林騰奕，陳思敏，羅欣陽，姚澤平

（廣東省食品檢驗(yàn)所（廣東省酒類檢測中心），廣東廣州 510435）

紅曲在我國生產(chǎn)和使用的歷史悠久，在李時(shí)珍的《本草綱目》中就有記錄，現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥領(lǐng)域。其在生長過程中能產(chǎn)生多種生理活性物質(zhì)，作用為降血脂、調(diào)節(jié)免疫、抗微生物活性、降低膽固醇、抗腫瘤等，所以以紅曲為原料的保健食品受到市場歡迎。但1995 年法國Blanc 發(fā)現(xiàn)紫紅曲菌CBS 10907 和紅曲菌Van Tieghen，隸屬于紅曲菌株，其能產(chǎn)生具有腎毒性和會導(dǎo)致畸、癌作用的真菌毒素桔青霉素，紅曲產(chǎn)品的質(zhì)量安全引起了各國的關(guān)注，并且相關(guān)研究在逐漸增多。桔青霉素（Citrinin）是由紅曲霉和多種青霉絲狀霉菌通過代謝產(chǎn)生的真菌毒素，主要存在于常見糧食作物里如谷物、大米、玉米等，分子式為CH1O（結(jié)構(gòu)式見圖1），不僅具有抑菌作用，同時(shí)還會對人畜造成明顯的肝、生殖、腎毒性。除此以外，桔青霉素（Citrinin）還能和赭曲霉毒素、展青霉素等毒素發(fā)生協(xié)同作用，增加人畜感染率。由于毒性，各國對于其限量都有嚴(yán)格限制，如日本紅曲色素里的桔青霉素限值為0.2 mg/kg；美國食品藥品管理局提出，食品添加劑中的紅曲色素必須檢測桔青霉素，符合質(zhì)量要求的才能添加入食品中；一些歐洲國家在擬定關(guān)于中國出口紅曲的標(biāo)準(zhǔn)，必須鑒定產(chǎn)生紅曲霉的菌株，并且桔青霉素的含量必須進(jìn)行檢測，達(dá)到要求的紅曲產(chǎn)品才能在歐洲進(jìn)口和銷售。綜上所述，我國紅曲出口的瓶頸是桔青霉素，準(zhǔn)確檢測紅曲中桔青霉素的量值是一個(gè)亟待解決的問題。

圖1 目標(biāo)化合物的結(jié)構(gòu)式

根據(jù)國食藥監(jiān)許[2010]2 號通知，申請以紅曲為原料的保健食品注冊，須提供紅曲菌株和紅曲米原料的桔霉素檢測報(bào)告。桔青霉素的分析檢測方法主要有熒光分光光度法、薄層色譜法（TLC）、高效液相色譜法（HPLC）、酶聯(lián)免疫測定法（ELISA）和高效毛細(xì)管電泳法（HPCE）等。上述方法靈敏度較低，而保健食品的樣品成分繁多且復(fù)雜，例如含有多種結(jié)構(gòu)的功效成分，雜峰較多，難以保證數(shù)值的準(zhǔn)確性，而且采用上述方法進(jìn)行檢測回收率低。目前保健食品桔青霉素的檢測，都是依據(jù)企標(biāo)來檢驗(yàn)，存在操作不規(guī)范且種類繁多，無法有效的檢測出產(chǎn)品中的準(zhǔn)確含量。而國標(biāo)和《保健食品檢驗(yàn)與評價(jià)技術(shù)規(guī)范》（2003年版）都只使用熒光檢測器，只能用保留時(shí)間來判定是否為桔青霉素，很容易因?yàn)闃悠冯s峰多影響定性。國標(biāo)里的前處理方法是使用免疫親和柱，雖然有較好的凈化效果，但價(jià)格較高，前處理時(shí)間長，大批量檢測時(shí)效率低。本研究查詢文獻(xiàn)，用70 %甲醇水提取后用HLB固相萃取小柱凈化，運(yùn)用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測紅曲產(chǎn)品中的桔青霉素。該方法檢測時(shí)間短、檢測成本低、定量準(zhǔn)確、可操作性強(qiáng)，增加保健食品的安全性、有效性和可靠性。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

紅曲樣品：某品牌產(chǎn)品，市售。

試劑及耗材：桔青霉素標(biāo)準(zhǔn)品10 mg，純度為＞99 %，購自Pribolab；實(shí)驗(yàn)用乙腈（lc-ms）購自德國Merck；乙酸銨（色譜純）購自美國fisher 公司；甲酸購自阿拉丁，水為超純水。

儀器設(shè)備：AB Sciex Triple Quad?4500 質(zhì)譜系統(tǒng)、三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國SCIEX）含ESI 源和APCI 源，analyst 色譜工作站；ika 渦旋混合器；高速離心機(jī)；分析天平；氮吹儀；微纖維濾紙，hlb小柱。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取一定量的桔青霉素標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇溶解，配成濃度為100 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，于4 ℃下保存，吸取儲備液用乙腈-水（V∶V=3∶7）溶液配制成5個(gè)標(biāo)準(zhǔn)濃度的工作溶液，配制的工作溶液濃度分別為5 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL?？瞻讟悠反_定不含任何上述的成分，用空白樣品提取液稀釋配制成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，以評價(jià)基質(zhì)效應(yīng)的影響。

1.2.2 樣品前處理

樣品提?。壕芊Q取樣品粉末1.00 g，置于50 mL離心管中，加甲醇-水（70∶30）5 mL，高速振蕩提取2 min，8500 r/min 離心3 min，微纖維濾紙過濾取2 mL，加純水稀釋至15 mL，振搖1 min，靜置2 min，即得提取液。

樣品凈化：移取上述提取液,調(diào)節(jié)壓力使溶液以每秒1～2 滴的速度通過HLB 柱，直至2～3 mL空氣通過柱體，再以3 mL 水淋洗，直至2～3 mL 空氣通過柱體，棄去流出液。加入5.0 mL 甲醇洗脫，收集洗脫液于玻璃試管中，于40 ℃下氮?dú)獯抵粮珊?，? mL 乙腈+水（3∶7）溶解殘?jiān)?.22 μm 微孔濾膜過濾供檢測用。

1.2.3 檢測參數(shù)

1.2.3.1 色譜條件

色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C（2.1×100 mm，1.7 μm）美國waters 公司；柱溫：35 ℃；流動相B：含有0.1%甲酸的乙腈溶液，流動相C：含有0.1%甲酸的水溶液；色譜梯度洗脫條件：0～1.50 min，70%B；1.50～4.50 min，70 %～95 %B；4.50～6.00 min，95%B；6.00～6.50 min，90%～70%B；6.50～8.0 min，70%B；進(jìn)樣量：1 μL；流速為0.3500 mL/min。

1.2.3.2 質(zhì)譜條件

可加熱的ESI 離子源；正離子模式檢測；掃描方式是MRM（多反應(yīng)監(jiān)測模式）；氣簾氣壓力（CUR）：35.0，霧化溫度（TEM）：500，霧化氣壓力：50，碰撞氣壓力（CAD）：6，離子噴霧電壓：5500 V，其他質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 桔青霉素的多反應(yīng)監(jiān)測參數(shù)

2 結(jié)果與分析

2.1 儀器條件的優(yōu)化

2.1.1 質(zhì)譜條件的考察

采用20 ng/mL 待測化合物標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別在正、負(fù)離子模式下進(jìn)行全掃描對比，桔青霉素在正離子模式響應(yīng)下較高。優(yōu)化去簇電壓，碰撞電壓，讓母離子的響應(yīng)達(dá)到最高，使用子離子模式篩選響應(yīng)最好的2 個(gè)子離子，并且運(yùn)用反應(yīng)監(jiān)測模式優(yōu)化出最適合子離子產(chǎn)生的碰撞能量。根據(jù)歐盟2002/657/EC 號決議中關(guān)于殘留物分析方法定性確證的要求（見表2），化合物的質(zhì)譜定性離子必須出現(xiàn)，至少應(yīng)包括一個(gè)母離子和兩個(gè)子離子。此外，定性離子和定量離子的相對豐度比與濃度相當(dāng)?shù)臉?biāo)準(zhǔn)溶液比，要在允許的偏差范圍內(nèi)，才判定為樣品中含有桔青霉素。

表2 定性時(shí)相對離子豐度的最大允許偏差

2.1.2 色譜條件的優(yōu)化

本研究采用同樣濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液分別考察了0.1 %甲酸水和甲醇；0.1 %甲酸水和乙腈；0.1 %甲酸水和0.1 %甲酸乙腈；0.01 mol/L 乙酸銨和0.1 %甲酸乙腈作為流動相，對桔青霉素的峰型及靈敏度的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，由于桔青霉素在C色譜柱上保留較強(qiáng)，當(dāng)選用甲醇做流動相時(shí)，半峰寬較大，色譜峰拖尾嚴(yán)重，而且洗脫時(shí)間較長。乙腈洗脫能力較甲醇強(qiáng)，故選用乙腈作為洗脫溶劑。接著比較乙腈-0.1%甲酸水溶液，0.1%甲酸水和0.1%甲酸乙腈和0.01 mol/L 乙酸銨和0.1 %甲酸乙腈作為流動相時(shí)，對目標(biāo)物質(zhì)靈敏度的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，選用0.1 %甲酸水為流動相，能夠顯著增加桔青霉素的響應(yīng)值，可能是甲酸流動相能夠增強(qiáng)羧基的電離，有助于離子化效率的提高。而0.1%甲酸乙腈調(diào)節(jié)pH 系統(tǒng)，改善峰形，增加化合物在色譜柱里面的保留。另外，使用0.01 mol/L 乙酸銨的流動相目標(biāo)峰附近會出現(xiàn)雜峰，影響定性。因此，最終選用0.1%甲酸水和0.1%甲酸乙腈溶液為流動相進(jìn)行分析。

桔青霉素的分子結(jié)構(gòu)中有兩個(gè)羧基，極性較強(qiáng)，經(jīng)過比較不同型號的色譜柱，本研究最終采用ACQUITY UPLC BEH C用于后續(xù)的方法學(xué)建立和有效性確證實(shí)驗(yàn)。

2.2 凈化方式的選擇

紅曲類保健品基質(zhì)非常復(fù)雜，含有大量的色素、磷脂、硬脂酸、添加劑等，復(fù)雜的樣品基質(zhì)給凈化帶來了困難。桔青霉素分子結(jié)構(gòu)中存在兩個(gè)羧基，極性較大。采用固相萃取凈化手段，分別使用桔青霉素免疫親和柱和HLB 進(jìn)行前處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩者的回收率相差不大，因此選擇前處理更為簡便的HLB前處理。

2.3 基質(zhì)效應(yīng)考察

取陰性樣品，經(jīng)“1.2.2”方法處理后，得到空白基質(zhì)提取凈化液，用此基質(zhì)提取凈化液配成5～100 ng/mL 基質(zhì)提取凈化標(biāo)準(zhǔn)工作液。與標(biāo)準(zhǔn)品溶液對比，基質(zhì)溶液中桔青霉素的響應(yīng)降低，說明樣品基質(zhì)使得桔青霉素的離子化受到抑制，可能是溶液的離子強(qiáng)度影響了分析物活度系數(shù)，故本研究采用配制基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液的方法，可以較好地去除基質(zhì)效應(yīng)帶來的干擾和影響。

以優(yōu)化后的方法對目標(biāo)物進(jìn)行分離，見圖2。

圖2 標(biāo)準(zhǔn)溶液MRM色譜圖

2.4 定量測定方法學(xué)考察

2.4.1 專屬性考察

將標(biāo)準(zhǔn)品溶液、溶劑空白（純甲醇）和基質(zhì)空白液進(jìn)樣，在桔青霉素出峰位置，溶劑空白（純甲醇）和基質(zhì)空白液沒有干擾，表明方法專屬性符合要求。

2.4.2 方法的線性范圍

在優(yōu)化條件下，對6 個(gè)濃度水平的系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)行測定。以濃度為橫坐標(biāo)，定量離子峰面積為縱坐標(biāo)作圖，在線性范圍5～100 ng/mL具有良好的線性關(guān)系y=1263.33757 x+1143.95025，相關(guān)系數(shù)大于0.999。

2.4.3 檢出限與定量限測定

取標(biāo)準(zhǔn)品溶液用基質(zhì)空白液稀釋，計(jì)算桔青霉素定量離子色譜峰的信號噪聲比（s/n），結(jié)合稱樣量和定容體積折算，根據(jù)信噪比S/N=3 為該物質(zhì)的檢出限（LOD）為12.5 μg/kg，根據(jù)S/N=10 為該物質(zhì)的定量限（LOQ）為37.5 μg/kg。

2.4.4 儀器精密度考察

把濃度為50 ng/mL 的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液按照1.2.3的儀器條件持續(xù)進(jìn)樣6 次，用定量離子的色譜峰面積來分析儀器的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation,RSD)，RSD 為2.7 %，表明儀器精密度符合要求。

2.4.5 方法重復(fù)性考察

精密稱取6 份樣品，按照樣品制備方法前處理，以6 份樣品中桔青霉素定量離子色譜峰面積來計(jì)算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation,RSD)，RSD為2.8%，表明方法重復(fù)性較好。

2.4.6 加標(biāo)回收率考察

選用陰性紅曲類保健品進(jìn)行回收率試驗(yàn)。稱取保健品粉末1.0 g，添加濃度為37.5 μg/kg、87.5 μg/kg、125 μg/kg 的標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個(gè)濃度平行2次，計(jì)算回收率（見表3）。

表3 實(shí)際樣品中桔青霉素殘留量回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=2)

3 結(jié)論

本研究對測定紅曲類保健食品中桔青霉素進(jìn)行了探討，采用較為簡便的HLB 前處理法，對液質(zhì)條件進(jìn)行了優(yōu)化，通過對方法的回收率、重復(fù)性、精密度進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，均滿足要求。方法靈敏度高、重現(xiàn)性和線性相關(guān)性均滿足要求，檢出限較低就可以檢測保健食品中微量的桔青霉素，增加保健食品中桔青霉素的檢測方法，實(shí)驗(yàn)用時(shí)短可以用于批量、快速檢測保健品里桔青霉素的含量。另外，桔青霉素存在傷害人體的風(fēng)險(xiǎn)，故2010 年，國家食品藥品監(jiān)督管理總局發(fā)布以紅曲為原料保健食品產(chǎn)品申報(bào)與審評的通知（國食藥監(jiān)許[2010]）2 號），增加了指標(biāo)桔青霉素的測定，限量暫時(shí)制定為50 μg/kg。本文對市售常見廠商的3 批紅曲類保健品進(jìn)行測定，為保健食品注冊樣品，未檢出桔青霉素。但是需要加大對市售保健食品檢測量，進(jìn)一步累積數(shù)據(jù)，才能開展風(fēng)險(xiǎn)評估工作。