黃浩然，沈佳佳，胡康睿，李昌鍵，謝 林，王廣基，梁 艷

（中國藥科大學江蘇省藥物代謝動力學重點實驗室，南京 210009）

組胺是一種活性生物胺，其在外周組織中主要由肥大細胞和附近結締組織中的嗜堿性粒細胞產生，參與過敏和炎癥反應。而在大腦中組胺主要來源于組胺能神經元，可與G 蛋白偶聯受體結合，介導多種生理功能［1］。組氨酸是組胺在體內的主要來源，在組氨酸脫羧酶（HDC）的作用下氧化脫羧生成組胺。

在神經科學領域，組胺作為一種神經遞質受到日益關注。近年來，越來越多的研究發(fā)現組胺參與多種神經生理功能、神經免疫調節(jié)和中樞神經系統(tǒng)的發(fā)生發(fā)展［2-5］。Cacabelos 等［5］提出組胺的異常表達會導致神經炎癥，且是神經變性和神經元過早死亡的加重因素。也有一些研究表明，組胺對腦缺血損傷有神經保護作用。Adachi 等［6］發(fā)現，在大鼠大腦中動脈閉塞（MCAO）模型中，缺血后給藥組胺前體組氨酸可通過刺激中樞組胺H2受體而防止腦梗死的發(fā)生。此外，在腦缺血造模后2 個月中，組氨酸能在神經系統(tǒng)評分、認知能力評估和梗死區(qū)域面積方面體現出長期的腦保護作用［7］。為進一步探究組胺在中樞神經系統(tǒng)疾病中的作用，需要一種快速簡便的方法同時測定腦組織以及血漿中組胺及其前體組氨酸的含量變化。

目前，組胺的檢測方法有酶免疫分析法［8］、放射免疫分析法［9］、氣質聯用色譜法［10］、電化學檢測［11］、熒光分析法［12］等?；诳乖贵w特異性結合的酶免疫分析法、放射免疫分析法，需要制備特異性的抗體，且不能同時對組氨酸進行檢測；氣相色譜法基質效應復雜，吸附導致峰拖尾和記憶效應，通常需要進行衍生化，操作復雜；電化學檢測法受內源性物質干擾較大，靈敏度降低；熒光分析法需要進行熒光標記，且干擾因素多；而紫外檢測器則靈敏度低。因此，本研究中，采用高效液相色譜與質譜聯用的方法，首次用氨基柱對大鼠血漿以及腦組織中組胺及其前體組氨酸的含量進行測定。并且，為了降低測定過程中的基質干擾，首次對生物基質進行雙重吸附，吸附后的基質能夠用于標準曲線的配制，解決了內源性物質只能用人工血漿或者純水作為空白基質，所得結果與真實情況存在一定差異的問題，為其他內源性物質提供了共性的檢測技術。

1 材 料

1. 1 儀 器

LCMS-8050高效液相色譜-質譜聯用儀、CBM-20A 系統(tǒng)控制器、LC-30AD 雙泵、SIL-30AC 自動進樣器、CTO-30A 柱溫箱、電噴霧離子化接口的四極桿質譜檢測器、LabSolutions LCMS Ver. 5. 6 色譜工作站、AUM120D 電子天平（日本Shimadzu 公司）；Milli-Q Gradient A10 超純水器（美國Millipore 公司）；SorvallBiofuge Stratos 臺式高速冷凍離心機（美國Thermo Fisher Scientific 公司）。

1. 2 試 劑

組氨酸（histidine，HIS）、組胺（histamine，HA）（合肥博美生物科技有限公司）；活性炭（上海麥克林生化科技有限公司）；2，5-二羥基苯甲酸（2，5-dihydroxybenzoic acid，DHB）、方解石（CaCO3）、甲醇（色譜純）、乙腈（色譜純）、甲酸（色譜純）（美國Sigma-Aldrich公司）；甲酸銨（上海易恩化學技術有限公司）。其他試劑均為市售分析純。

1. 3 動 物

SD大鼠，雄性，體重（210±10）g，由浙江維通利華實驗動物技術公司提供，合格證號：SCXK（浙）2019-0001。所有動物實驗均符合動物倫理委員會標準。

2 方 法

2. 1 色譜條件

色譜柱為ODS-SPXBridge?Amide 柱（100 mm×4. 6 mm，3. 5 μm）；流動A 為0. 1% 甲酸-1 mmol/L甲酸銨水，流動相B為乙腈；流速為0. 4 mL/min；柱溫為40 ℃；進樣室溫度為4 ℃；線性梯度程序（A∶B）：0 min（90∶10），0. 02 min（65∶35），3. 5 min（65∶35），4. 0 min（50∶50），4. 2 min（10∶90），4. 4 min（10∶90），4. 6 min（90∶10），6. 5 min（90∶10）。

2. 2 質譜條件

電噴霧離子源（ESI源）；組胺和組氨酸的檢測均采用正離子、多反應監(jiān)測（MRM）模式：組氨酸監(jiān)測離子質荷比為156. 0→110. 1，碰撞電壓為-21. 0 eV，Q1偏差為-15. 0 V，Q3偏差為-21. 0 V；組胺監(jiān)測離子質荷比為112. 1→95. 1，碰撞電壓為-25. 0 eV，Q1偏差為-16. 0 V，Q3偏差為-17. 0 V；內標監(jiān)測離子質荷比為153. 1→108. 2，碰撞電壓為26. 0 eV，Q1 偏差為23. 0 V，Q3 偏差為19. 0 V。脫溶劑裝置溫度為250 ℃；加熱塊（block）溫度為400 ℃；霧化氣流速為3 L/min；干燥氣流速為10 L/min。

2. 3 溶液配制

標準品儲備液：精密稱取組氨酸及組胺標準品5. 00 mg，于10 mL 量瓶中，以甲醇溶解定容，配制成相當于0. 5 mg/mL 的組氨酸及組胺儲備液，置4 ℃冰箱中保存。

內標儲備液：精密稱取DHB 標準品5. 00 mg，置10 mL 量瓶中，以甲醇溶解定容，配制成相當于0. 5 mg/mL 儲備液，置4 ℃冰箱中保存。

內標溶液：取內標溶液1 mL，置于10 mL 量瓶中，用甲醇溶解定容，配制成相當于50 μg/mL 的內標溶液。

2. 4 空白生物基質的配制

取大鼠血漿1 mL，加入活性炭30 mg 和方解石30 mg，2 000 r/min 振蕩2 h，18 000 r/min 離心10 min，取上清液振蕩5 min 后，18 000 r/min 離心10 min。取上清液，用于標準曲線的配制。腦組織勻漿同法。

2. 5 樣品前處理

血漿樣本的處理：取大鼠血漿50 μL，加入50 μg/mL 的內標溶液5 μL 及冰乙腈150 μL，振蕩5 min，靜置10 min，18 000 r/min 離心10 min 兩次，取上清液5 μL進樣并進行定量分析。

腦組織樣本的處理：取大鼠腦組織0. 030 g，加入超純水150 μL，在冰水浴中勻漿。取勻漿50 μL，加入50 μg/mL的內標溶液5 μL及冰乙腈150 μL，振蕩5 min，靜置10 min，18 000 r/min 離心10 min兩次，取上清液5 μL進樣并進行定量分析。

3 方法驗證

3. 1 特異性

在本研究方法下組胺出峰時間為2. 8 min，組氨酸出峰時間約為3. 0 min，內標DHB 出峰時間約為3. 4 min。本研究考察了血漿和腦勻漿兩種基質吸附后的空白以及不同濃度點樣品色譜圖，結果表明方法特異性好，待測物及內標不受其他物質干擾，結果見圖1。

3. 2 標準曲線及定量下限

配制組氨酸濃度為200 μg/mL 及組胺濃度為10 μg/mL 的混合標準品溶液，用甲醇逐級稀釋為系列對照品工作液。分別吸取上述系列對照品工作液5 μL于1. 5 mL潔凈的Eppendorf管中，加入吸附后的大鼠空白血漿45 μL，混勻后即可得到為組氨酸質量濃度分別為20 000，10 000，2 000，1 000，200，100，20 ng/mL，組胺質量濃度分別為1 000，500，100，50，10，5，1 ng/mL的系列標準血漿樣本。

配制組氨酸濃度為200 μg/mL 及組胺濃度為1 μg/mL 的混合標準品溶液，用甲醇逐級稀釋為系列對照品工作液。分別吸取上述系列對照品工作液5 μL于1. 5 mL潔凈的Eppendorf管中，加入吸附后的大鼠空白腦勻漿45 μL，混勻后即可得到為組氨酸濃度分別為20 000，10 000，2 000，1 000，200，100，20 ng/mL，組胺質量濃度分別為100，50，10，5，1，0. 5，0. 1 ng/mL的系列標準腦組織樣本。

將得到的系列標準血漿樣本及系列標準腦組織樣本，分別按照“2. 5”項進行處理，用標準品和內標峰面積比（R）對標準品濃度c作線性回歸（權重系數W = 1/c）。結果表明，血漿中組氨酸在20 ~20 000 ng/mL 范圍內線性良好（r= 0. 999 0），定量下限為20 ng/mL，組胺在1 ~ 1 000 ng/mL 范圍內線性良好（r= 0. 999 0），定量下限為1 ng/mL；腦勻漿中組氨酸在20 ~ 20 000 ng/mL 范圍內線性良好（r= 0. 999 4），定量下限為20 ng/mL，組胺在0. 1 ~100 ng/mL 范圍內線性良好（r= 0. 999 2），定量下限為0. 1 ng/mL。

3. 3 準確度和精密度

分別按“2. 5”項下方法配制含50 ng/mL組氨酸和5 ng/mL 組胺的標準血漿樣本1、含500 ng/mL 組氨酸和50 ng/mL 組胺的標準血漿樣本2、含1 000 ng/mL組氨酸和5 000 ng/mL組胺的標準血漿樣本3。為考察批內和批間差異，3 個濃度均平行制備6 份，并連續(xù)測定3 個分析批以計算各血漿樣品中組氨酸及組胺濃度。血漿的批內及3 日內批間差在85% ~ 115% 之間。腦組織的準確度和精密度實驗參照血漿。腦組織的批內及3 日內批間差在85% ~ 115%之間。結果見表1。

Figure 1 Representative MRM chromatograms of a blank plasma sample after absorption (A); a blank plasma sample after absorption spiked with histidine (HIS) and histamine (HA) (5. 0 ng/mL) (B); a blank plasma sample after absorption spiked with HIS and HA (50. 0 ng/mL) (C); a blank brain matrix sample after absorption (D); a blank brain matrix sample after absorption spiked with HIS and HA (5. 0 ng/mL) (E) and a blank brain matrix sample after absorption spiked with HIS and HA (50. 0 ng/mL) (F)

Table 1 Precision and accuracy of HIS and HA in plasma and brain matrix (n = 6)

3. 4 基質效應和回收率

取吸附后大鼠空白血漿45 μL，并加入3 個不同濃度的組氨酸及組胺標準品溶液5 μL，3 個濃度均平行制備6 份，進樣后得峰面積A；另取吸附后大鼠空白血漿45 μL，根據“2. 5”項用冰乙腈預先處理，向其中加入3 個濃度的組氨酸及組胺標準品溶液5 μL，3 個濃度均平行制備6 份，進樣后得峰面積B；使用超純水45 μL 代替空白血漿，根據“2. 5”項用冰乙腈預先處理，向其中加入3 個濃度的組氨酸及組胺標準品溶液5 μL，3 個濃度均平行制備6 份，進樣得到峰面積C。提取回收率=A/B × 100%，基質效應= B/C× 100%。血漿經該方法處理后基質效應不明顯，回收率在可接受范圍內（＞75%）。腦組織的基質效應實驗過程參照血漿。腦組織經該方法處理后基質效應不明顯，回收率在可接受范圍內（＞75%）。結果見表2。

Table 2 Matrix effect and recovery rate of HIS and HA in plasma and brain matrix (n = 6)

3. 5 穩(wěn)定性

血漿樣本室溫放置穩(wěn)定性考察：分別取空白血漿45 μL，加入不同濃度組氨酸及組胺標準品5 μL，混勻后在室溫條件下放置12 h，根據“2. 5”項進行操作，檢測大鼠血漿中組氨酸及組胺濃度。

血漿樣本自動進樣器中穩(wěn)定性考察：組氨酸及組胺血漿樣本處理后，放置在自動進樣器中（4 ℃）達24 h后檢測組氨酸及組胺濃度。

血漿樣本反復凍融穩(wěn)定性考察：分別取空白血漿45 μL，加入不同濃度組氨酸及組胺標準品5 μL，混勻后反復凍融3 次，根據“2. 5”項進行操作，檢測組氨酸及組胺濃度。

血漿樣本長期冷凍穩(wěn)定性考察：分別取空白血漿樣本45 μL，加入不同濃度組氨酸及組胺標準品5 μL，混勻后置于-70 ℃冰箱冷凍14 d，根據“2. 5”項進行操作，檢測組氨酸及組胺濃度。

腦樣本穩(wěn)定性考察同血漿樣品。

結果如表3 所示，組氨酸及組胺在血漿和腦組織勻漿液中室溫放置12 h，超低溫冷凍（-60 ~-80 ℃）~解凍（37 ℃）3 次循環(huán)，超低溫（-60 ~-80 ℃）凍存14 d，樣品處理后進樣盤放置24 h 均穩(wěn)定（相對偏差RE小于± 15%）。

Table 3 Stability of HIS and HA in plasma and brain matrix (n = 6)

3. 6 方法應用

本研究通過腦中動脈閉塞（MCAO）建立大鼠缺血性腦卒中模型，驗證所建立方法在檢測組胺及組氨酸變化方面的可行性，并初步闡明與腦損傷相關的靶點。分布選取MCAO 術后24 h 大鼠及假手術大鼠各6 只，取血漿和大腦，對腦組織進行分區(qū)，取皮質、海馬和紋狀體3 個區(qū)域，按照“2. 5”項進行處理，取上清液5 μL 進樣分析。如圖2 所示，與假手術組相比，MCAO 模型大鼠血漿、皮質、海馬和紋狀體中組胺濃度均明顯升高，而組氨酸水平在血漿、皮質、紋狀體中顯著升高。

Figure 2 Concentrations of HIS and HA in plasma, cortex, hippocampus and striatum in sham-operated and middle cerebral artery occlusion(MCAO) model rats（±s, n = 6）

4 討 論

4. 1 空白生物基質的制備

組胺和組氨酸都是維持人體健康的重要生物活性分子。由于其具有內源性的特點，所以缺乏真實的空白基質來制備標準曲線。在一些報道中，將含5% 牛血清白蛋白的磷酸鹽緩沖鹽水溶液作為模擬空白血漿基質［13］。然而，配方基質與真實基質還是具有一定差異，真實基質中存在的各種鹽、蛋白質、脂類和微量元素，可能導致定量結果存在較大偏差。因此，考慮對空白組織中組胺及組氨酸進行吸附。

活性炭具有較高的熱穩(wěn)定性和化學穩(wěn)定性，并能與多種化合物形成表面官能團，是最常見、應用最廣泛的吸附劑之一［14］。方解石是一種碳酸鈣礦物，有報道稱氨基酸與礦物質表面存在相互作用，可以通過靜電引力、疏水作用、共價鍵和氫鍵等方式相互吸收［15］。故以峰面積為標準，考察了分別添加活性炭、方解石以及活性炭和方解石對基質中組胺和組氨酸吸附的效果，結果表明同時添加活性炭30 mg 和方解石30 mg 吸附效果最好。吸附后的生物基質能夠用于標準曲線的制備及真實樣品分析。

4. 2 色譜柱的選擇

氨基柱以氨丙基鍵合硅膠為填料，可用于正相色譜，也可用于反相色譜分析，在高有機相比例下可作為親水相互作用色譜柱進行分析，應用廣泛。其與ODS 色譜柱相比更適用于極性大的小分子物質，并廣泛應用于糖類的分析。本研究首次選用ODS-SPXBridge?氨基色譜柱對組胺和組氨酸進行分析，待測物峰型良好，靈敏度高。

4. 3 方法應用

組胺無法通過血-腦脊液屏障，腦內組氨酸脫羧是組胺的唯一來源。在探究組胺在一些中樞神經系統(tǒng)疾病中的作用時，研究人員通常經口給予動物組氨酸，以增加腦內組胺含量。然而，組氨酸本身為必需氨基酸，在體內含量很高，額外補充組氨酸能否提高腦內組氨酸水平，進而增加組胺生成，有待考察。本研究首次建立一種能夠同時測定大鼠體內組胺及其前體組氨酸含量的方法，方法的應用將有助于進一步探究組胺以及組氨酸在中樞性疾病中的作用。

在各種中樞神經系統(tǒng)疾病中，缺血性腦卒中是導致死亡的主要原因，也是導致長期殘疾的主要原因，其癥狀主要涉及運動功能障礙和記憶衰退。大腦皮質上分布著數百億個神經元，是調節(jié)軀體運動的最高級中樞；紋狀體是控制運動的關鍵區(qū)域，紋狀體功能障礙會導致嚴重的運動障礙［16］；而海馬體是人體的記憶系統(tǒng)。因此，本研究重點測定了這3 個腦區(qū)及血漿中組胺及組氨酸水平。結果表明，與假手術組相比，MCAO 模型大鼠血漿、皮質、海馬和紋狀體中組胺濃度均明顯升高，而組氨酸水平在血漿、皮質、紋狀體中顯著升高。組胺在腦中作為一種神經遞質可以調控4 種組胺受體，其上調的具體病理意義將有待進一步研究。此外，腦內組氨酸含量是血漿組氨酸含量的3倍左右，而腦組胺僅不到血漿中組胺水平的十分之一。因此，推測急性缺血性腦卒中導致血-腦脊液屏障受損，血漿中組胺大量進入腦內可能為腦組胺水平暫時升高的原因之一。

5 總 結

運用氨基柱和生物基質吸附的方式，建立一種高效液相色譜-串聯質譜方法，能夠同時定量大鼠血漿和腦組織勻漿兩種生物基質中組胺及其前體組氨酸。該方法前處理方式簡單，無需衍生化，符合生物樣本分析要求，已用于實際樣本分析。