■張海靜 姜麗君 張 敏 楊 哲 鄧雨欣 索文靜 李宏軍

（山東理工大學(xué)農(nóng)業(yè)工程與食品科學(xué)學(xué)院，山東 淄博 255049）

隨著畜牧業(yè)的快速發(fā)展，動(dòng)物飼料的匱乏成為主要的制約因素。因此，對(duì)工業(yè)廢棄物進(jìn)行開發(fā)利用作為蛋白飼料資源成為近些年飼料工業(yè)研究的重要熱點(diǎn)，這不僅從根本上解決了環(huán)境污染問題，還從源頭上解決了飼料短缺的問題[1]。以工業(yè)廢棄物作為發(fā)酵底物，利用多種微生物進(jìn)行發(fā)酵，可彌補(bǔ)飼料中缺乏的氨基酸種類，同時(shí)對(duì)飼料中的其他營養(yǎng)成分進(jìn)行轉(zhuǎn)化，如將大分子蛋白分解成小分子多肽；將纖維素、果膠分解成單糖或寡糖等，不僅提高了飼料的蛋白質(zhì)含量，還產(chǎn)生一些有益活性物質(zhì)，改善了飼料的風(fēng)味，有利于動(dòng)物消化吸收和利用，提高了動(dòng)物的適口性和免疫力。

中國是傳統(tǒng)的農(nóng)業(yè)大國，據(jù)國家統(tǒng)計(jì)局?jǐn)?shù)據(jù)顯示，2020年全國醬油生產(chǎn)量高達(dá)700.8萬噸，同比增長(zhǎng)3%，若以每生產(chǎn)1 kg醬油就有0.67 kg含水75%的醬油渣計(jì)算，會(huì)產(chǎn)生400多萬噸的醬油渣[2]。醬油渣中含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，如約20%～30%粗蛋白質(zhì)，20%～30%粗纖維，8%～10%粗脂肪和豐富的大豆異黃酮等[3-4]，具有作為動(dòng)物飼料資源的潛力。目前對(duì)醬油渣的利用主要有利用脂肪酶脫酸制備生物催化劑[5]，在超臨界條件下制備生物柴油[3]，對(duì)醬油渣中油脂、抗氧化活性物質(zhì)的提取等[6-7]。醬油渣水分含量高易腐敗，并且含有較高的粗纖維和粗蛋白，造成動(dòng)物適口性和消化吸收率差，這些是影響醬油渣飼料化應(yīng)用的重要限制因素。目前醬油渣發(fā)酵制備飼料主要通過單菌光照發(fā)酵[4]和雙菌屬混合發(fā)酵[8]，發(fā)酵產(chǎn)物中蛋白質(zhì)含量較低和粗纖維含量較高，不利于動(dòng)物消化吸收。由于擠壓技術(shù)能夠很好地改善蛋白質(zhì)的性質(zhì)和纖維的結(jié)構(gòu)組成，因此本試驗(yàn)采用擠壓技術(shù)對(duì)醬油渣進(jìn)行預(yù)處理，再通過多種菌屬進(jìn)行發(fā)酵來生產(chǎn)蛋白質(zhì)飼料。

本研究旨在對(duì)擠壓醬油渣制備蛋白飼料的發(fā)酵工藝條件優(yōu)化。通過前期試驗(yàn)確定黑曲霉、枯草芽孢桿菌、產(chǎn)朊假絲酵母和白地霉最佳菌種配比；通過Plackett-Burman試驗(yàn)、最陡爬坡試驗(yàn)和中心組合試驗(yàn)確定最佳培養(yǎng)基組成，在此優(yōu)化條件下對(duì)接種量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間和裝瓶量四個(gè)因素進(jìn)行單因素試驗(yàn)和Box-Behnken 試驗(yàn)優(yōu)化，以發(fā)酵產(chǎn)物的真蛋白和粗纖維作為考察指標(biāo)，得到最優(yōu)發(fā)酵工藝條件，為擠壓醬油渣固態(tài)發(fā)酵制備蛋白質(zhì)飼料提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

醬油渣（原料為65%的豆粕和35%小麥，加入17%食鹽經(jīng)循環(huán)澆淋法制取醬油而得）由山東玉兔食品有限責(zé)任公司提供；黑曲霉3.324 和枯草芽孢桿菌由沂源康源生物科技有限公司提供；白地霉1315 和產(chǎn)朊假絲酵母1314購于中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心；試驗(yàn)所用試劑均為分析純，購買于國藥化學(xué)試劑有限公司。

1.2 常規(guī)培養(yǎng)基

黑曲霉3.324液體種子培養(yǎng)基采用改良馬丁培養(yǎng)基；枯草芽孢桿菌液體種子培養(yǎng)基采用LB培養(yǎng)基；產(chǎn)朊假絲酵母1314和白地霉1315液體種子培養(yǎng)基采用YPD培養(yǎng)基。

1.3 主要儀器與設(shè)備

單螺桿擠壓機(jī)，山東理工大學(xué)農(nóng)產(chǎn)品精深加工與貯藏實(shí)驗(yàn)室自制；K9860 型全自動(dòng)凱氏定氮儀，濟(jì)南海能儀器股份有限公司。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 擠壓醬油渣的制備

前期試驗(yàn)研究得出醬油渣最佳擠壓條件為：擠壓溫度為103 ℃，水分含量為34%和螺桿轉(zhuǎn)速為98 r/min。

1.4.2 真蛋白含量的測(cè)定

真蛋白含量的測(cè)定參考李佳瑤等[9]方法。

1.4.3 粗纖維含量的測(cè)定

粗纖維含量的測(cè)定參考Al-Sheraji等[10]方法。

1.4.4 發(fā)酵條件單因素試驗(yàn)

以黑曲霉∶枯草芽孢桿菌∶產(chǎn)朊假絲酵母∶白地霉=3∶2∶1∶3為混合菌種配比，發(fā)酵培養(yǎng)基組成為葡萄糖0.15 g、蔗糖0.15 g、尿素0.15 g、氯化銨0.27 g，料液比1∶1.4 和麩皮添加量3.45 g 為混菌發(fā)酵試驗(yàn)條件，選擇種子液的接種量分別為5%、10%、15%、20%和25%；發(fā)酵溫度分別為24、27、30、33 ℃和36 ℃；發(fā)酵時(shí)間分別為2、3、4、5 d和6 d；擠出醬油渣裝瓶量分別為5、10、15、20 g和25 g，以真蛋白和粗纖維含量為指標(biāo)，確定各因素的最佳發(fā)酵條件。

1.4.5 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化發(fā)酵條件

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取最優(yōu)的因素水平作為響應(yīng)面的“零”水平，利用Design-Expert 軟件中Box-Behnken進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)，試驗(yàn)因素與水平見表1。

表1 響應(yīng)面優(yōu)化發(fā)酵條件試驗(yàn)因素與水平

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

利用Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析，包括回歸分析、二次多項(xiàng)式回歸方程、方差分析和響應(yīng)面；利用Origin Pro 9.1軟件進(jìn)行繪圖。所有試驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1.1 接種量對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物的影響（見圖1）

圖1 接種量對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物的影響

未接種時(shí)，固態(tài)培養(yǎng)基中真蛋白含量和粗纖維含量分別為24.6%和30.5%。由圖1可知，隨著接種量從5%增加到15%時(shí)，真蛋白含量逐漸增大，但是粗纖維含量表現(xiàn)為逐漸遞減的趨勢(shì)，這是因?yàn)榻臃N量過小會(huì)造成微生物增殖緩慢，延長(zhǎng)生長(zhǎng)周期，此時(shí)產(chǎn)朊假絲酵母和白地霉積累的菌體蛋白含量不高，同時(shí)黑曲霉分泌的纖維素酶含量較低，對(duì)粗纖維的降解并不明顯[11]；當(dāng)接種量超過15%時(shí)，真蛋白含量逐漸降低，粗纖維含量則增加，這是因?yàn)楣腆w發(fā)酵培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)有限，造成微生物提前進(jìn)入衰老期，產(chǎn)朊假絲酵母和白地霉發(fā)生自溶，同時(shí)枯草芽孢桿菌提前進(jìn)入衰老期造成分泌的蛋白酶含量較低，物料中少量的蛋白分子被分解，沒有足夠的氮源供微生物生長(zhǎng)，此外接種量的增大還會(huì)引起培養(yǎng)基中水分含量的變化，這也會(huì)對(duì)微生物的生長(zhǎng)產(chǎn)生較大的影響[12]。故選擇最佳接種量為15%。

2.1.2 發(fā)酵溫度對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物的影響（見圖2）

圖2 發(fā)酵溫度對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物的影響

由圖2 可知，在發(fā)酵溫度為33 ℃時(shí)，真蛋白含量達(dá)到最大值，此時(shí)粗纖維含量為最小值，這可能是溫度偏低，菌體細(xì)胞內(nèi)酶的催化活性變低，影響菌體細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的合成速度，不利于菌體蛋白的積累[13]，同時(shí)黑曲霉分泌的纖維素酶活力較低，對(duì)纖維的降解能力變低[14]；當(dāng)發(fā)酵溫度大于33 ℃時(shí)，真蛋白含量逐漸降低，粗纖維含量開始增加，這是因?yàn)榘l(fā)酵溫度偏高，細(xì)胞會(huì)隨著溫度升高而細(xì)胞內(nèi)酶蛋白活性被抑制甚至變性失活，導(dǎo)致蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化率下降，同時(shí)菌體也會(huì)快速衰老、自溶，導(dǎo)致蛋白質(zhì)含量的降低，與此同時(shí)纖維素酶活力也會(huì)因?yàn)闇囟冗^高而降低甚至失活，導(dǎo)致粗纖維含量的增加[15]。故選擇最佳發(fā)酵溫度為33 ℃。

2.1.3 發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物的影響（見圖3）

圖3 發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物的影響

由圖3 可知，隨著發(fā)酵時(shí)間的增加，真蛋白含量急劇增加，粗纖維含量則表現(xiàn)為減少，當(dāng)發(fā)酵時(shí)間為5 d時(shí)，真蛋白含量達(dá)到最大值，粗纖維含量則為最小值，這是因?yàn)楫a(chǎn)朊假絲酵母和白地霉充分利用固體培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)，快速生長(zhǎng)繁殖，形成更多的菌體蛋白，同時(shí)黑曲霉和枯草芽孢桿菌分泌出大量的蛋白酶分解原料中的蛋白質(zhì)，形成更多的氮源，供微生物生長(zhǎng)繁殖，此外黑曲霉分泌的纖維素酶具有較高的活性，對(duì)擠壓后醬油渣中的纖維產(chǎn)生分解，形成更多的單糖或寡糖，提供大量的碳源，為微生物繁殖提供必要條件[16-17]；當(dāng)發(fā)酵時(shí)間超過5 d時(shí)，培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)被消耗殆盡，菌體出現(xiàn)自溶現(xiàn)象，這說明真蛋白含量與微生物的生長(zhǎng)情況有關(guān)系[4]，同時(shí)大量處于衰老期的微生物代謝廢物的堆積，導(dǎo)致菌體生長(zhǎng)受到抑制并產(chǎn)生一些不必要的副產(chǎn)物，也會(huì)增加培養(yǎng)基質(zhì)染菌的可能性[18]，導(dǎo)致真蛋白含量的降低，此時(shí)由于黑曲霉分泌的纖維素酶較少，對(duì)擠壓醬油渣中纖維的降解并不明顯，與發(fā)酵5 d 并無顯著差異[19]。故選擇最佳發(fā)酵時(shí)間為5 d。

2.1.4 裝瓶量對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物的影響（見圖4）

由圖4中可知，當(dāng)裝瓶量為15 g（250 mL三角瓶）時(shí)，真蛋白含量達(dá)到最大值，粗纖維含量則為最小值，這是因?yàn)檫m宜的裝料量有利于發(fā)酵過程中的氧氣和熱量的傳遞，進(jìn)而促進(jìn)微生物的生長(zhǎng)代謝，提高纖維素的降解和菌體蛋白的生成[1]；當(dāng)裝瓶量過少時(shí)，培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)不能滿足微生物生長(zhǎng)需要，減少菌體蛋白的積累，同時(shí)黑曲霉分泌的纖維素酶較少，對(duì)粗纖維降解效果不佳，導(dǎo)致真蛋白含量較低，粗纖維含量較高，當(dāng)裝瓶量過多時(shí)，培養(yǎng)基中溶氧量不足，微生物生長(zhǎng)受到限制，同時(shí)還會(huì)造成培養(yǎng)基熱量無法散失，微生物生長(zhǎng)溫度過高，導(dǎo)致菌體蛋白、酶等發(fā)生變性，引起真蛋白含量的降低和粗纖維含量的增加[20]。故選擇最佳裝瓶量為15 g。

圖4 裝瓶量對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物的影響

2.2 Box-Behnken試驗(yàn)結(jié)果（見表2、表3）

以真蛋白含量和粗纖維含量為響應(yīng)值，Box-Behnken試驗(yàn)安排與結(jié)果如表2所示，通過Design-Expert 軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行擬合分析，分別獲得二次回歸方程如下所示：

表2 響應(yīng)面優(yōu)化發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果

Y真蛋白=31.37+0.38A+0.68B+0.52C-0.20D+0.010AB+0.022AC+0.074AD+0.27BC-0.51BD+0.079CD-0.68A2-0.39B2-0.60C2-0.33D2

Y粗纖維=17.59-0.12A-0.01B-0.49C+0.01D-0.028AB-0.113AC-0.223AD-0.015BC+0.198BD+0.075CD-0.005A2-0.154B2+0.14C2-0.006D2

從回歸模型方差分析表（表3）中可以得出，真蛋白含量和粗纖維含量回歸方程模型P值均小于0.05，說明該回歸模型差異顯著，且失擬項(xiàng)P值均大于0.05，不顯著，說明回歸模型是合理可行的；由R12=0.926 8，R12Adj=0.853 5，R22=0.823 4 和R22Adj=0.646 8 均大于0.6 可以看出，試驗(yàn)結(jié)果具有較高的可信度和精密度。從表3中可以看出A、B、C、BD、A2、B2和C2對(duì)真蛋白含量有極顯著影響，D和D2對(duì)真蛋白含量有顯著影響；C對(duì)粗纖維含量有極顯著影響；其他相對(duì)真蛋白含量和粗纖維含量沒有顯著性影響。所以綜上所述，建立的發(fā)酵條件回歸模型與真蛋白含量和粗纖維含量的數(shù)據(jù)相吻合，可以用來預(yù)測(cè)各因素對(duì)真蛋白含量和粗纖維含量的影響。

表3 回歸模型方差分析

由表3可以看出BD交互項(xiàng)對(duì)真蛋白含量有極顯著影響，通過軟件繪制響應(yīng)面分析圖，如圖5 所示。從圖5 中可以看出，保持裝瓶量不變，真蛋白含量隨著發(fā)酵溫度的增大而增大，當(dāng)發(fā)酵溫度達(dá)到36 ℃左右時(shí)，真蛋白含量達(dá)到最大值，隨后開始逐漸降低；當(dāng)發(fā)酵溫度不變時(shí)，真蛋白含量在10 g左右時(shí)達(dá)到最大值，之后隨著裝瓶量的增加而降低。

圖5 發(fā)酵溫度和裝瓶量對(duì)真蛋白含量影響的響應(yīng)面

通過Design-Expert 軟件得出，對(duì)真蛋白含量和粗纖維含量發(fā)酵條件最優(yōu)組合為：接種量16.6%，發(fā)酵溫度36 ℃，發(fā)酵時(shí)間6 d 和裝瓶量10 g，此時(shí)真蛋白含量和粗纖維含量的理論值分別達(dá)到最大值32.19%和最小值16.77%。在最優(yōu)發(fā)酵條件下，進(jìn)行3 次重復(fù)試驗(yàn)測(cè)得真蛋白含量和粗纖維含量平均值分別為32.11%和16.82%，并且粗蛋白含量為36.55%。實(shí)測(cè)值與預(yù)測(cè)值誤差小于0.05%，說明試驗(yàn)數(shù)據(jù)與模型吻合良好。

3 結(jié)論

試驗(yàn)研究混合菌種固態(tài)發(fā)酵擠壓醬油渣制備蛋白質(zhì)飼料，以真蛋白含量和粗纖維含量為考察指標(biāo)，通過單因素試驗(yàn)和Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化，確定最佳發(fā)酵工藝為接種量16.6%，發(fā)酵溫度36 ℃，發(fā)酵時(shí)間6 d和裝瓶量10 g。在此優(yōu)化條件下，擠壓醬油渣發(fā)酵產(chǎn)物中真蛋白含量和粗纖維含量分別為32.11%和16.82%，與未發(fā)酵前相比，真蛋白含量提高了30.5%，粗纖維含量降低了44.8%，并且粗蛋白含量達(dá)到36.55%。本研究為擠壓醬油渣制備蛋白飼料提供理論支撐，但是仍需要進(jìn)行中試等研究，以更好地與實(shí)際生產(chǎn)相結(jié)合。