能存在副反應(yīng)；（2）測(cè)試體系是否有氣泡、煙霧或沉淀產(chǎn)生；（3）測(cè)試過(guò)程滴定曲線的變化，正常滴定曲線呈S型；（4）正常滴定時(shí)間內(nèi)是否出現(xiàn)滴定終點(diǎn)（與預(yù)期含水量對(duì)比），部分副反應(yīng)消耗碘或產(chǎn)生水使滴定時(shí)間延長(zhǎng)。

2. 2 供試品的酸堿性

卡爾費(fèi)休氏反應(yīng)是pH 依賴的可逆反應(yīng)，最佳pH 范圍為5. 5 ~ 8. 0。pH 過(guò)低，會(huì)使反應(yīng)常數(shù)降低，反應(yīng)速度減緩；pH過(guò)高，會(huì)加速反應(yīng)，影響反應(yīng)的化學(xué)計(jì)量值。此類供試品水分測(cè)試可添加弱堿（咪唑）或弱酸（水楊酸）緩沖系統(tǒng)pH?！吨腥A人民共和國(guó)藥典》收錄的紫杉醇注射液水分測(cè)試，規(guī)定供試品的pH為5. 4 ~ 7. 4［5］1627。

2. 3 供試品的引濕性

部分供試品含有吸濕官能團(tuán)，吸濕官能團(tuán)可能包括氨基、羥基、羧基、鈉鹽、鉀鹽、銨鹽、硅酸鋁、寡糖等20種，藥物吸濕后在低相對(duì)濕度環(huán)境中會(huì)發(fā)生不放濕、部分放濕、完全放濕等現(xiàn)象［23］。此類供試品測(cè)試，需嚴(yán)格控制環(huán)境的相對(duì)濕度與溫度，避免供試品引濕或放濕。必要時(shí)可在手套箱中操作，或采用外部溶解法、外部萃取法、剩余滴定法和卡式爐法。

2. 4 供試品溶解性分析

部分供試品在甲醇中溶解度有限，需要添加合適的助溶劑進(jìn)行增溶，保證測(cè)試結(jié)果的準(zhǔn)確性。助溶劑的選擇應(yīng)遵循以下原則：（1）助溶劑不參與卡爾費(fèi)休氏反應(yīng)且不影響反應(yīng)活性；（2）最大程度地增加樣品的溶解性；（3）助溶劑的添加量不能超過(guò)儀器公司推薦的限值。應(yīng)避免使用以下會(huì)產(chǎn)生副反應(yīng)或減緩卡爾費(fèi)休氏反應(yīng)的助溶劑，例如DMSO、二元醇和三元醇等。目前存在多種市售的含有助溶劑及緩沖介質(zhì)的費(fèi)休氏試劑，常用助溶劑及其比例推薦見(jiàn)表4。

表4 常用助溶劑比例

2. 5 供試品含水量分析

水分測(cè)試需要結(jié)合供試品的含水量選擇合適的測(cè)試方法和取樣量。容量法適用于常量和半微量水分測(cè)試（含水量約為0. 1% ~ 100%），對(duì)于水分含量低于1% 的供試品，優(yōu)選滴定度小于2. 0 的費(fèi)休氏試劑。庫(kù)侖法（直接投樣法）適用于微量水分測(cè)試（含水量約為0. 000 1% ~ 0. 1%），尤其是液體和氣體的水分測(cè)定。如表5所示，各國(guó)藥典均規(guī)定了最佳供試品稱樣量，《美國(guó)藥典》詳細(xì)介紹了供試品最少取樣量計(jì)算公式。此外，《美國(guó)藥典》還對(duì)膠囊和片劑的取樣做了如下規(guī)定：（1）如果供試品是膠囊，取至少4 顆內(nèi)容物的混合物進(jìn)行檢測(cè)；（2）如果供試品為片劑，則在已知不會(huì)影響結(jié)果的溫度和相對(duì)濕度的條件下，取不少于4 片研磨后測(cè)試［7］。

表5 各國(guó)藥典水分測(cè)試供試品稱樣量要求

3 水分測(cè)試方法的選擇

每種水分測(cè)試方法均有優(yōu)缺點(diǎn)和適用性，充分了解供試品的理化性質(zhì)是合理選擇水分測(cè)試方法及獲得準(zhǔn)確測(cè)試結(jié)果的必要前提?；趯?duì)方法特異性、水結(jié)合類型、樣品性質(zhì)和測(cè)試效率的綜合考慮，直接加樣法和卡式爐水分測(cè)定法的對(duì)比分析是測(cè)定化學(xué)性質(zhì)和熱穩(wěn)定性不明供試品水分含量的最佳方法，外部溶解法和外部萃取法是測(cè)定難溶性、吸濕性較強(qiáng)、稱量困難、水分分布不均及釋放緩慢等供試品水分的首選方法?；趯?shí)際研發(fā)經(jīng)驗(yàn)，本文將藥品研發(fā)過(guò)程中的水分測(cè)試總結(jié)為4類，即黏性固體、多組分固體、粉末狀固體和液體水分測(cè)試，根據(jù)供試品的性狀可參考圖1 ~ 圖4流程進(jìn)行水分測(cè)試方法的選擇。方法開(kāi)發(fā)過(guò)程可參考《歐洲藥典》通則“2. 5. 12 半微量水分測(cè)試”適用性驗(yàn)證和“2. 5. 32 微量水分測(cè)試”準(zhǔn)確度驗(yàn)證進(jìn)行方法確認(rèn)。

圖1 黏性固體水分測(cè)試方法選擇流程圖

圖2 多組分固體水分測(cè)試方法選擇流程圖

圖3 粉末狀固體水分測(cè)試方法選擇流程圖

圖4 液體水分測(cè)試方法選擇流程圖

4 結(jié) 論

水分含量不僅是藥物研發(fā)階段的重要研究?jī)?nèi)容，也是與仿制藥一致性評(píng)價(jià)緊密相關(guān)的關(guān)鍵質(zhì)量屬性，必須建立合理準(zhǔn)確的水分測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)保證藥品的穩(wěn)定性。水分質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制訂需以各國(guó)藥典為基礎(chǔ)，并結(jié)合供試品特性合理評(píng)估方法的適用性，選擇專屬性強(qiáng)、重現(xiàn)性佳、準(zhǔn)確度高的水分測(cè)試方法。本文重點(diǎn)介紹了費(fèi)休氏法水分測(cè)試方法和供試品的理化性質(zhì)分析，并在此基礎(chǔ)上提供了水分測(cè)試方法選擇的新思路。建議研究人員根據(jù)供試品特性和水分含量控制要求，逐步完善水分測(cè)試方法和限度標(biāo)準(zhǔn)，合理細(xì)化水分測(cè)試標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程，更好地保證測(cè)試結(jié)果的準(zhǔn)確性。