■張昊雪 屠 焰 胡鳳明 魯 琳

（1.北京農(nóng)學(xué)院動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京 102206；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所，奶牛 營養(yǎng)學(xué)北京市重點實驗室，北京 100081）

腹瀉是新生犢牛常見疾病之一，其直接危害犢牛的生長發(fā)育，嚴(yán)重時導(dǎo)致死亡，可造成牧場直接經(jīng)濟損失，而且影響奶牛后期的生產(chǎn)性能和繁殖性能[1-2]。引起犢牛腹瀉的因素復(fù)雜多樣，病毒、細菌、寄生蟲和飼養(yǎng)環(huán)境等都可能會導(dǎo)致該病的發(fā)生[3]。其中細菌感染是導(dǎo)致犢牛腹瀉的最主要原因之一，尤其是產(chǎn)毒性大腸桿菌（ETEC）和沙門氏菌感染犢牛后可侵入犢牛的腸道，引發(fā)屏障和功能障礙，引發(fā)腹瀉，嚴(yán)重危害犢牛的健康[4-5]。抗生素治療是改善犢牛健康、促生長的有效措施。隨著抗生素的使用公眾對牧場抗生素使用帶來的耐藥性和殘留對人類健康的威脅表示擔(dān)憂，人們更愿意花費更高的價格購買無抗生素添加的牛奶[6]。鑒于抗生素使用的影響和諸多弊端，我國已在商品飼料中全面施行了“禁抗令”。因此，通過功能性綠色飼料添加劑替代抗生素進行犢牛早期培育是綠色、可持續(xù)發(fā)展的必然選擇。

天然植物提取物無毒、無害、無污染，被認為是具有替代飼用抗生素的綠色飼料添加劑之一。通過特定的溶劑或相關(guān)的方法提取出的植物次級代謝產(chǎn)物，其具有多種生理活性[7]。植物提取物的成分種類復(fù)雜多樣，植物不同來源、不同部位提取出的物質(zhì)，其中活性成分含量及功效都不一樣。植物提取物可分為黃酮類、生物堿類、精油、苷類等幾大類[8]。植物提取物來源于植物，其活性成分、含量相對穩(wěn)定，目前廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、日化等多種行業(yè)。研究表明，植物提取物具有抑菌、抗病毒、抗蟲等功效[9]，也可促使動物分泌消化液和唾液，改善采食量。黃酮類化合物（Flavonoids）是植物的次級代謝物，是一種化合物并包含2-苯基色原酮結(jié)構(gòu)，具有抗氧化、抗炎等生理功能[10]。生物堿（Alkaloid）是一種相對繁雜的含氮有機化合物，是中草藥和植物中非常重要的成分，有著殺菌、抑菌的效果[11]。精油（Essential oils）是一種有著復(fù)雜化學(xué)成分的混合物，每種精油中都包含著許多成分，有的甚至超過上百種，具有抗氧化、抗菌、殺菌的功效，可以調(diào)節(jié)腸道菌群平衡及體液免疫[12]。苷類（Glycosides）也稱為配糖體，是一種環(huán)狀縮醛衍生物，糖苷可以強心健體，有補氣安神的作用[13]。有關(guān)植物提取物對病原微生物的抑制效果的研究報道較多。黃酮類化合物具有廣譜抑菌作用，對革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌都具有明顯的抑制作用[14]。黃酮類化合物的抑菌作用機制可能與其抑制細胞生產(chǎn)繁殖過程中能量代謝、蛋白質(zhì)和核酸合成、酶活性及細胞壁完整性和細胞膜通透性有關(guān)[15]。趙露露等[16]研究了植物提取物對雞源致病菌的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，肉桂精油、苦參堿、綠原酸、百里香精油、牛至精油5種植物提取物對大腸桿菌有抑菌作用，竹葉黃酮、黃芩黃酮、肉桂精油、苦參堿、綠原酸、牛至精油、百里香精油、大蒜油8種植物提取物對沙門氏菌有抑菌作用。植物提取物對致犢牛腹瀉的病原菌的體外抑菌效果的研究還很有限，因此，本試驗選取了黃酮類、生物堿類、精油、苷類的植物提取物，旨在研究其對致腹瀉犢牛病原菌的體外抑菌效果，以期為后續(xù)試驗研究及在犢牛上的潛在應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 植物提取物

槲皮素（≥97%）、蘆?。?5%）、黃芩素（≥98%）、黃芩苷（90%）、鹽酸小檗堿（95%）、葛根素（98%）、綠原酸（98%）、橙皮苷（95%）、茶多酚（98%）、大黃素（95%）購于上海源葉生物科技有限公司。

1.2 菌種信息

從腹瀉的荷斯坦?fàn)倥＃? 月齡以內(nèi)）的糞便中分離3 株菌，分別為牛大腸桿菌、大腸桿菌K99 和沙門氏菌，由北京市農(nóng)林科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所李永清研究員饋贈；標(biāo)準(zhǔn)菌株∶牛埃希氏菌O101∶K99，F(xiàn)41（CVCC 215，從腹瀉牛分糞便中分離），購于中國獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心；腸炎沙門氏菌，由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)馬曦教授提供。

1.3 儀器設(shè)備

DL-CJ-2NDⅡ型超凈臺（北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司），LB50L型自動電熱壓力蒸汽滅菌器（合肥華泰醫(yī)療設(shè)備有限公司），DNP-9082型電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海精宏實驗設(shè)備有限公司），THZ-C型恒溫振蕩器（太倉市實驗設(shè)備廠），723N 型紫外分光光度計（上海佑科儀器有限公司），MR Hei-Standard 磁力攪拌器（Heldolph，Germany），MX-S 型可調(diào)混合儀（SCILOGEX），KQ-500B 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.4 培養(yǎng)基及藥液的制備

本試驗選用MH（A）培養(yǎng)基（Mueller-Hinton Agar）和MH（B）培養(yǎng)基（Mueller-Hinton Broth）供細菌生長繁殖。按照培養(yǎng)基的說明與純化水混合均勻，置于高壓滅菌鍋121 ℃，15 min配置完成。植物提取物使用DMSO、甘油等助溶后溶于MH（B）培養(yǎng)基，制作成64 mg/mL 的母液，利用二倍稀釋的方法逐一配制32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125 mg/mL 的藥液備用。工作液中DMSO 的濃度不超過1%，稀釋過程中有固體析出的均采用超聲波使其溶解[17]。

1.5 細菌生長周期

采用紫外分光光度計法測定供試菌株的生長曲線，將每種供應(yīng)測試的菌以1%的比例分別接種于液體培養(yǎng)基中，溫度37 ℃、轉(zhuǎn)速250 r/min 振蕩，連續(xù)培養(yǎng)12 h，每2 h 取樣，測定樣品在600 nm 下的OD 值，重復(fù)3次以上步驟取平均值，繪制相應(yīng)菌株的生長曲線[18]（見圖1、圖2）。由圖1、圖2可知本試驗使用的牛大腸桿菌的對數(shù)生長期在接種后2～6 h，牛沙門氏菌的對數(shù)生長期在接種后的2～8 h。

圖1 大腸桿菌生長周期

圖2 腸炎沙門氏菌生長周期

1.6 細菌菌落數(shù)的測定及菌懸液的制備

挑取單菌落接種至10 mL MH（B）培養(yǎng)基，在振蕩培養(yǎng)箱中37 ℃、250 r/min 培養(yǎng)12 h 后，移液槍移取100 μL 菌液以1%的比例加入到新的MH（B）培養(yǎng)基，相同條件下培養(yǎng)4 h，使細菌達到對數(shù)生長期，將菌液稀釋6倍后，在波長600 nm處紫外分光光度計測定吸光度（OD 值），計算菌液的OD 值，于1.5 mL 離心管中將菌液稀釋到OD 值=1 的濃度，采用10 稀釋法，取100 μL 加入900 μL 培養(yǎng)基中，依次類推，稀釋至8倍，將5～8倍稀釋的菌液分別均勻涂布在MH（A）培養(yǎng)基上，恒溫培養(yǎng)箱37 ℃培養(yǎng)12 h，觀察菌落數(shù)，并計算值OD 值=1 時的菌液濃度（CFU/mL）。以上試驗重復(fù)3次計算平均值。依據(jù)OD值=1時的菌液濃度將菌液稀釋至1.0×105CFU/mL 的濃度并立即用于最小抑菌濃度（MIC）和最小殺菌濃度（MBC）的測定[19]。

1.7 抑菌圈的測定

抑菌圈采用牛津杯打孔的方法來進行測定[20-21]。將高壓滅菌的牛津杯（內(nèi)徑6 mm，高10 mm）置于一次性培養(yǎng)皿上（13 mm×13 mm），配制好的50 mL MH（A）培養(yǎng)基冷卻至40 ℃時加入菌液，混合均勻使菌液濃度達到1.0×106CFU/mL，相當(dāng)于0.5 McFarland標(biāo)準(zhǔn)。瓊脂完全凝固，輕輕旋轉(zhuǎn)并拔出牛津杯，將配制好的提取物溶液200 μL（8 mg/mL）分別加入孔中，并用0.9%無菌鹽水作為空白對照，每種提取物設(shè)置3 個重復(fù)，試驗重復(fù)3 次。待植物提取物溶液完全風(fēng)干進入培養(yǎng)基后，置于恒溫培養(yǎng)箱37 ℃培養(yǎng)24 h，用游標(biāo)卡尺測量抑菌圈直徑。

1.8 MIC和MBC的測定

MIC 的測定方法是根據(jù)微量肉湯稀釋法改進[22]。挑取單菌落至MH（B）培養(yǎng)基，恒溫培養(yǎng)箱37 ℃培養(yǎng)24 h，活化的菌液以1%濃度轉(zhuǎn)接在MH（B）培養(yǎng)基至對數(shù)生長期，稀釋至約為1.0×105CFU/mL 的菌液備用。在96孔板中沿著A1～A10方向依次加入100 μL的按二倍稀釋法稀釋好的植物提取物，然后分別加入90 μL上述稀釋好的菌液和10 μL刃天青（Resazurin，1 mg/mL），混勻。A1只加入培養(yǎng)基作為陰性對照，A2中只加入細菌作為陽性對照。將96孔板放置在培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)12～18 h。每個處理設(shè)置3 個重復(fù)。微生物的生長可以通過刃天青的顏色從藍色變?yōu)榉奂t色來表示，測試菌沒有明顯生長的最低的植物提取物濃度即為MIC，對高于MIC濃度以上的培養(yǎng)液進行涂板計數(shù)，菌落數(shù)低于初始接種時99.9%的最低濃度即為MBC。

1.9 聯(lián)合抑菌

在測得個單一提取物的MIC后，使用了棋盤法來判定各提取物聯(lián)合后的抑菌效果[23]。用瓊脂培養(yǎng)基MH（B）倍比稀釋綠原酸和茶多酚，將其放進一次性96 孔板中兩兩組合。兩種藥分別進行倍比稀釋：選用6 個梯度稀釋使最高濃度單種藥MIC 的兩倍。將100 μL 菌液加入到每個孔中，兩種藥物按照橫列縱列分別取50 μL相互組合，使孔中菌液的濃度保持在1×105CFU/mL。把加好后的一次性96孔板放入37 ℃電培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，觀測結(jié)果。試驗重復(fù)3次。聯(lián)合抑菌效果判定（聯(lián)合細菌指數(shù)FICI=A 液聯(lián)合時的MIC/A 液單獨使用的MIC+B 液聯(lián)合時的MIC/B 液單獨使用的MIC）。FICI≤0.5時為協(xié)同作用；0.5＜FICI≤1為相加作用；1＜FICI≤2時為無關(guān)作用；當(dāng)FICI＞2時為頡頏作用。

2 結(jié)果與分析

2.1 植物提取物的抑菌試驗（見表1）

表1 植物提取物對犢牛腹瀉病原菌的抑菌圈大?。╩m）

由表1 可知，相同濃度的10 種植物提取物相比，8 mg/mL的茶多酚對牛大腸桿菌、大腸桿菌K99、牛沙門氏菌、CVCC215和腸炎沙門氏菌均表現(xiàn)出最好的抑菌效果；鹽酸小檗堿對牛大腸桿菌、牛大腸桿菌K99和CVCC215 顯現(xiàn)了一定的抑菌效果，但效果低于茶多酚；其他提取物和生理鹽水對所有菌株的生長均未表現(xiàn)出抑菌效果。

2.2 植物提取物的MIC和MBC（見表2）

表2 植物提取物對犢牛腹瀉病原菌的MIC和MBC（mg/mL）

由表2 可知，茶多酚對牛大腸桿菌、牛大腸桿菌K99、牛沙門氏菌和CVCC215、腸炎沙門氏菌的MIC均為1 mg/mL；鹽酸小檗堿的對牛大腸桿菌、牛大腸桿菌K99 和CVCC215 的MIC 分別為16、16 mg/mL 和1 mg/mL，而對牛沙門氏菌和腸炎沙門氏菌的MIC均＞64 mg/mL；綠原酸對牛大腸桿菌、牛大腸桿菌K99 和CVCC215 的MIC 均為16 mg/mL，對牛沙門氏菌和腸炎沙門氏菌的MIC均為32 mg/mL；茶多酚對牛大腸桿菌、牛大腸桿菌K99、牛沙門氏菌和CVCC215、腸炎沙門氏菌的MBC 值分別為1、1、2 mg/mL 和2、2 mg/mL；鹽酸小檗堿的對牛大腸桿菌、牛大腸桿菌K99、牛沙門氏菌和CVCC215、腸炎沙門氏菌的MBC 值分別為16、16、＞64 mg/mL 和2、＞64 mg/mL；綠原酸對牛大腸桿菌、牛大腸桿菌K99、牛沙門氏菌和CVCC215、腸炎沙門氏的MBC 值均為32 mg/mL；其他幾種提取物在0.125～64 mg/mL 的濃度范圍內(nèi)均未表現(xiàn)出抑菌效果。

2.3 茶多酚、鹽酸小檗堿或綠原酸的聯(lián)合抑菌（見表3）

表3 茶多酚、鹽酸小檗堿或綠原酸的聯(lián)合抑菌活性

由表3可知，茶多酚和鹽酸小檗堿聯(lián)合使用對牛大腸桿菌、牛大腸桿菌K99和CVCC215抑菌效果具有相加作用；茶多酚和綠原酸聯(lián)合使用對牛大腸桿菌、牛大腸桿菌K99、CVCC215和腸炎沙門氏菌表現(xiàn)出拮抗作用，對牛沙門氏菌呈無關(guān)作用；鹽酸小檗堿和綠原酸聯(lián)合使用對牛大腸桿菌和CVCC215 呈無關(guān)作用，對K99呈頡頏作用。

3 討論

犢牛腹瀉病原多樣且復(fù)雜，其中細菌感染，尤其致病性大腸桿菌（ETEC）和沙門氏菌是造成犢牛腹瀉的主要誘因。大腸桿菌腹瀉主要引起2～3周齡內(nèi)的犢牛腹瀉，其中ETEC是誘發(fā)幼畜腹瀉的主要病原體[24]，4 日齡以內(nèi)的犢牛對該病菌具有易感性，而隨日齡增加易感性降低，其很少導(dǎo)致成年牛腹瀉，ETEC的致病機理與其毒力因子有關(guān)，K99是目前在犢牛中分離最多的抗原[25]。致病性大腸桿菌經(jīng)口腔進入消化道，黏附在腸道上皮，通過黏附素和毒力因子作用，破壞腸道物理、生化屏障，導(dǎo)致腸道炎癥及腹瀉發(fā)生。沙門氏菌屬于條件性致病菌，引起幼齡動物急性敗血癥、胃腸炎以及局部炎癥。沙門氏菌引起牛沙門氏菌病，又稱犢牛副傷寒，主要感染10～40日齡的犢牛。沙門氏菌流行病學(xué)檢測結(jié)果顯示，腹瀉犢牛中沙門氏菌檢出率為18.1%[26]。沙門氏菌侵入腸道后黏附在上皮細胞刷狀緣部位，通過外毒素，尤其是腸毒素，導(dǎo)致腸炎和腹瀉發(fā)生。預(yù)防犢牛腹瀉的重點是將病菌與犢牛隔離或有效殺滅腸道內(nèi)病菌或阻斷病菌在腸上皮上的黏附作用，因此在體外篩選對犢牛致病菌具有有效抑制作用的植物提取物具有潛在的應(yīng)用價值。本試驗結(jié)果顯示，茶多酚、綠原酸和鹽酸小檗堿對牛源大腸桿菌具有抑制作用，茶多酚和綠原酸對牛源沙門氏菌具有抑制作用。茶多酚是一類從茶葉中提取的多酚類化合物的總稱，具有抗氧化、抑菌、抗癌、防止遺傳物質(zhì)損傷等諸多優(yōu)勢，常作為抗氧化劑添加在飼料中，廣泛應(yīng)用于畜禽生產(chǎn)實踐中[27]。茶多酚具有廣譜抑菌效果，對革蘭氏陽性菌和陰性菌均具有抑制效果，對常見的大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和沙門氏菌均具有抑制效果[28]。肖潔[29]研究表明，茶多酚的有效活性成分表沒食子兒茶素沒食子酸酯對大腸桿菌O157∶H7具有顯著的抑菌作用。邢淑婕等[30]研究發(fā)現(xiàn)，茶多酚對食品中鼠傷寒沙門氏菌具有顯著的抑菌作用。目前關(guān)于茶多酚的抑菌作用機制仍未完全明確。茶多酚對大腸桿菌的抑制作用機制包括使細胞膜的通透性發(fā)生改變，激活細胞內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)，影響細胞轉(zhuǎn)錄、表達等。綠原酸是一種廣泛存在的多酚類物質(zhì)，具有抗氧化、抗炎、抗菌和降糖降脂等多種生物學(xué)功能[31]。綠原酸對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌和奇異變形菌都具有較好的抑菌效果[32-33]，綠原酸的抑菌作用強度弱于茶多酚[34]。趙露露等[16]研究發(fā)現(xiàn)，綠原酸對雞源致病菌大腸桿菌和沙門氏菌均具有抑制作用。目前綠原酸的抑菌作用機制尚不明確。周志娥等[35]研究表明，綠原酸對大腸桿菌的抑菌作用機制可能與破壞細菌細胞壁、細胞膜的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致細胞通透性增加，進而使細胞內(nèi)容物外泄有關(guān)。綠原酸的抑菌作用機制也可能與其含有酚羥基有關(guān)，可以影響相關(guān)代謝酶的活性，降低物質(zhì)和能量代謝，導(dǎo)致細胞代謝受阻，生長抑制[36]。鹽酸小檗堿屬于異喹啉類生物堿，具有強的抗菌能力和廣泛的抗菌譜。劉萍等[37]研究發(fā)現(xiàn)黃連中的鹽酸小檗堿對金黃色葡萄球菌、枯草桿菌和大腸桿菌的MIC依次為0.2、0.3、0.6 mg/mL。張濤等[38]研究表明，鹽酸小檗堿對體外大腸桿菌具有抑制作用，但其抑菌作用較弱，對大腸桿菌的抑菌效果優(yōu)于綠原酸[39]。這與本試驗結(jié)果相符，與茶多酚相比鹽酸小檗堿的抑菌作用較弱，但對大腸桿菌的抑菌強度高于綠原酸。本試驗結(jié)果表明茶多酚、綠原酸和鹽酸小檗堿對犢牛致病菌大腸桿菌或沙門氏菌具有一定的抑制作用，且抑菌效果上看茶多酚＞鹽酸小檗堿＞綠原酸，但茶多酚、綠原酸、鹽酸小檗堿的抑菌作用機制目前研究尚不完善，仍需要進一步的實踐和理論研究進一步完善。

4 結(jié)論

在本試驗條件下，茶多酚和綠原酸對牛大腸桿菌和沙門氏菌均具有一定的抑制作用，鹽酸小檗堿對牛大腸桿菌具有一定的抑制作用，對沙門氏菌沒有抑制作用；聯(lián)合使用茶多酚和鹽酸小檗堿對牛大腸桿菌的抑制效果具有相加作用。植物提取物的抑菌機制和對犢牛腹瀉的影響還需要進一步研究。