王 玨，江 穎，肖新月，楊 銳，孫會敏*，涂家生

（1中國食品藥品檢定研究院，國家藥品監(jiān)督管理局藥用輔料質(zhì)量研究與評價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100050；2上海市醫(yī)療器械化妝品審評核查中心，上海 200020）；3中國藥科大學(xué)，國家藥品監(jiān)督管理局藥物制劑及輔料研究與評價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210009；

在藥用輔料中，甲醛和乙醛通常是經(jīng)降解產(chǎn)生的小分子雜質(zhì)，尤其在聚氧乙烯類或包含聚氧乙烯鏈段的藥用輔料（如聚山梨酯20、聚山梨酯80等）中可能存在，其降解途徑如圖1 所示［1］。甲醛和乙醛分別被世界衛(wèi)生組織國際腫瘤研究機(jī)構(gòu)（International Agency for Research on Cancer，World Health Organization，WHO IARC）列為致癌物和可能致癌物。按照《人用藥品注冊技術(shù)國際協(xié)調(diào)會議指南：誘變性雜質(zhì)的評估和控制》（ICH M7）要求，二者屬于基因毒性雜質(zhì)，因此無論在制劑還是輔料中均需要將其控制在可接受限度以下。

Figure 1 Schematic diagram of aldehyde generation in polysorbates

聚山梨酯80 和聚山梨酯20 作為生物制品中常用的穩(wěn)定劑，通過競爭機(jī)制或分子伴侶機(jī)制［2-5］保護(hù)蛋白分子在整個(gè)生命周期中的穩(wěn)定性。但其降解產(chǎn)生的醛類小分子不僅會帶來安全性風(fēng)險(xiǎn)，而且由于具有較強(qiáng)的反應(yīng)活性還會對蛋白藥物穩(wěn)定性造成影響。以甲醛為例，它可以與蛋白質(zhì)分子中的氨基或亞胺基等基團(tuán)發(fā)生親核加成反應(yīng)，經(jīng)偶聯(lián)鄰近的伯胺，使蛋白質(zhì)分子之間通過共價(jià)鍵而交聯(lián)，即Mannich 反應(yīng)。這種反應(yīng)有可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)聚集體的形成。

然而，目前各國藥典聚山梨酯80 和聚山梨酯20 標(biāo)準(zhǔn)中均沒有對醛類檢查作出相關(guān)要求。本研究參考ICH M7 的相關(guān)要求，對蛋白制劑用聚山梨酯80 和聚山梨酯20 中甲醛和乙醛的雜質(zhì)限度進(jìn)行了合理估算，同時(shí)結(jié)合甲醛和乙醛對阿達(dá)木單抗穩(wěn)定性的影響對控制限度的制訂提出了建議。采用已建立的聚山梨酯80 和聚山梨酯20 中甲醛和乙醛含量測定的HPLC 柱前衍生化法并進(jìn)行了優(yōu)化［6-8］，運(yùn)用該方法對市售的多個(gè)廠家、多個(gè)批次及多個(gè)應(yīng)用級別的聚山梨酯80 和聚山梨酯20 樣品進(jìn)行測定，發(fā)現(xiàn)市售產(chǎn)品有部分批次甲醛和乙醛超出了建議限度。

1 材 料

1. 1 樣品與試劑

聚山梨酯80 分別購自英國禾大Croda 公司、Ewnik 公司、南京威爾有限公司、江蘇保易有限公司、Sigma-Aldrich 公司、日本NOF 公司和上海弘順生物科技有限公司。聚山梨酯20分別購自南京威爾有限公司、國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司、J. T.Baker 公司、化夏試劑有限公司和上海一基實(shí)業(yè)有限公司。阿達(dá)木單抗注射液（規(guī)格：0. 8 mL：40 mg，國內(nèi)某制藥公司）；PBS 緩沖液［賽默飛世爾科技（中國）有限公司］；甲醛（中國計(jì)量科學(xué)研究院，BW3450，9. 67 mg/mL）；乙醛（阿拉丁生化科技股份有限公司）；甲醛2，4-二硝基苯腙（甲醛-DNPH，默克化工有限公司）；乙醛2，4-二硝基苯腙（乙醛-DNPH，德國Dr. Ehrenstorfer GmbH 公司）；2，4-二硝基苯肼（上海麥克林生化科技有限公司，98%，HPLC級）；鹽酸為市售分析純；乙腈為色譜純。

1. 2 儀 器

Agilen1260 高效液相色譜儀［安捷倫科技（中國）有限公司］。

2 方法與結(jié)果

2. 1 樣品中甲醛和乙醛的含量測定

2. 1. 1 溶液配制及衍生化

（1）2,4-二硝基苯肼的純化 稱取2，4-二硝基苯肼4 g，置于燒瓶中，加乙腈200 mL，混勻，于90 ℃水浴中加熱30 min，趁熱過濾至錐形瓶中。濾液自然冷卻后用布氏漏斗抽濾，用乙腈沖洗剩余晶體即得純化后的2，4-二硝基苯肼。如空白干擾仍可檢出，需重復(fù)該純化過程。

（2）衍生化試劑的配制 取純化后的2，4-二硝基苯肼0. 25 g，精密稱定，置于50 mL 量瓶中，加乙腈40 mL，完全混勻后再加入濃鹽酸3 mL，超聲至完全溶解，用乙腈稀釋至刻度，將溶液轉(zhuǎn)移至棕色瓶中，臨用新制。

（3）對照品儲備液的配制 取甲醛-DNPH 和乙醛-DNPH 適量，精密稱定，加乙腈溶解并定量稀釋成每毫升約含30 μg 的甲醛-DNPH 對照品儲備液和每1 mL 約含200 μg 的乙醛-DNPH 對照品儲備液。

（4）供試品溶液的配制 取樣品0. 5 g，精密稱定，置于10 mL 量瓶中，加乙腈1 mL 溶解樣品，再加入衍生化試劑2 mL，混勻。在黑暗處于室溫下衍生化30 min 后，加乙腈稀釋至刻度，即得供試品溶液。

2. 1. 2 高效液相色譜條件 色譜柱：CAPCELL PAK DD-C8柱（4. 6 mm × 150 mm，5 μm）；進(jìn)樣量：20 μL；流動相：A（水）-B（乙腈），流速：1. 0 mL/min；檢測波長：360 nm；柱溫：30 ℃。流動相梯度：0 ~ 11 min：65% A ~ 20% A；11 ~ 15 min：80% B ~100% B；15 ~ 16 min：100% B ~ 35% B。

2. 1. 3 衍生化反應(yīng)效率的測定 精密稱取甲醛和乙醛對照品適量，用乙腈稀釋，分別配制成50 μg/mL 的甲醛對照品溶液和乙醛對照品溶液，各取1 mL 于10 mL 量瓶中，按供試品溶液的配制同法處理，照下式分別計(jì)算甲醛和乙醛的反應(yīng)效率：甲醛反應(yīng)效率=m甲醛-DNPH/(210 × 50) × 30 ×100%；乙醛反應(yīng)效率=m乙醛-DNPH/(224 × 50) × 44 ×100%。

其中，m甲醛-DNPH和m乙醛-DNPH分別為樣品中甲醛-DNPH和乙醛-DNPH的檢出量（μg）。

結(jié)果表明，在該反應(yīng)條件下，甲醛和乙醛的衍生化反應(yīng)效率分別為100%和98%。

2. 1. 4 線性標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 取甲醛-DNPH 對照品儲備液和乙醛-DNPH 對照品儲備液用乙腈稀釋為每毫升含甲醛-DNPH 分別為0. 15，3，10，20，24，30 μg，含乙醛-DNPH 分別為1，5，60，80，150，200 μg的溶液作為線性標(biāo)準(zhǔn)溶液。

2. 1. 5 測定結(jié)果 精密量取線性標(biāo)準(zhǔn)溶液20 μL注入液相色譜儀中，記錄色譜圖，以濃度與對應(yīng)峰面積計(jì)算回歸方程；另精密量取供試品溶液20 μL注入液相色譜儀中，記錄色譜圖，代入回歸方程，并按公式（1）和公式（2）計(jì)算供試品中甲醛和乙醛的含量。

采用上述方法對來自8 個(gè)廠家共20 批聚山梨酯80 樣品、5 個(gè)廠家共11 批聚山梨酯20 樣品中的甲醛和乙醛進(jìn)行測定，結(jié)果如表1 和表2 所示。本文隱去廠家名稱并用大寫字母表示，用數(shù)字代替批號。級別表示廠家標(biāo)明的普通級或注射級、未精制或精制、低純度或中等純度原料合成產(chǎn)品。結(jié)果表明，不同廠家的聚山梨酯80 和聚山梨酯20在甲醛或乙醛含量上存在較大差異，同一廠家不同批次的含量也有所不同；注射級別的產(chǎn)品并不意味著醛類含量低，甚至精制后的產(chǎn)品表現(xiàn)出了較高的乙醛含量（＞600 μg/g）。然而精制加工可能有利于聚山梨酯80中的甲醛含量保持在較低水平（＜3 μg/g）；而較高的原料純度有可能產(chǎn)生較高含量的甲醛。以上結(jié)果提示，原料純度、精制或提純工藝與聚山梨酯80 或聚山梨酯20 的含醛量有關(guān)，控制醛含量對保證產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定來說具有重要意義。

Table 1 Assay of formaldehyde and acetaldehyde in different batches of polysorbate 80 determined by HPLC

2. 2 方法學(xué)驗(yàn)證

2. 2. 1 精密度 精密量取3 μg/mL 甲醛-DNPH 對照品溶液和10 μg/mL 乙醛-DNPH 對照品溶液各20 μL，連續(xù)進(jìn)樣6 次，記錄色譜圖，以峰面積計(jì)算RSD。結(jié)果表明，甲醛-DNPH 和乙醛-DNPH 峰面積的RSD 分別為0. 8% 和0. 9%，均小于2%，表明儀器進(jìn)樣精密度良好。

Table 2 Assay of formaldehyde and acetaldehyde in different batches of polysorbate 20 determined by HPLC

2. 2. 2 檢出限和定量限 將甲醛-DNPH 和乙醛-DNPH 對照溶液逐級稀釋，精密量取各溶液20 μL注入液相色譜儀，以信噪比S/N = 3 對應(yīng)的溶液濃度作為檢出限，S/N = 10 對應(yīng)的溶液濃度作為定量限。結(jié)果表明，甲醛-DNPH 和乙醛-DNPH 的檢出限均為0. 005 μg/mL，定量限均為0. 01 μg/mL。

2. 2. 3 線性和范圍 分別取甲醛-DNPH 對照品儲備液和乙醛-DNPH 對照品儲備液，用乙腈稀釋為每毫升含甲醛-DNPH 分別為0. 15，3，10，20，24，30 μg，含乙醛-DNPH 分別為1，5，60，80，150，200 μg 的溶液作為系列對照品溶液。精密量取上述對照品溶液20 μL注入高效液相色譜儀中，記錄色譜圖，以對照品溶液濃度（c，μg/mL）與對應(yīng)的峰面積（A）進(jìn)行線性回歸，得到甲醛-DNPH 和乙醛-DNPH線性回歸方程分別為A= 101. 33c- 1. 244 3（r=0. 999 9），A= 99. 799c+ 65. 509（r= 0. 998 7）。結(jié)果表明甲醛-DNPH 在0. 14 ~ 28. 65 μg/mL，乙醛-DNPH在0. 99 ~ 198. 45 μg/mL范圍內(nèi)線性良好。

2. 2. 4 日內(nèi)精密度 精密量取3 μg/mL 甲醛-DNPH 對照品溶液和10 μg/mL 乙醛-DNPH 對照品溶液各20 μL，分別于0，6，12，24 h 各進(jìn)樣1 次，記錄色譜圖，以峰面積計(jì)算RSD。結(jié)果表明，甲醛-DNPH 和乙醛-DNPH 4 次進(jìn)樣峰面積的RSD 分別為1. 39% 和1. 22%，均小于2. 0%，表明日內(nèi)精密度良好。

2. 2. 5 日間精密度 精密量取3 μg/mL 甲醛-DNPH 對照品溶液和10 μg/mL 乙醛-DNPH 對照品溶液各20 μL，分別于1，2，3，4，5，6 d 各進(jìn)樣1 次，記錄色譜圖，以峰面積計(jì)算RSD。結(jié)果表明，甲醛-DNPH 和乙醛-DNPH 6 次進(jìn)樣峰面積的RSD 分別為1. 10% 和0. 81%，均小于2. 0%，表明日間精密度良好。

2. 2. 6 準(zhǔn)確度 取已知甲醛和乙醛含量的聚山梨酯80 樣品，分別精密加入甲醛6，9，12 μg，乙醛20，25，30 μg，按“2. 1. 1”項(xiàng)方法處理，制成低、中、高3 個(gè)濃度的加樣回收率測定溶液，每個(gè)濃度各3份，按“2. 1. 2”項(xiàng)中色譜條件測定，用外標(biāo)法以峰面積計(jì)算加樣回收率，甲醛和乙醛的平均回收率分別為108. 8% 和98. 4%，RSD 分別為3. 7% 和3. 3%。根據(jù)《中華人民共和國藥典》（2020 年版）四部通則9101 中回收率限度的相關(guān)規(guī)定，表明本法準(zhǔn)確度良好。

2. 3 甲醛和乙醛對阿達(dá)木單抗聚集的影響考察

2. 3. 1 共孵育處理 用PBS 配制甲醛和乙醛母液，分別加入到5 mg/mL 經(jīng)PBS 稀釋的阿達(dá)木單抗注射液中，使終濃度分別為0，0. 6，6 和60 μg/g。分別在4 ℃和40 ℃條件下靜置孵育，于2，4，7 d 時(shí)將溶液直接進(jìn)樣，用分子排阻色譜法（size exclu?sion chromatography，SEC）測定阿達(dá)木單抗的聚集體含量。

2. 3. 2 分子排阻色譜法(SEC)測定 色譜柱：Mab?Pac SEC-1（300 ?，7. 8 mm× 300 mm，5 μm）；進(jìn)樣量：20 μL；流動相：A：磷酸鹽緩沖液（50 mmol/L，pH = 6. 8），B：水（300 mmol/L NaCl），A∶B = 1∶1 等度洗脫；流速：0. 8 mL/min；紫外檢測器波長：360 nm；柱溫：30 ℃，運(yùn)行時(shí)間：20 min。

精密量取“2. 3. 1”項(xiàng)共孵育處理后的溶液20 μL 注入液相色譜儀，記錄色譜圖，分別對聚集體和單體色譜峰積分，按照面積歸一化法計(jì)算聚集體含量。

Figure 2 Aggregate assay of adalimumab treated by formaldehyde or acetaldehyde respectively at 4 °C (A) and 40 °C (B) using size exclusion chro?matography (SEC) (±s, n = 3)

2. 4 阿達(dá)木單抗聚集體含量監(jiān)測

分別在0. 6，6，60 μg/g 3個(gè)濃度條件下、于4 ℃和40 ℃考察了甲醛和乙醛對阿達(dá)木單抗聚集的影響。如圖2 所示，結(jié)果表明，甲醛對阿達(dá)木單抗的聚集作用更為顯著。甲醛對阿達(dá)木單抗的聚集作用具有濃度依賴和溫度依賴性，在相同溫度下，高濃度（60 μg/g）甲醛相較于中、低濃度（6 μg/g 和0. 6 μg/g）更易導(dǎo)致阿達(dá)木單抗聚集；同時(shí)，提高溫度也可促進(jìn)甲醛對單抗的聚集誘導(dǎo)作用，即甲醛在4 ℃條件下，4 d 內(nèi)即可引起1% 以上的單抗聚集，而在40 ℃條件下放置4 d 即可引起2% 以上的阿達(dá)木單抗聚集。乙醛對阿達(dá)木單抗的聚集效果不論在4 ℃還是40 ℃條件下與對照組相比差異均不十分顯著，且濃度增大后也并未對阿達(dá)木單抗顯示出明顯的聚集效應(yīng)。分子排阻色譜法測定阿達(dá)木單抗聚集體的典型色譜圖見圖3。

Figure 3 Typical SEC chromatogram of adalimumab respectively treated by formaldehyde (A) and acetaldehyde (B)

3 討 論

由輔料聚山梨酯80 和聚山梨酯20 引入的甲醛和乙醛雜質(zhì)不僅經(jīng)人體攝入時(shí)存在安全性風(fēng)險(xiǎn)，而且會對蛋白類藥物的穩(wěn)定性造成影響。本研究采用兩種方法對蛋白制劑中聚山梨酯80和聚山梨酯20的甲醛、乙醛含量限度進(jìn)行了評估。

參考美國非活性物質(zhì)數(shù)據(jù)庫（IIG）注射劑中聚山梨酯80 和聚山梨酯20 的處方使用量分別為0. 000 2 ~ 0. 585 g/mL 和0. 01 ~ 0. 02 g/mL，將0. 02 g/mL 作為常用處方用量；以國家藥品監(jiān)督管理局網(wǎng)站公布的市售單抗注射液（11 個(gè)品規(guī)）的規(guī)格為參考，將每日給藥量10 mL 作為每日攝入體積，按照美國食品藥品管理局（FDA）和歐洲藥品管理局（EMA）規(guī)定的毒理學(xué)關(guān)注閾值（TTc）：長期用藥時(shí)，潛在毒性雜質(zhì)每日攝入量不能超過1. 5 μg/d。因此計(jì)算得出甲醛和乙醛的限度（估算）均為7. 5 μg/g。另外，按照ICH M7 的要求，采用基于化合物特異性風(fēng)險(xiǎn)評估的可接受攝入量可計(jì)算可攝入量（AI）。 根據(jù)CPDB（Carcinogenic Potency Database）數(shù)據(jù)庫所報(bào)道的甲醛TD50：1. 35 mg/（kg·d）（大鼠）和乙醛TD50：153 mg/（kg·d）（大鼠），得到聚山梨酯80 和聚山梨酯20 中甲醛和乙醛限度（估算）分別為6. 75 和765 μg/g。需要說明的是，以上僅是本研究從雜質(zhì)安全性評估的角度對注射用單抗制劑中聚山梨酯80和聚山梨酯20的甲醛和乙醛含量限度的粗略估算，是否準(zhǔn)確、全面和合理仍有待更進(jìn)一步的毒理學(xué)風(fēng)險(xiǎn)評估。

結(jié)合本研究中甲醛和乙醛對阿達(dá)木單抗穩(wěn)定性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，當(dāng)甲醛濃度為60 μg/g 時(shí)已經(jīng)可以對單抗聚集產(chǎn)生很大影響，而6 μg/g時(shí)對單抗聚集的影響并不顯著，因此可以推斷，按照以上過程估算得出的甲醛雜質(zhì)限度（約7 μg/g）條件下對保證單抗穩(wěn)定性是有利的。而乙醛在本研究實(shí)驗(yàn)條件下對阿達(dá)木單抗的聚集效應(yīng)并不顯著，因此限度設(shè)定應(yīng)首先考慮其安全性。

此外，在本研究中為了說明小分子雜質(zhì)對單抗穩(wěn)定性的影響，給制定單抗中聚山梨酯80和聚山梨酯20中醛類小分子檢查提供依據(jù)，本研究只關(guān)注了兩個(gè)雜質(zhì)本身對阿達(dá)木單抗穩(wěn)定性的影響，而未對輔料本身對單抗聚集的直接作用作出考察，將在以后的研究中進(jìn)一步完善。

4 結(jié) 論

本研究不僅建立了適用于聚山梨酯80和聚山梨酯20 中甲醛和乙醛微量雜質(zhì)檢測的HPLC 柱前衍生化檢測方法，而且從基因毒性雜質(zhì)控制和對生物制劑穩(wěn)定性影響兩方面綜合考量，初步得出二者的控制限度，并根據(jù)實(shí)測多批次樣品的甲醛乙醛殘留量，對輔料質(zhì)量進(jìn)行總體評價(jià)，對其中甲醛和乙醛限度控制策略進(jìn)行建議，為輔料質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提高提供了理論支撐。