任百潔 姚紅英

牙周炎（periodontitis）是由多種因素導(dǎo)致的慢性破壞性疾病，同時(shí)也是發(fā)病率最高的口腔感染性疾病之一[1]。第四次口腔流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示我國80%～96%的成年人有不同程度的牙周問題[2]。由此可見，牙周炎已成為影響成年人口腔健康的首要原因。目前研究觀點(diǎn)認(rèn)為，牙菌斑及其產(chǎn)物的直接破壞途徑和宿主免疫反應(yīng)所造成的間接破壞途徑是造成牙周炎發(fā)生發(fā)展的兩大主要途徑[3]。因此使用藥物調(diào)節(jié)免疫炎癥反應(yīng)是治療牙周炎的關(guān)鍵之一。與抗生素相比，中草藥因其毒副作用小、藥理作用豐富得到了學(xué)者們的重視。提取中草藥中有效成分用以治療牙周疾病已成為現(xiàn)代研究的熱點(diǎn)。

雷公藤多苷（tripterygium wilfordii polyglycosides，TWP）是從傳統(tǒng)中藥-雷公藤根部提取而來的一種糖苷，其主要成分是環(huán)氧二萜內(nèi)酯[4]?，F(xiàn)代藥理研究表明，雷公藤多苷對T淋巴細(xì)胞有明顯的抑制作用，對自身免疫有調(diào)節(jié)作用[5]。利用雷公藤多苷免疫調(diào)節(jié)的作用，臨床上已將其用來治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，甲狀腺炎等疾病[6，7]。但目前尚未查到關(guān)于雷公藤多苷用以治療牙周疾病的報(bào)道。本研究通過絲線結(jié)扎建立大鼠實(shí)驗(yàn)性牙周炎模型，局部注射雷公藤多苷，探討其對大鼠實(shí)驗(yàn)性牙周炎的抑制作用及其可能的機(jī)制，為臨床治療牙周疾病提供依據(jù)。

資料和方法

1.主要實(shí)驗(yàn)材料與儀器設(shè)備：福爾馬林、氫氧化鈉、鹽酸、PBS緩沖液（北京化工廠，中國）；水合氯醛（原葉生物科技有限公司，上海）；Trizol（Magen，中國）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、qRT-PCR試劑盒（Takara，日本）；Cr、ALT、AST檢測試劑盒（南京建成科技有限公司，中國）；包埋機(jī)（TB-718E，英國）；石蠟切片機(jī)（FINESSE325，英國）；PCR儀（Thermo，美國）。

2.動(dòng)物選取及實(shí)驗(yàn)分組：選取24只雄性、6周齡的SD（Sprague Dawley）大鼠，體重范圍為220～250g。在12:12h的明/暗周期，24°C±2°C的環(huán)境下飼養(yǎng)大鼠，所有大鼠的飲食和飲水保持一致性。本實(shí)驗(yàn)通過了江蘇省倫理委員會(huì)審查。經(jīng)過一周的適應(yīng)性喂養(yǎng)（符合上述所有條件）后，除空白對照組的大鼠外，對所有大鼠進(jìn)行絲線結(jié)扎，將它們隨機(jī)分為4組（n＝6）：①空白對照組（稱為“NL”）；②結(jié)扎對照組（稱為“LC”）；③結(jié)扎+生理鹽水組（稱為“L+NaCl”）；④結(jié)扎+雷公藤多苷組（稱為“L+TWP”），于尾部進(jìn)行分組標(biāo)記（圖1.A）。

圖1 雷公藤多苷給藥對大鼠一般情況及肝腎功能的影響

3.大鼠實(shí)驗(yàn)性牙周炎模型的建立及給藥處理：大鼠實(shí)驗(yàn)性牙周炎模型建立方法如下：實(shí)驗(yàn)前一晚禁食不禁水，通過腹腔內(nèi)注射10%水合氯醛（當(dāng)天配置，避光保存）麻醉大鼠（0.35μL/100g劑量注射），自制擴(kuò)口器輔助張口，完全暴露雙側(cè)上頜第一磨牙，并使用牙齦分離器分離牙齦。用絲線將磨牙結(jié)扎一圈，確保絲線位于牙齦溝內(nèi)。L+TWP組及L+NaCl組分別于大鼠牙齦注射1mg·kg-1·d-1的雷公藤多苷和等體積的生理鹽水。

4.臨床指標(biāo)檢測及取材：注射給藥1周后，檢測各組大鼠簡化軟垢指數(shù)（debris index simplified，DIS）及齦溝出血指數(shù)（sulcus bleeding index，SBI）（具體檢測方法參照[8，9]，結(jié)果記錄評分標(biāo)準(zhǔn)如表1及表2）；去除軟垢后，使用尖端直徑為0.3毫米的圓頭探針測量探診深度（probing depth，PD），記號筆標(biāo)記探診探入末端，使用游標(biāo)卡尺精確記錄數(shù)值，最后進(jìn)一步檢測計(jì)算臨床附著喪失水平（clinical attachment level，CAL）（具體檢測方法參照[10]）。對腭側(cè)近中、遠(yuǎn)中和中央三個(gè)進(jìn)行評分，并計(jì)算平均值。處死大鼠，快速分離目標(biāo)牙的牙齦組織，標(biāo)準(zhǔn)選取為：橫向距離為目標(biāo)牙的近遠(yuǎn)中距離，寬度約為齦方2mm，每組隨機(jī)取3只置于-80℃冰箱中保存，另3只于福爾馬林固定并同時(shí)取其肝臟組織同樣進(jìn)行固定；亞甲藍(lán)染色骨組織觀察骨吸收情況。

表1 DIS評分標(biāo)準(zhǔn)

表2 SBI評分標(biāo)準(zhǔn)

5.生化指標(biāo)檢測：各組大鼠取其動(dòng)脈血，參照相應(yīng)試劑盒檢測方法檢測血清中肌酐（creatinine，Cr）、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanine aminotransferase，ALT）和天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartate aminotransferase，AST）水平。

6.qRT-PCR檢測牙周組織相關(guān)炎癥因子：根據(jù)Takara試劑盒說明對大鼠牙齦組織進(jìn)行qRT-PCR檢測，得到相應(yīng)OD值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。PCR引物序列為：β-Actin：F-GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTA，R-GACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG；IL-6：FAAGCCAGAGCTGCAGGATGAGTA，R-TGTCCTGCAGCCACTGGTTC；TNF-α：F-TTCCAATGGGCTTTCGGAAC，R-AGACATCTTCAGCAGCCTTGTGAG；IL-1β：F-CCCTGAACTCAACTGTGAAATAGCA，RCCCAAGTCAAGGGCTTGGAA。

7.組織學(xué)分析：取出置于福爾馬林中的大鼠牙齦組織和肝臟組織，流動(dòng)水沖洗1h，修整組織后常規(guī)梯度乙醇脫水，透明，浸蠟，石蠟包埋，切片厚度為4mm，伊木精-蘇紅染色后，光學(xué)顯微鏡下觀察牙齦組織和肝臟組織的病理變化。

8.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：所有數(shù)據(jù)均采用GraphPad Prism 7.00統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。通過卡方檢驗(yàn)和Student t檢驗(yàn)進(jìn)行比較。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差，P＜0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.大鼠一般情況及肝臟HE染色結(jié)果：給藥組大鼠和其余三組大鼠一般情況無差異，體型及代謝正常，體重穩(wěn)定增長，毛發(fā)光澤且活動(dòng)敏捷。肝臟HE染色顯示：各組大鼠的肝索結(jié)構(gòu)正常，肝細(xì)胞的形態(tài)沒有變化，未見炎細(xì)胞浸潤。血清生化檢測顯示：各組大鼠血清AST、ALT、Cr水平無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。

2.實(shí)驗(yàn)性牙周炎大鼠臨床指標(biāo)檢測結(jié)果：第7天，對每組大鼠進(jìn)行口腔檢查以評估其牙周炎癥和藥物的抗炎作用，并測量DIS、SBI、PD及CAL值。上頜第一磨牙的口腔內(nèi)臨床檢查顯示，結(jié)扎日（時(shí)間0）7天后，結(jié)扎組的牙齦顏色，質(zhì)地和形態(tài)與NL組不同，表現(xiàn)為大量的黃色軟垢附著在結(jié)扎絲線上，完全覆蓋了牙齒表面（圖2A）；去除這種軟垢后，牙齦顯示出炎癥，水腫，顏色變化和齦溝出血，牙周探診探診齦溝后，可見牙齦出血，溢出齦溝（圖2B）。LC組的DIS，SBI的變化顯著高于NL組（P＜0.05）。與LC組相比，L+NaCl及L+TWP組的DIS沒有觀察到顯著差異（P＞0.05）。L+NaCl與L+TWP組的SBI比較，發(fā)現(xiàn)有顯著差異（P＜0.05）（表3）。LC組的牙周袋深度和附著喪失水平與NL組相比顯著增加（P＜0.05）。與此同時(shí)，L+TWP組與L+NaCl組比較，PD及CAL值顯著降低（P＜0.05）（表3）。

圖2 牙周炎建模示意圖及牙周臨床指標(biāo)檢查圖

表3 各組牙周臨床指標(biāo)比較

3.qRT-PCR檢測結(jié)果：LC組中3個(gè)促炎細(xì)胞因子IL-1β，IL-6和TNF-αmRNA的表達(dá)量與NL比較均有顯著性差異（P＜0.05），且分別比NL組高約7.31，75.04和5.03倍。與L+NaCl組相比，L+TWP組中的IL-1β，IL-6和TNF-αmRNA表達(dá)顯著降低（P＜0.05）（圖3）。

圖3 雷公藤多苷對大鼠牙齦組織中IL-1β，IL-6和TNF-α mRNA表達(dá)的影響

4.牙齦及骨組織觀察結(jié)果：NL組的組織切片中觀察到正常的牙齦組織結(jié)構(gòu)，組織中未發(fā)現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤（圖4A）。LC組及L+NaCl組的切片見牙齦結(jié)締組織內(nèi)大量的中性粒細(xì)胞，淋巴細(xì)胞和漿細(xì)胞等炎癥細(xì)胞（圖4B，C）。L+雷公藤多苷組的牙齦組織接近正常組，炎癥反應(yīng)幾乎消失（圖4D）。與HE染色結(jié)果相似，L+雷公藤多苷組的骨組織吸收程度明顯低于LC組及L+NaCl組（圖4E-G）。

圖4 牙齦HE切片及單側(cè)上頜骨組織染色圖

討 論

本研究主要對雷公藤多苷抑制大鼠實(shí)驗(yàn)性牙周炎的作用效果進(jìn)行觀察，并進(jìn)一步分析其作用機(jī)制。

牙齦炎是牙周炎的早期癥狀，牙周探診出血是臨床診斷牙齦炎的金標(biāo)準(zhǔn)。本實(shí)驗(yàn)對大鼠雙側(cè)上頜第一磨牙進(jìn)行絲線結(jié)扎處理，對其DIS、SBI、PD及CAL進(jìn)行檢測，結(jié)果表明結(jié)扎構(gòu)建的炎癥環(huán)境是相同的，在相同軟垢刺激的條件下，雷公藤多苷組的牙齦炎癥明顯緩解，提示雷公藤多苷具有抑制牙齦炎癥的功能。我們在牙齦組織切片及亞甲藍(lán)染色的上頜組織中觀察到了相同的抗炎效果：應(yīng)用雷公藤多苷實(shí)現(xiàn)了局部微環(huán)境中炎癥的抑制。

牙周炎是多種因素造成的炎性感染性疾病，細(xì)胞因子（IL-1β，IL-6和TNF-α等）介導(dǎo)的免疫炎癥反應(yīng)是導(dǎo)致牙周炎癥進(jìn)一步發(fā)展的重要因素[11～13]。目前有效的牙周治療手段包括牙周潔治刮治、翻瓣術(shù)、引導(dǎo)性骨組織再生術(shù)等主要致力于消除菌斑，忽視了針對免疫炎癥反應(yīng)的干預(yù)，故治療效果總是差強(qiáng)人意。針對炎癥較重的牙周病患者，臨床常輔以藥物治療。但現(xiàn)今臨床上治療牙周炎的藥物主要以抗生素為主，長期應(yīng)用易產(chǎn)生耐藥菌和胃腸道反應(yīng)等副作用，因此副作用小的中藥提取物具有臨床研究意義。藥理研究顯示[14]，雷公藤多苷具有抗炎、免疫抑制和抗腫瘤等多方面的功能。艾燕等[15～17]研究表明，雷公藤多苷可通過抑制TNF-α及IL-1β等促炎細(xì)胞因子水平實(shí)現(xiàn)治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，結(jié)腸炎及腎炎等疾病。我們對大鼠牙齦組織進(jìn)行qRTPCR檢測，結(jié)果顯示雷公藤多苷可以抑制IL-1β，IL-6和TNF-α的表達(dá)，從而對牙周組織炎癥產(chǎn)生積極而有效的對抗及治療作用。因此，雷公藤多苷可能成為抑制牙周炎的有效藥物。但是相對于雷公藤多苷的副作用[18]，其用于牙周治療帶來的益處是否足以支持其作為牙周治療用藥呢？研究發(fā)現(xiàn)，雷公藤藥物的最大安全劑量為40g·d-1[19]。Sen等[20]使用12mg·kg-1·d-1的雷公藤多苷對大鼠進(jìn)行灌胃后，對其血清ALT和AST進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)與正常對照組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。我們的實(shí)驗(yàn)再次驗(yàn)證了該說法，給藥組大鼠與其他大鼠血清中Cr、AST和ALT的檢測結(jié)果無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。此外，F(xiàn)eng等[21]研究發(fā)現(xiàn)，小劑量使用雷公藤多苷甚至可通過腎臟代謝和抗炎作用改善腎功能和結(jié)構(gòu)改變?？梢娫诤侠矸秶鷥?nèi)使用雷公藤多苷并無毒副作用。本實(shí)驗(yàn)藥物使用劑量為1mg·kg-1·d-1，遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于安全劑量，因此本實(shí)驗(yàn)使用的藥物劑量對大鼠相對安全。

綜上所述，雷公藤多苷的應(yīng)用可以抑制牙齦組織炎癥及骨吸收的發(fā)生發(fā)展，這與其調(diào)控多種炎癥細(xì)胞因子表達(dá)有關(guān)，提示雷公藤多苷可以作為牙周炎早期治療的潛在輔助用藥。雷公藤多苷的應(yīng)用既可以彌補(bǔ)傳統(tǒng)治療的不足，強(qiáng)化宿主炎癥的抑制，又不易產(chǎn)生毒副作用，且藥理作用豐富，因此應(yīng)用雷公藤多苷治療牙周炎具有研發(fā)意義。但應(yīng)用于臨床，還需更多的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)對其抑制骨吸收的作用機(jī)制及肝腎損傷等做更為深入的實(shí)驗(yàn)研究。