余蓓萌，周 萍，潘海滔，徐人杰*

0 引言

芙樸感冒顆粒的配方組成源于著名中醫(yī)學(xué)家吳士元，以中藥材木芙蓉葉(900 g)、牛蒡子(250 g)、厚樸(150 g)和陳皮(250 g)為原料，經(jīng)過提取加工制成，臨床用于治療風(fēng)熱或風(fēng)熱挾濕感冒引起的發(fā)熱頭痛、咽痛、肢體酸痛、鼻塞、胃納減退，為兒科常用藥[1-2]。橙皮苷(圖1)是芙樸感冒顆粒中最重要的糖苷類化合物之一，是陳皮的主要活性成分[3]。藥理研究表明，橙皮苷具有鎮(zhèn)靜、抗驚厥、提高免疫力、抗抑郁和解毒等作用[4-5]。

已有研究表明，橙皮苷的絕對生物利用度偏低，靜脈給藥后大鼠血漿中橙皮苷的濃度水平比口服后要高很多[6-7]?？诜侵兴帒?yīng)用的主要途徑，口服藥物首先在胃腸道中吸收[8]。小腸吸收障礙是影響外源性物質(zhì)生物利用度的重要因素。因此，探索橙皮苷的腸道吸收機制為研究其體內(nèi)藥代動力學(xué)研究提供了關(guān)鍵信息。

本項研究的目的是探究橙皮苷的腸吸收特性并考察芙樸感冒顆粒對其吸收的影響。本實驗采用的Caco-2細胞系，由于其形態(tài)和功能與人類小腸上皮相似而被廣泛使用，并且已經(jīng)被美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)認可作為模擬人體腸道吸收的模型[9]。本研究旨在通過體外Caco-2實驗和大鼠體內(nèi)藥動學(xué)實驗揭示橙皮苷的小腸吸收機制，并探究芙樸感冒顆粒對橙皮苷口服吸收的影響。

1 儀器和試藥

1.1 藥品與試劑 Transwell 轉(zhuǎn)運小室(12孔,0.4 μm)；96 孔細胞培養(yǎng)板、培養(yǎng)瓶(Corning 公司，美國)。橙皮苷、槲皮素、維拉帕米、MK571、吲哚美辛、苯溴馬隆、芹菜素、左旋肉堿和奎尼丁均由上海阿拉丁生化科技股份有限公司提供。HBSS緩沖液購于美國Corning 公司；二甲基亞楓(DMSO)購于美國Sigma公司；芙樸感冒顆粒(批號：203033，浙江天一堂藥業(yè)有限公司)。MTT購自白鯊生物科技有限公司；胎牛血清購自美國Gibco公司；甲醇、乙腈均為色譜純；水為純化水；細胞Caco-2 細胞株，購自中國科學(xué)院上海細胞庫，代數(shù)在35～50代。

1.2 儀器 Applied Biosystem 5500 QTRAP?hy-brid triple-quad LC/MS/MS(美國AB科學(xué)技術(shù)公司)；ZORBAX Eclipse Plus C18色譜柱(美國安捷倫科技有限公司，50 mm×2.1 mm,1.8 μm)?？缒る娮鑳x(Millicell ERS system，Millipore，MA，美國)。

1.3 動物 Sprague-Dawley(SD)大鼠(210～230 g)由上海交通大學(xué)實驗動物中心提供，在恒定溫度(22～24 ℃)和濕度(55%～60%)條件下飼養(yǎng)。所有動物程序均按照上海交通大學(xué)實驗動物中心指南和規(guī)章制度操作，并通過上海交通大學(xué)動物倫理委員會審核。

2 方法

圖2 培養(yǎng)基樣品中橙皮苷和槲皮素的二級碎片離子圖

2.2 芙樸感冒顆粒溶液的配制與定量 取裝量差異項下的芙樸感冒顆粒，研細并精密稱定粉末約1 g，至50 ml具塞錐形瓶中，精密加甲醇10 ml，超聲提取20 min，取出放冷，稱定重量，并用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，棄去初濾液，用0.22 μmol/L微孔濾膜過濾。采用高效液相色譜法測定芙樸感冒顆粒中橙皮苷含量(3.2±0.8)mg/g，在芙樸感冒顆粒甲醇溶液中為526.2 μmol/L。

2.3 對照品溶液的配制 精密稱取橙皮苷對照品適量，用DMSO 配制成濃溶液，實驗前用HBSS緩沖液(用于Caco-2實驗)或甲醇(用于藥動學(xué)實驗)稀釋至所需藥物濃度，其中DMSO 最終濃度低于0.1%，4 ℃冷藏備用。

2.4 樣本處理 取培養(yǎng)基或大鼠血漿樣品50 μl，加入10 ng/ml槲皮素甲醇內(nèi)標溶液10 μl，渦旋混勻，加入400 μl甲醇，渦旋提取1 min。12 000 r/min離心10 min，吸取2 μl上清進樣LC-MS/MS分析。

2.5 Caco-2細胞培養(yǎng)和細胞毒性 將Caco-2細胞保持在含有10%FBS(56 ℃滅活30 min)、1%非必需氨基酸、1% L-谷氨酰胺和1%鏈青霉素的DMEM中，實驗溫度為37 ℃，實驗環(huán)境包含95%空氣及5% CO2。培養(yǎng)基2～3 d更換一次。當細胞單層達到80%融合后，用胰蛋白酶(0.5 mg/ml)和EDTA(0.2 mg/ml)分離傳代，細胞密度為5×104/ cm2。采用MTT法檢測橙皮苷的細胞毒性。胰酶消化對數(shù)生長期Caco-2 細胞制成單細胞懸液，以每孔5×104個細胞密度接種到96孔培養(yǎng)板中，孵育24 h后，加入不同濃度的橙皮苷溶液或者芙樸感冒顆粒溶液(終濃度體系甲醇含量低于1%，含1 μmol/L橙皮苷)。之后，加入5 mg/ml MTT 20 μl孵育4 h后，再加入150 μl DMSO溶解。酶標儀在490 nm吸光度處測量。使用沒有接種細胞的孔作為空白對照，含有細胞但沒有樣品溶液的孔作為陰性對照。細胞存活率(%)=A實驗組/A對照組×100%，其中A為吸光度值。

2.6 轉(zhuǎn)運實驗 采用12 孔Transwell細胞小室，按1×105cells/ml的密度接種Caco-2細胞。對于轉(zhuǎn)運實驗，使用Millicells ERS-2評估跨膜電阻(Transepithelial electrical resistance，TEER)，以反映細胞間連接的緊密性。單層接種后19～22 d即可進行實驗。實驗中使用了TEER大于400 Ω/cm2的Caco-2細胞單層。

實驗前，用HBSS將細胞單層培養(yǎng)基(pH 7.4)洗滌2次。將細胞培養(yǎng)板在新鮮的HBSS培養(yǎng)基中于37 ℃孵育30 min。將測試化合物添加到頂膜端(AP，0.5 ml)或底膜端(BL，1.5 ml)中，同時接收室中包含相應(yīng)體積的空白HBSS培養(yǎng)基。在37 ℃下以50 r/min搖動孵育120 min。為了評估藥物從AP到BL的轉(zhuǎn)運，在開始孵育后15、30、45、60、90和120 min，從BL或AP一側(cè)收集50 μl溶液，并補充等量的HBSS溶液。在實驗前后進行TEER測量以評估膜的完整性。取樣后立即將樣品冷凍，并在分析前保存在-80 ℃以下。

2.6.1 溫度對橙皮苷轉(zhuǎn)運的影響 擬在4 ℃和37 ℃條件下采用濃度為1 μmol/L的橙皮苷，研究其在Caco-2細胞中的轉(zhuǎn)運行為是否受溫度影響。

按照相關(guān)規(guī)則,按照稅法規(guī)定外國企業(yè)以及外國企業(yè)收入,相關(guān)企業(yè)包含三例:在資金、運營、購銷等方面，存在直接或間接地操控或具有聯(lián)系;直接或間接地同為第三者所操控或具有;以及有其他利益上的相相聯(lián)系。

2.6.2 pH值對橙皮苷轉(zhuǎn)運的影響 在HBSS緩沖液中進行實驗，該緩沖液根據(jù)實驗調(diào)節(jié)至頂膜側(cè)的pH值為6.0或7.4(0.5 ml)，基底膜側(cè)的pH值為7.4(1.5 ml)。

2.6.3 幾種轉(zhuǎn)運蛋白對橙皮苷轉(zhuǎn)運的影響 將幾種抑制劑分別預(yù)處理轉(zhuǎn)運體系30 min，包括P-糖蛋白(p-gp)抑制劑維拉帕米(100 μmol/L)、多耐藥蛋白(MRPs)抑制劑MK571(100 μmol/L)、苯溴馬隆(MRP3，50 μmol/L)和吲哚美辛(MRP2，200 μmol/L)及乳腺癌耐藥蛋白(BCRP)抑制劑芹菜素(25 μmol/L)；通過添加釩酸鈉(50 μmol/L)和西咪替丁(50 μmol/L)評估Na/K-ATPase的選擇性；加入左旋肉堿(100 μmol/L)或奎尼丁(100 μmol/L)用以評估有機陽離子轉(zhuǎn)運體OCTN1或OCTN2蛋白對橙皮苷吸收的影響。

2.7 藥動學(xué)實驗 實驗前，大鼠被隨機分為2組(每組6只大鼠)，灌胃口服橙皮苷混懸液5.76 mg/kg或芙樸感冒顆粒溶液1.8 g/kg(臨床等效量，約含5.76 mg/kg橙皮苷)。其中橙皮苷溶于0.5%CMC-Na中配置成混懸液用于口服。在給藥后24 h內(nèi)采血，收集全血150 μl，以3 000 r/min離心10 min，將50 μl血漿樣品于-80 ℃保存。

2.8 數(shù)據(jù)處理 表觀滲透系數(shù)(Apparent permeability，Papp) 值和外排率(Efflux ratio，ER) 值。Papp=(dQ/dt)/(A·C0)，ER=PappBA/ PappAB。公式中 A 為Transwell小室的有效面積，dQ/dt為轉(zhuǎn)運速率，C0為藥物的初始濃度，PappBA為由BL至AP側(cè)的Papp值，PappAB為由AP至BL側(cè)的Papp值。ER > 1.5提示可能存在主動轉(zhuǎn)運，ER < 1.5提示以被動擴散為主[10]。

3 結(jié)果

3.1 細胞毒試驗 如表1所示，橙皮苷濃度小于100 μmol/L時對Caco-2細胞生長抑制率小于10%，表明低于100 μmol/L的橙皮苷對Caco-2細胞生長未產(chǎn)生明顯的細胞毒性，因此，選取100、10、1 μmol/L作為轉(zhuǎn)運實驗中橙皮苷的終濃度。同時，濃度為0.19 mg/ml芙樸感冒顆粒溶液(含1 μmol/L橙皮苷)對Caco-2細胞生長無抑制作用，證明該濃度芙樸感冒顆粒溶液可用于Caco-2轉(zhuǎn)運實驗。

表1 不同濃度橙皮苷對Caco-2細胞的抑制率(n=33)

3.2 橙皮苷的含量測定 橙皮苷和內(nèi)標的保留時間分別為1.74 min和2.18 min。代表性色譜圖見圖3，顯示了橙皮苷和內(nèi)標的基線分離，而不受內(nèi)源性成分的干擾。橙皮苷在培養(yǎng)基及大鼠血漿中的校準曲線方程為y=0.050 7x+0.356(R2=0.991 4)及y=0.051 6x+0.235 7(R2=0.991 4)，其中y表示橙皮苷峰面積與槲皮素峰面積的比率(x為培養(yǎng)基中的橙皮苷濃度，R為相關(guān)系數(shù))。該測定方法的定量下限為0.5 ng/ml，線性范圍0.5～200 ng/ml。橙皮苷在2種基質(zhì)中的定量實驗均通過專屬性、準確度、精密度、提取回收率、穩(wěn)定性和線性等方法學(xué)考察，結(jié)果可靠。

圖3 樣品質(zhì)譜圖

3.3 濃度和時間對橙皮苷轉(zhuǎn)運的影響 在2個方向上研究了濃度分別為1、10、100 μmol/L的橙皮苷的轉(zhuǎn)運，并估計了橙皮苷的滲透性(圖4)。根據(jù)圖4數(shù)據(jù)進行計算，橙皮苷的Papp為1.20×10-6～1.30×10-6cm/s(AP～BL)和2.23×10-6～2.81×10-6cm/s(BL～AP)。Papp值結(jié)果表明，橙皮苷屬于中等吸收的化合物。在3個濃度下繪制了0～120 min Caco-2細胞單層中橙皮苷的濃度-時間圖，橙皮苷在檢測時間段內(nèi)隨時間呈線性增長。

圖4 不同濃度下橙皮苷在Caco-2細胞中的跨膜轉(zhuǎn)運(n=33)

3.4 pH值和溫度對Caco-2細胞轉(zhuǎn)運橙皮苷的影響 如圖5所示，橙皮苷在pH=7.4時的PappAB值明顯高于pH=6時的PappAB值(P<0.05)，提示高pH(7.4)時穿過細胞單層的橙皮苷轉(zhuǎn)運要比低pH(6.0)時更容易，原因可能是在橙皮苷轉(zhuǎn)運過程中，pH=6.0時，某些外排蛋白如BCRP活性被激活，導(dǎo)致藥物的轉(zhuǎn)運效率降低[11]。溫度降低會降低細胞的新陳代謝[12]，低溫(4 ℃)孵育顯著降低了橙皮苷轉(zhuǎn)運效率，使PappAB從1.23×10-6cm/s降低到0.58×10-6cm/s。

圖5 不同pH和溫度時橙皮苷 (1 μmol/L) 在Caco-2細胞中的跨膜轉(zhuǎn)運(n=33,P<0.05)

3.5 轉(zhuǎn)運蛋白抑制劑對跨細胞橙皮苷轉(zhuǎn)運的影響 如表2所示，在用西咪替丁或釩酸鈉預(yù)處理后，Papp值無顯著影響。P-gp被認為是影響藥物在腸道中運輸?shù)闹饕馀诺鞍字?。P-gp抑制劑維拉帕米可能會顯著增加某些化合物從AP到BL側(cè)的轉(zhuǎn)運。在維拉帕米預(yù)處理的情況下，橙皮苷的PappAB幾乎是對照組的6.75倍，同時ER從2.19降至0.31，這提示P-gp可以影響橙皮苷的轉(zhuǎn)運。除P-gp外，MRP和BCRP也是三磷酸腺苷超家族的成員，與藥物的吸收和代謝過程密切相關(guān)。在以3種MRP抑制劑(MK571、苯溴馬隆和吲哚美辛)預(yù)處理的情況下，橙皮苷的PappAB與對照組相比沒有顯著性差異，這說明橙皮苷并不是MRP的底物。另一方面，在通過轉(zhuǎn)運蛋白OCTN1抑制劑預(yù)處理后發(fā)現(xiàn)，橙皮苷的跨膜轉(zhuǎn)運并沒有明顯變化，說明OCTN1對橙皮苷的轉(zhuǎn)運影響甚微。同時，推測橙皮苷并非為攝入型轉(zhuǎn)運蛋白OCTN2 的底物，OCTN2屬于有機陽離子轉(zhuǎn)運蛋白，這些轉(zhuǎn)運蛋白不需要消耗ATP，而是依賴藥物離子表面的離子電荷實現(xiàn)藥物轉(zhuǎn)運，以被動擴散中的協(xié)助擴散的方式攝入細胞。

表2 橙皮苷在Caco-2細胞上轉(zhuǎn)運結(jié)果(n=33)

橙皮苷是BCRP的底物。在芹菜素預(yù)處理的情況下，橙皮苷的PappAB顯著升高，約為對照組的2.46倍，使PappAB從1.26×10-6cm/s增加至3.71×10-6cm/s。加入芙樸感冒顆粒處理液后，橙皮苷的PappAB顯著升高，證明芙樸感冒顆粒中其他成分可能影響了橙皮苷的轉(zhuǎn)運，促進了其小腸吸收。

3.6 體內(nèi)藥動學(xué)研究 大鼠口服橙皮苷或芙樸感冒顆粒溶液后血漿濃度與時間的關(guān)系曲線如圖6所示。主要的藥動學(xué)參數(shù)如表3所示，芙樸感冒顆粒組中橙皮苷的Cmax為單體組的121.54%?？诜o藥后，兩組橙皮苷均被迅速吸收并達峰值。兩組橙皮苷的血漿暴露量(AUC0-t和AUC0-∞)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，但MRT和t1/2差異無統(tǒng)計學(xué)意義，說明芙樸感冒顆粒片中其他成分主要影響橙皮苷的吸收，對其消除沒有明顯作用。這個結(jié)果可以與Caco-2實驗中芙樸感冒顆粒影響橙皮苷小腸吸收這一結(jié)果吻合。

圖6 兩組大鼠口服橙皮苷或芙樸感冒顆粒溶液后體內(nèi)橙皮苷的平均血藥濃度-時間曲線(n=36)

4 討論

一般認為，Papp值小于1×10-6cm/s的化合物被認為吸收率低(<30%)，Papp值在1×10-6～1×10-5cm/s的化合物被認為具有中等吸收(30%～60%)，而Papp值大于1×10-5cm/s的被認為具有高吸收(>70%)[13]。橙皮苷Papp值的這些結(jié)果表明了其在腸道中吸收一般。橙皮苷屬于吸收中等化合物，結(jié)合文獻，其滲透性與口服生物利用度并不完全一致。

表3 兩組大鼠血漿中橙皮苷的主要藥動學(xué)參數(shù)(n=6)

Caco-2試驗的結(jié)果顯示，橙皮苷吸收的ER值> 1.5，同時，抑制劑的試驗結(jié)果表明，其存在外排蛋白參與的主動轉(zhuǎn)運。P-gp 是ATP依賴型外向轉(zhuǎn)運蛋白，屬ATP 結(jié)合盒 (ATP binding cassette,ABC)超家族，由2個重復(fù)分子組成，每一分子包括6個跨膜的極度疏水區(qū)和1個包含高度保守的ATP 結(jié)合域親水區(qū)。P-gp 主要定位在小腸黏膜上皮細胞和胎盤滋養(yǎng)層細胞的刷狀緣、肝小管和腎近曲小管的管腔面以及腦血管內(nèi)皮細胞，參與藥物的吸收，臨床上很多藥物為P-gp的誘導(dǎo)劑或抑制劑[14]。本次試驗發(fā)現(xiàn)橙皮苷為P-gp的底物，這為進一步研究橙皮苷臨床應(yīng)用及藥物相互作用提供了前期基礎(chǔ)。除P-gp 外,MRP2、BCRP 等外排型轉(zhuǎn)運體在腸道上皮細胞的頂膜側(cè)都有所表達,它們在將底物分泌至胞外中發(fā)揮重要作用[15]。

藥物口服以后，首先在胃腸道被吸收，因此，腸道吸收能力的強弱直接影響到化合物的體內(nèi)藥動學(xué)行為尤其是其吸收相特征。除了腸道吸收障礙外，肝臟代謝也是導(dǎo)致口服生物利用度低的一個重要原因。

本次體外Caco-2試驗及體內(nèi)藥動學(xué)試驗結(jié)果表明，復(fù)方給藥增加了橙皮苷的小腸吸收能力，導(dǎo)致芙樸感冒顆粒中的橙皮苷吸收顯著增加，其原因可能是由于芙樸感冒顆粒中的某些成分競爭性地抑制了橙皮苷的外排作用。結(jié)果顯示，該復(fù)方成分對橙皮苷有增加吸收作用。該結(jié)果證明了方劑配伍可明顯影響活性化學(xué)成分在體內(nèi)的藥物動力學(xué)行為，說明在中醫(yī)辨證理論指導(dǎo)下的復(fù)方配伍原則具有豐富的科學(xué)內(nèi)涵。根據(jù)文獻報道，除橙皮苷外，芙樸感冒顆粒主要還包括牛蒡子苷、川陳皮素、厚樸酚以及蘆丁等若干成分[16]，復(fù)方中幾味藥材間存在復(fù)雜的相互作用，從而可能導(dǎo)致藥效發(fā)生改變，我們將進一步深入研究。