楊英來 趙建廣 陳 赫 崔子峰

腮腺區(qū)的疾病構(gòu)成廣泛，臨床表現(xiàn)多樣，位置特殊，對頜面部功能、美觀及心理要求高，但其術(shù)前禁忌行病理活檢，病理類型復雜，鑒別困難，因此腮腺病變最初的診斷策略對明確診斷及治療方案的制訂顯得尤為重要[1]。目前在臨床工作中術(shù)前較多應用影像學和細針吸取細胞學診斷來評估腫瘤，而FNAC是基于對細胞、細胞群或組織微粒評估的一種簡捷、準確的細胞學診斷方法，盡管分子發(fā)病機制多樣且生物學行為各不相同，但許多不同的腮腺腫瘤通常在細胞學上相似，這使得FNAC對鑒別腮腺腫瘤的價值存在爭議[2]。另外腫瘤標記物也能提高診斷的準確性，因此本研究擬評估FNAC在腮腺腫瘤中的診斷特性并聯(lián)合利用GFAP、Fas-FasL免疫組化以評估其診斷價值。

資料和方法

1.材料

回顧河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院口腔頜面外科2014年9月至2019年6月期間的腮腺腫瘤患者383例。入組標準：①具有完善的病例資料，包括性別、年齡、術(shù)前FNAC及術(shù)后組織病理學診斷報告；②FNAC均在超聲引導下完成，除送細胞學檢測外還將剩余樣本按照本研究方法成功制作細胞塊；③FNAC及術(shù)后組織病理學診斷均分別由我院細胞學室及病理科2名以上專職醫(yī)師完成。

2.方法

（1）超聲引導下穿刺：經(jīng)超聲探查、定位腫瘤，用20ml注射器配6號針頭，于定位點引導下經(jīng)皮刺入腮腺腫瘤內(nèi)，拉針栓維持負壓不出針在4～5個不同方向提插，直至獲得足夠的樣本，除3～4張用于傳統(tǒng)細胞涂片送細胞學室檢測外，保留足夠樣本用于制作細胞塊。

（2）細胞塊制作：將穿刺出的組織或液體附于載玻片上，在豎起載玻片不流動的情況浸入95%乙醇中0.5～1.0min，取出后用穿刺針將樣本集聚成小塊狀，再浸入10%中性甲醛溶液中30～60min，擦鏡紙包裹固定后的樣本放入脫水盒，后續(xù)按照活檢小標本方法常規(guī)行脫水、透明、浸蠟，最終完成石蠟包埋。

（3）免疫組織化學檢測兔抗人膠質(zhì)纖維酸性蛋白多克隆抗體濃縮液GFAP，鼠抗人Fas單克隆抗體、兔抗人FasL多克隆抗體Fas-FasL蛋白檢測試劑盒購置于中杉金橋（北京）公司。對FNAC細胞塊行免疫組化，用已知陽性組織作為陽性對照，以PBS代替一抗作為空白對照。

（4）統(tǒng)計學處理：采用SPSS26.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，Kappa一致性檢驗用于比較術(shù)前FNAC和術(shù)后組織病理學診斷，組間陽性率比較采用χ2檢驗（包括連續(xù)校正法和Fisher確切概率法，兩兩比較使用卡方分割法），P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1.在383例病例中，36例因病例資料不完善或FNAC樣本未成功制作成細胞塊而被排除。對347例納入研究的病例進行分析，其中男性198例（57.06%），女性149例（42.94%），平均年齡為53.10±13.47歲（范圍：6～83歲）。術(shù)前FNAC中疑似惡性或惡性68例，良性279例；術(shù)后組織病理學診斷中惡性52例，良性295例，其中最多見的惡性腫瘤為ACC（19/347，5.48%），最多見的良性腫瘤為PA（193/347，55.62%）。

2.FNAC對腮腺惡性腫瘤診斷的陽性預測值為57.35%，陰性預測值為95.34%，靈敏性為75.00%，特異性為90.17%，對研究例病例診斷的準確率為87.90%，F(xiàn)NAC與組織病理學診斷有中等一致性（Kappa＝0.578）。假陰性、假陽性診斷較多出現(xiàn)于ACC與PA中（表1～3）。

表1 FNAC與組織病理學診斷結(jié)果對比

3.除外3例淋巴瘤，總共有16例腮腺ACC具有足夠的細胞塊樣本，選取同樣條件的PA 37例，腮腺正常組織塊37例，共90例行GFAP，F(xiàn)as及FasL免疫組化（表4、5）。

表4 Fas及FasL表達結(jié)果及統(tǒng)計分析

Fas及FasL：37例組織學診斷為正常腮腺組織的標本經(jīng)免疫組化學染色后，36例顯示陽性，1例為陰性；37PA例組織學診斷為的標本經(jīng)免疫組織化學染色后，34例顯示陽性，3例為陰性；16ACC例組織學診斷為的標本經(jīng)免疫組化染色后，16例均顯示陰性。通過檢驗，三組中的表達差異有統(tǒng)計學意義，（對Fas-fasl，差異分析P值小于0.05，說明三組間的檢驗結(jié)果差異具有統(tǒng)計學意義；經(jīng)卡方分割法兩兩比較可知；正常組別與PA相比（χ2＝0.264，P＝0.607＞0.017），正常組陽性率與PA組差異無統(tǒng)計學意義；正常組與ACC組相比（χ2＝48.534，P＝0.001＜0.017），正常組陽性率與ACC組差異具有統(tǒng)計學意義，正常組陽性率高于ACC組；ACC組別與PA相比（χ2＝40.013，P＝0.001＜0.017），ACC組陽性率低于PA組）。

表2 假陰性病例的FNAC和組織病理學診斷

表3 假陽性病例的FNAC和組織病理學診斷

GFAP：37例組織學診斷為正常腮腺組織的標本經(jīng)免疫組化學染色后，35例顯示陰性，2例為陽性；37PA例組織學診斷為的標本經(jīng)免疫組織化學染色后，37例顯示陽性，3例為陰性；16ACC例組織學診斷為的標本經(jīng)免疫組化染色后，16例均顯示陰性。通過檢驗，在三組中的表達差異有統(tǒng)計學意義。

表5 GFAP表達結(jié)果及統(tǒng)計分析

圖1 、2 免疫組化：正常腮腺、AP中Fas及FasL陽性表達（ ×200 ×400）

圖3 、4 免疫組化：AP中GFAP陽性表達（ ×200 ×400）

討 論

涎腺腫瘤約80%發(fā)生在腮腺。涎腺腫瘤的主要治療方式是外科手術(shù)切除，良惡性腫瘤的手術(shù)方式和手術(shù)范圍不同，治療方案主要取決于腫瘤的組織學類型，這就對腮腺腫瘤的術(shù)前診斷提出了挑戰(zhàn)[1]。考慮腮腺本身的生理功能、腮腺中與腮腺床上重要的神經(jīng)血管以及腮腺腫瘤的特異性，在臨床實踐中幾乎被視為禁忌。因此術(shù)前鑒別涎腺腫瘤的良惡性在制定手術(shù)計劃中起著重要的作用。由于涎腺腫瘤在早期缺乏特異性癥狀和體征，術(shù)前在臨床上難以確定其性質(zhì)，在臨床工作中術(shù)前較多應用CT、MRI、超聲等影像學來評估腫瘤[2]。

FNAC已較廣泛的應用于甲狀腺腫瘤，乳腺腫瘤等；在涎腺腫瘤中，研究顯示:與涎腺檢查和放射學評估相比，F(xiàn)NAC被認為對涎腺腫瘤具有更高的診斷準確性[3]。但也有部分學者研究表明，盡管它在近1/3的病例中消除了手術(shù)治療的可能性，但由于其敏感性低和細胞學活檢結(jié)果的差異，其臨床益處仍然受到質(zhì)疑[4]。部分學者認為術(shù)前行FNAC是不必要的，無論FNAC結(jié)果的準確性如何，即便可能出現(xiàn)的假陽性和假陰性結(jié)果，其均需手術(shù)治療，因此不需要術(shù)前行FNAC；但是由于良性腮腺腫瘤和惡性腮腺腫瘤的手術(shù)方案的選擇具有差異，所以有相當多的研究者主張術(shù)前對于腮腺腫瘤患者行FNAC的是必要的[5]。與傳統(tǒng)FNAC相比較，超聲引導下的FNAC的適應證更廣：①傳統(tǒng)FNAC不能成功穿刺的腫塊，如直徑＞1cm但不能觸及的腫塊；②腫塊可觸及但直徑＜1cm；③深部腮腺區(qū)腫塊；④鄰近血管或神經(jīng)的腫塊；⑤囊性或混合性腫塊。雖然超聲引導下穿刺活檢能夠獲取較多的組織，但對腮腺腫瘤的生物學行為、惡性程度及預后的研究多從病理形態(tài)學的角度研究。受觀察人員的主觀因素影響而不能全面準確的指導臨床治療措施及腫瘤預后的效果[2，6]。所以尋求從分子生物學角度研究腮腺腫瘤的性質(zhì)和轉(zhuǎn)歸，可以準確的篩選具有高復發(fā)、高轉(zhuǎn)移潛能的腫瘤患者，從而能夠制定合理的治療方案和臨床用藥。另外近年來，細胞蠟塊免疫組化檢查是一種介于涂片細胞學和病理組織學之間的一種有效的臨床診斷方法，利用細針穿刺標本呈現(xiàn)局部組織病理學形態(tài)，細胞蠟塊切片中細胞數(shù)量豐富而且相對集中，為進行免疫組織化學染色后分子病理學檢測提供了良好的樣本平臺。

通過超聲引導下穿刺而制成的細胞塊具有如下優(yōu)點：①細胞塊切片能保持部分原有組織的排列結(jié)構(gòu)，細胞成分豐富，圖像背景清晰，易于作出準確診斷；②切片的細胞集中，克服了傳統(tǒng)穿刺涂片中細胞重疊堆積、厚薄不均的現(xiàn)象；③細胞塊可連續(xù)切片，能有效減少漏診；④可反復重切，克服傳統(tǒng)穿刺涂片固定不佳、脫片、染色失敗等難以彌補的缺陷；⑤能作多種組織化學染色、免疫組織化學染色或分子病理學檢測[2，7]。但是通過該方法制作的細胞塊也有一定的局限性，在穿刺吸出物極少時難以完成。

本研究應用細針穿刺細胞技術(shù)聯(lián)合免疫組化，試圖找到一個能夠確切地區(qū)別幵的標記物，將會是解決這些診斷難題和選擇正確治療方法的關鍵。經(jīng)過大量的文獻閱讀，慎重篩選后得出的標記物。應用GFAP（膠質(zhì)纖維酸性蛋白）和Fas及FasL對細胞塊制備后進行免疫組織染色[8，9]，我們本次試驗結(jié)果顯示GFAP和Fas及FasL在在三組中的表達差異有統(tǒng)計學意義。運用組織塊標本來評估將作為診斷的一個輔助工具。

隨著分子診斷技術(shù)的進步，有關涎腺腫塊分子標志物檢測的研究不斷深入，對于涎腺腫塊的診斷、預后甚至選擇合適的治療方案均具有重要作用[1]。但是目前分子診斷技術(shù)多應用于手術(shù)后涎腺腫塊的診斷，不能進行早期診斷。本研究發(fā)現(xiàn)，在超聲引導下行腮腺組織FNAC并制作成細胞塊，結(jié)合分子標志物檢測，能早期診斷涎腺腫塊，具有操作簡便，創(chuàng)傷小，并發(fā)癥少的優(yōu)點，可以避免不必要的手術(shù)，在腮腺區(qū)腫塊診斷方面具有重要意義。

經(jīng)過本研究：在多形性腺瘤中的陽性表達以及在腺樣囊性癌中的無表達可以更加準確的區(qū)分這兩種在腮腺中常見的良、惡性腫瘤；能否尋求到新的，更加有效的鑒別腫瘤的指標，還有待進一步探究。