饒 丹

（信陽農(nóng)林學(xué)院牧醫(yī)工程學(xué)院，河南信陽 464000）

豬繁殖與呼吸綜合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS）是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）引起的危害母豬繁殖系統(tǒng)和仔豬呼吸系統(tǒng)的一類烈性傳染病。1987年，美國首次在商品豬中報告豬繁殖與呼吸綜合征病毒，此后該疾病頻繁發(fā)生并迅速蔓延到世界各地[1]。1995年我國第一次分離到PRRSV，此后，該病毒又在我國多地豬場中被發(fā)現(xiàn)[2]。PRRS對養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)效益的影響主要是導(dǎo)致母豬產(chǎn)仔率下降和斷奶仔豬數(shù)減少。生長育肥豬感染PRRSV后可能會增加繼發(fā)感染其他疫病的概率，最終造成死亡率增加，此外，治愈豬只則表現(xiàn)生長遲緩、屠宰豬年齡體重高度分散[3]。2006年，我國出現(xiàn)高致病性PRRSV引起豬無名高熱，致使大量豬死亡[4]。2014年，NADC30-like毒株的發(fā)現(xiàn)是該病毒毒株出現(xiàn)的又一次重大變異，其結(jié)果是使用現(xiàn)有的商品化疫苗接種效果不好，給PRRS防控帶來新的難度[5]。

PRRSV屬于尼多病毒目（Nidovirales）、動脈炎病毒科（Arterividae）、動脈炎病毒屬[6]，本病毒有囊膜且病毒粒子呈卵圓形，直徑50～65 nm，結(jié)構(gòu)為二十面體。PRRSV包含10個開放閱讀框：ORF1a、ORF1b、ORF2a、ORF 3-5、ORF2b、ORF 5a 和 ORF 6-7。ORF1a和ORF1b編碼至少16個非結(jié)構(gòu)蛋白：nsp1α、nsp1β、nsp2、nsp2TF、nsp2NF、nsp3-6、nsp7α、nsp7β、nsp8-12。GP3和GP5在結(jié)構(gòu)蛋白中也是高度可變的。nsp2、GP3和GP5常用于遺傳變異和分子流行病學(xué)的系統(tǒng)發(fā)育分析[7]。由于遺傳和抗原的差異，PRRSV分為：歐洲型（EU型，1型）和美洲型（NA型，2型）。我國主要以PRRSV 2的流行為主[8]。

近年來PRRSV不斷發(fā)生變異，給養(yǎng)豬業(yè)造成難以估計的損失。為了更好地了解南陽地區(qū)該病的遺傳變異情況以及為該地區(qū)的防控提供科學(xué)的依據(jù)，本研究對南陽地區(qū)疑似PRRS病料樣品進(jìn)行ORF5基因序列測定，同時參考國內(nèi)外已知的基因序列繪制國內(nèi)外PRRS的遺傳進(jìn)化關(guān)系示意圖，分析南陽地區(qū)PRRSV的遺傳變異規(guī)律，為我國PRRS的防控提供相關(guān)的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

于2021年在河南南陽（NY）地區(qū)采集8份疑似PRRS豬的脾臟、肺臟、肺門淋巴結(jié)等組織，并于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑

Trans2K DNA Marker購自北京全式金生物技術(shù)股份有限公司；Simply P病毒DNA/RNA提取試劑盒購自杭州博日科技股份有限公司；pMD18-T載體購自寶生物工程（大連）有限公司；氨芐青霉素購自Solarbio；膠回收試劑盒購自O(shè)MEGA；大腸桿菌TOP10感受態(tài)細(xì)胞購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.3 引物設(shè)計

參考GenBank中發(fā)表的PRRSV ORF5基因序列，設(shè)計出擴(kuò)增目的片段約為704 bp的特異性引物：GP5-F：5’-GTTTTAGCCTGTCTTTTTGCC-3’；GP 5-R：5’-AAGGTGCTTTTGGCGTTTTC-3’。引物由蘇州泓迅生物科技股份有限公司合成。

1.4 ORF5基因的擴(kuò)增及克隆

無菌采集患病豬的淋巴結(jié)、脾臟等組織作為病料，取1 g置于1.5 mL的EP管中，并用手術(shù)剪剪碎，加入沒過2/3病料組織的0.9%生理鹽水；研磨后勻漿，8 000 rpm離心3 min；取上清液置于一新的1.5 mL EP管中，并按核酸提取試劑盒要求操作提取總RNA。以其為模板，采用AMV反轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄制備cDNA。以cDNA為模板，GP5-F/GP5-R為引物，PCR擴(kuò)增ORF5基因。參數(shù)如下：95℃3 min；95℃30 s、56℃30 s、72℃1 min，34個循環(huán)；72℃5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測并用凝膠回收試劑盒回收，克隆于pMD18-T載體中，陽性重組質(zhì)粒送祥音生物科技有限公司進(jìn)行測序。

1.5 序列分析

參考GenBank登錄的國內(nèi)外PRRSV參考病毒株序列，利用DNA Star、MegAligen、MEGA 5.1軟件對不同病毒株的ORF5基因序列進(jìn)行比較分析，繪制PRRSV遺傳演化圖。PRRSV參考毒株信息見表1。

表1 PRRSV參考毒株信息

2 結(jié)果與分析

2.1 ORF5基因的RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果

對采集的疑似PRRS病料樣品采用特異性引物進(jìn)行PRRSV ORF5基因的RT-PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示，從患病仔豬的病料中擴(kuò)增出8份陽性樣品，分別命名為THX01、THX02、THX03、THX04、XYX05、XYX06、XYX07、XYX08。瓊脂凝膠電泳檢測結(jié)果與預(yù)期相符（圖 1）。

圖1 疑似PRRS病料樣品ORF5基因RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.2 ORF5基因核酸遺傳進(jìn)化分析

對得到的8份陽性樣品的基因測序均得到預(yù)期704 bp的片段。為分析各病毒株間遺傳進(jìn)化情況，采用DNA Star軟件對獲得的8個完整的ORF5基因序列及23個從GenBank下載的國內(nèi)外參考病毒株序列進(jìn)行多序列比較，構(gòu)建南陽地區(qū)PRRSV毒株的遺傳進(jìn)化關(guān)系圖（圖2）。結(jié)果顯示，進(jìn)化樹分為2大支，即以VR-2332為代表的美洲型分支和以Lelystad virus為代表的歐洲型分支。其中，美洲型又可進(jìn)一步分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ等5個亞型，代表毒株為NADC30、GM2、CH-1a、VR-2332和 HUN4表示。THX01、THX03、THX04、XYX05、XYX06、XYX07、XYX08 與 NADC30、JL580處于同一分支，親緣關(guān)系較近屬于Subgroup I。THX02與HUN4、JXA1等的高致病性代表毒株處于同一分支，親緣關(guān)系較近屬于Subgroup V。

圖2 PRRSV ORF5基因遺傳進(jìn)化分析

2.3 GP5蛋白的氨基酸比對分析

目前已確定的美洲型病毒株GP5蛋白的表位有3個，2個為非中和表位（aa27～aa30和 aa180～aa197）如圖3實線框表示；1個為中和表位（aa37～aa45）如圖3虛線框；2個重要的抗原相關(guān)區(qū)域：胞外域（aa27～aa41）和C末端（aa180～aa197）。結(jié)果如圖3，與V-R2332毒株相比，在非中和表位27～30位氨基酸，主要是第27和29位氨基酸發(fā)生突變；與美洲型代表毒株VR-2332相比，THX01、THX04、XYX05、XYX06、XYX07、XYX08的第27位氨基酸V突變?yōu)锳。而這6株與NADC30、JL580、CHsx1401一致。在第28位氨基酸處只有XYX08株發(fā)生突變，由L突變?yōu)镕。在第29位氨基酸處與美洲型代表毒株VR-2332相比，XYX05、XYX06 和 XYX07 的 A29T，THX01、THX02、THX03、THX04、XYX08 與 RespPRRS-MLV、CH-1a、CH-1R、HUN4、JXwn06、JXA1、JXA1-P80、QYYZ、GDsg、NADC30、JL580、CHsx1401一致。在aa180～aa197中，在 185位 8個毒株與 HUN4、JXwn06、JXA1、JXA1-P80、QYYZ、GDsg、NADC30、JL580、CHsx1401一致，但與VR-2332相比發(fā)生V突變?yōu)锳；在第189位，THX01、THX03、THX04、XYX05、XYX06、XYX07和 XYX08與 Resp-PRRS-MLV、QYYZ、NADC30、JL580、CHsx1401 一致，但與VR-2332相比發(fā)生I突變?yōu)閂。THX02與CH-1a、CH-1R、HUN4、JXwn06、JXA1、JXA1-P80、GDsg一致，但與VR-2332相比發(fā)生I突變?yōu)長；在第191位，THX01、THX04、XYX05、XYX06、XYX07與QYYZ、NADC30、JL580、CHsx1401一致，但與VR-2332相比發(fā)生R突變?yōu)镵。THX02、THX03、XYX08與VR-2332一致；在第192位，8個毒株與VR-2332相比發(fā)生V突變?yōu)镮；在第196位，THX02與QYYZ一致，與VR-2332相比發(fā)生Q突變?yōu)镽。在中和表位aa37～aa45，主要突變發(fā)生在39位，THX02與HUN4、JXwn06、JXA1、JXA1-P80、GDsg一致，但與VR-2332相比發(fā)生L突變?yōu)镮。在第41、44位，XYX05、XYX06、XYX07與VR-2332相比分別發(fā)生L突變?yōu)镾、N突變?yōu)镵?？傮w來說，本試驗8株與美洲型代表毒株相比，在非中和表位aa27～aa30中，發(fā)生V突變?yōu)锳、A突變?yōu)門、L突變?yōu)镕；和非中和表位aa180～aa197中，發(fā)生185位的V突變?yōu)锳、189位的I突變?yōu)閂、189位的I突變?yōu)長、191位的R突變?yōu)镵、192位的V突變?yōu)镮、196位的Q突變?yōu)镽。在中和表位aa37～aa45，發(fā)生39位的L突變?yōu)镮、41位的L突變?yōu)镾、44位的N突變?yōu)镵。顯示基因間的突變，最終與其病毒的毒力差異相關(guān)。

圖3 PRRSV GP5蛋白氨基酸比對分析

3 討論

第一個PRRSV毒株（VR-2332）于1992年在北美洲被分離，第一個中國毒株（CH-1a）于1996年被報道以來，該病毒給我國養(yǎng)豬場造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[9]。PRRSV變異快，各毒株之間存在較大差別。一般變異出現(xiàn)的中間型新毒株，其抗原表位發(fā)生突變，影響抗原抗體相互結(jié)合，致使PRRSV的疫苗免疫效果較差或失敗。

因此，通過對南陽地區(qū)的PRRSV GP5分離株的序列變異進(jìn)行研究，為合理選擇疫苗和PRRSV防控措施提供科學(xué)依據(jù)。Zhang等[10]報道了近年來中國豬群中出現(xiàn)PRRSV的2個新的基因亞型：Ⅲ型和Ⅳ型。Li等[4]報道，我國的豬群在2013年就出現(xiàn)了NADC30-like毒株，該毒株可使母豬發(fā)熱、流產(chǎn)。系統(tǒng)發(fā)育分析表明2型PRRSV分離株可分為5個亞屬類型（I、II、III、IV和V），這些亞屬類型的代表毒株分別為 NADC30、VR-2332、GM2、CH-1a和JX1A。在試驗中觀察到THX02與HUN4、JXA1等的高致病性代表毒株處于同一分支屬于 Subgroup V。THX01、THX03、THX04、XYX05、XYX06、XYX07和XYX08與變異毒株NADC30處于同一分支屬于Subgroup I。對GP5蛋白氨基酸變異進(jìn)行分析后，發(fā)現(xiàn)GP5蛋白的3個表位區(qū)域存在較多的氨基酸變異，說明基因之間的變化與兩者之間的毒力有關(guān)。這些氨基酸位點(diǎn)的突變大概會致使GP5蛋白免疫原性產(chǎn)生變化，也可能導(dǎo)致疫苗免疫效價變低甚至無效，最終使豬場的疫苗免疫失效。

4 小結(jié)

在河南南陽地區(qū)分離的8株繁殖與呼吸綜合征病毒的GP5分離株，1株THX02屬于高致病性毒株，其余7株屬于變異毒株，說明南陽地區(qū)豬場中豬繁殖與呼吸綜合征病毒的高致病性毒株仍在流行，同時有PRRSV變異株出現(xiàn)，因此有必要實時監(jiān)測PRRSV的毒株流行情況，為該地區(qū)防控PRRS提供參考。