郝 軍，?；w，盛 旻，楊春艷，邢娟麗

0 引言

頸性眩暈(Cervical vertigo，CV)指因頸椎部位組織結(jié)構(gòu)障礙而引起的眩暈，占眩暈的65%[1]。近年來，CV的發(fā)生率明顯升高，而且呈現(xiàn)年輕化發(fā)展[2]，其診斷和治療仍有明顯難度，需要深入研究CV的發(fā)病機(jī)制并探究良好的治療策略[3]。

多種中藥在CV治療中表現(xiàn)出良好的效果[4]，其中劉俊逸[5]應(yīng)用刺五加(Acanthopanax senticosus)注射液改善了CV患者的神經(jīng)壓迫，促進(jìn)了血液循環(huán)以及腦部供血，治療有效率達(dá)到93.3%，然而，刺五加緩解或治療CV的內(nèi)在機(jī)制仍不清楚。研究表明，刺五加通過調(diào)節(jié)多巴胺D2受體(Dopamine Receptor D2，DRD2)和小膠質(zhì)細(xì)胞M1(促炎)/M2(抗炎)極性類型對(duì)血管收縮/舒張和神經(jīng)損傷發(fā)揮改善作用，并對(duì)機(jī)體具有鎮(zhèn)痛效果[6-8]。然而，刺五加治療對(duì)CV患者體內(nèi)DRD2表達(dá)以及小膠質(zhì)細(xì)胞的M1/M2極性的影響仍不清楚。本研究納入經(jīng)刺五加注射液癥狀緩解的CV患者和未進(jìn)行治療的CV患者，檢測(cè)血液中DRD2的表達(dá)和DRD2基因CpG島甲基化改變，并在體外培養(yǎng)人小膠質(zhì)細(xì)胞hmc-3，探討刺五加注射液對(duì)其M1/M2極性的調(diào)節(jié)作用。

1 資料與方法

1.1 基本資料 納入我院30例確診的CV患者(CV組，未行刺五加治療)以及同期經(jīng)過刺五加治療后臨床療效評(píng)級(jí)為顯效的30例CV患者(治療組)，此外，招募30例健康對(duì)照受試者(健康組)。

CV組納入標(biāo)準(zhǔn)：①主訴眩暈；②經(jīng)影像學(xué)檢驗(yàn)并經(jīng)2位醫(yī)生診斷為椎動(dòng)脈頸椎?。虎廴紫佘?、10%葡萄糖注射液、維生素B6、輔酶A 100 U進(jìn)行常規(guī)治療[5]。治療組納入標(biāo)準(zhǔn)：①與CV組納入標(biāo)準(zhǔn)一致；②以三磷腺苷、10%葡萄糖注射液、維生素B6、輔酶A 100 U治療，刺五加注射液50 ml靜脈滴注1個(gè)療程；③臨床治療效果評(píng)為顯效，即患者感覺不到有眩暈的癥狀。

排除標(biāo)準(zhǔn)：①既往精神病史和藥物治療；②有血緣關(guān)系的患者；③非頸椎結(jié)果異常的其他因素引起的眩暈患者。

1.2 方法

1.2.1 試劑與耗材 人小膠質(zhì)細(xì)胞hmc-3購(gòu)于武漢普諾賽生命科技有限公司；EDTA管購(gòu)于上海新睿生物科技有限公司；QIAcube全自動(dòng)核酸純化系統(tǒng)全自動(dòng)核酸提取工作站購(gòu)于德國(guó)QIAcube公司；EpiTect Plus DNA亞硫酸氫鹽試劑盒購(gòu)于美國(guó)Qiagen公司；PyroMark Q24 Advanced試劑盒購(gòu)于上海研卉生物科技有限公司。細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8(Cell Counting Kit 8,CCK-8)購(gòu)于上海碧云天公司。酶標(biāo)儀FC購(gòu)于美國(guó)賽默飛世爾公司。RNA提取試劑盒、Power SYBR Green及高容量cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒均購(gòu)于大連Takara公司。RIPA蛋白提取試劑盒購(gòu)于美國(guó)Sigma-Aldrich公司。DRD2、CD16、CD32、CD86、Arginase1、CD206、GAPDH的第一抗體均購(gòu)于美國(guó)Abcam公司。Alexa染料購(gòu)于美國(guó)Invitrogen公司。DAPI購(gòu)于美國(guó)Life Technologies公司。AmpliTaq gold試劑盒購(gòu)于美國(guó)賽默飛公司。

1.2.2 血樣收集 采用EDTA管收集靜脈血。從全外周血白細(xì)胞中提取基因組DNA。根據(jù)制造商的協(xié)議，使用QIAcube全自動(dòng)核酸純化系統(tǒng)全自動(dòng)核酸提取工作站提取基因組DNA。于4 ℃保存純化的基因組DNA。

1.2.3 RT-qPCR 使用總RNA提取試劑盒抽提外周血總RNA或者小膠質(zhì)細(xì)胞的總RNA。使用高容量cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒，用隨機(jī)引物合成第一鏈cDNA，隨后使用Power SYBR Green在CFX96-Bio Rad實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)系統(tǒng)上進(jìn)行qPCR。使用GAPDH作為內(nèi)參基因?；蛞锶绫?。

表1 RT-qPCR引物序列

亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)換：根據(jù)生產(chǎn)商的說明嚴(yán)格使用EpiTect Plus DNA亞硫酸氫鹽試劑盒對(duì)基因組DNA(各1 000 ng)進(jìn)行亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)換。并按照試劑盒的協(xié)議對(duì)轉(zhuǎn)換后的基因組DNA進(jìn)行純化。

1.2.4 PCR擴(kuò)增與甲基化率檢測(cè) PCR擴(kuò)增：檢測(cè)的CpG-1至CpG-7位點(diǎn)的甲基化[9]，對(duì)CpG位點(diǎn)進(jìn)行擴(kuò)增。每個(gè)PCR樣品的最終反應(yīng)體積為40 μl，每個(gè)反應(yīng)均包含3.5 μl亞硫酸氫鹽-修飾的全基因組DNA、0.2 mM dNTPs、10×PCR緩沖液、0.5 U的AmpliTaq gold，以及0.2 μM正向和反向引物。循環(huán)條件：變性10 min，45個(gè)變性循環(huán)，95 ℃下變性30 s，60 ℃下退火30 s，在72 ℃下延伸1 min，最后在72 ℃延伸 10 min。

甲基化率檢測(cè)：分析7個(gè)CpG位點(diǎn)的甲基化率。使用PyroMark Q24 Advanced試劑盒對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序引物：5′-AGTTTTTAAAGGAGAAGATT-3′(CpG-1至CpG-7)，從而分析每個(gè)CpG甲基化率。隨后，使用PyroMark Q24 Advanced軟件對(duì)各組甲基化率進(jìn)行定量。

1.2.5 小膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng) 使用DMEM/F12培養(yǎng)基小膠質(zhì)細(xì)胞hmc-3，DMEM/F12中補(bǔ)充10%FBS和L-谷氨酰胺。培養(yǎng)于含5%CO2的37 ℃培養(yǎng)箱中，細(xì)胞2 d換液1次。使用刺五加注射液處理小膠質(zhì)細(xì)胞。分別使用20 μg、40 μg、80 μg的刺五加注射液處理細(xì)胞24 h[10]。收集細(xì)胞并進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.6 CCK-8實(shí)驗(yàn) 使用CCK-8測(cè)定hmc-3細(xì)胞存活率，嚴(yán)格按照生產(chǎn)商提供的說明書，使用酶標(biāo)儀FC在450 nm處測(cè)定細(xì)胞存活率。

1.2.7 蛋白質(zhì)印跡 用RIPA緩沖液提取細(xì)胞總蛋白，并用BCA測(cè)定法進(jìn)行定量。蛋白經(jīng)過SDS-PAGE電泳分離并使用NC膜進(jìn)行轉(zhuǎn)印，對(duì)膜使用一抗孵育過夜，隨后使用二抗孵育4 h。使用化學(xué)發(fā)光法對(duì)膜進(jìn)行顯色。使用Image Lab軟件通過光密度測(cè)定法定量蛋白條帶灰度強(qiáng)度。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.8 細(xì)胞免疫熒光 免疫熒光標(biāo)記細(xì)胞中DRD2蛋白的表達(dá)，將小膠質(zhì)細(xì)胞用4%多聚甲醛固定10 min，使用封閉液(50 mmol/L Tris緩沖液，含20%驢血清和0.3%Triton-X)孵育1 h。將DRD2一抗(1∶300)在4 ℃下孵育過夜：洗滌切片并在室溫下與綠色熒光Alexa染料偶聯(lián)的二抗孵育4 h。在Tris緩沖鹽水中洗滌并用DAPI對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行復(fù)染后，將蓋玻片裝在載玻片上。使用共焦激光顯微鏡獲取圖像。使用ImageJ軟件對(duì)共聚焦圖像DRD2陽性細(xì)胞進(jìn)行定量分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，并使用Shapiro-Wilk檢驗(yàn)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)。甲基化率遵循正態(tài)分布。用單因素方差分析比較健康組、CV組和治療組DRD2的表達(dá)、DRD2每個(gè)CpG的甲基化率，并檢測(cè)對(duì)照組和刺五加組小膠質(zhì)細(xì)胞的DRD2表達(dá)和M1/M2表型變化。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 刺五加治療對(duì)CV患者DRD2基因表達(dá)的影響 首先檢測(cè)CV組和健康組外周血中DRD2基因的mRNA表達(dá)水平，結(jié)果如圖1顯示，與健康組比較，CV組的DRD2 mRNA表達(dá)下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與CV組比較，治療組外周血中DRD2基因的mRNA表達(dá)上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖1 刺五加對(duì)CV患者體內(nèi)DRD2基因mRNA水平的影響

2.2 刺五加治療對(duì)CV患者DRD2基因甲基化率的影響 圖2A顯示所分析的DRD2啟動(dòng)子區(qū)域的位置。甲基化比較結(jié)果如圖2B，檢測(cè)30個(gè)CV組樣本和30個(gè)健康組樣本中DRD2基因的7個(gè)CpG位點(diǎn)的甲基化率，其中CpG-2(14.1±2.6vs.12.6±2.7，P=0.001)，CpG-4 (27.6±4.1vs.25.4±4.2，P=0.003)，CpG-5 (8.6±1.9vs.7.9±1.7，P=0.002)，CpG-6 (11.2±1.8vs.10.0±2.4，P=0.001)，CpG-7 (12.1±2.3vs.11.4± 3.0，P=0.002)。CV組的CpG-1～CpG-7的甲基化率平均值(14.2±1.9)均高于健康組(13.3±2.2)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.001)。如圖2C所示，刺五加治療對(duì)DRD2基因甲基化有影響，治療組的CpG-1～CpG-7的甲基化率(12.5±1.5)平均值低于CV組(14.7±1.8)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.001)。

圖2 刺五加對(duì)DRD2基因不同CpG位點(diǎn)甲基化率的影響

2.3 刺五加對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞增殖率的影響 刺五加注射液體外處理小膠質(zhì)細(xì)胞，觀察刺五加對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞增殖率的影響。如圖3，與對(duì)照組比較，20 μg刺五加組的增殖率變化差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。40 μg刺五加組小膠質(zhì)細(xì)胞增殖率升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.041)。80 μg刺五加組增殖率升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.016)。

圖3 通過CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)不同濃度的刺五加注射液對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞hmc-3增殖率的影響

2.4 刺五加對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞DRD2基因表達(dá)的影響 見圖4A、4B。與對(duì)照組比較，20 μg刺五加組中DRD2基因的mRNA水平和蛋白表達(dá)水平變化差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。40 μg刺五加組中DRD2基因的mRNA水平和蛋白表達(dá)水平上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.034)。80 μg刺五加組中DRD2基因的mRNA水平和蛋白表達(dá)水平上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.016)。如圖4C，使用免疫熒光法檢測(cè)DRD2在小膠質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)，結(jié)果與蛋白免疫印跡法一致。由于80 μg刺五加對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞的增殖率和DRD2有明顯的增加作用，因此選擇80 μg進(jìn)行后續(xù)研究。

圖4 RT-qPCR、蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)及細(xì)胞免疫熒光法分別檢測(cè)刺五加注射液對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞DRD2 mRNA(A)和蛋白水平(B/C)的影響

2.5 刺五加對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞DRD2甲基化率的影響 在小膠質(zhì)細(xì)胞中，刺五加組的CpG-1至CpG-7的甲基化率(12.63±3.8)低于對(duì)照組(14.69±2.8)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，見圖5。

圖5 刺五加對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞中DRD2基因不同CpG位點(diǎn)甲基化率的影響

2.6 刺五加對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞M1/M2極性的影響 使用RT-qPCR檢測(cè)對(duì)照組和刺五加組中M1表型CD16、CD32、CD86和M2表型Arginase 1、CD206的mRNA水平。結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，刺五加組中M1表型CD16、CD32、CD86的表達(dá)下調(diào)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，而Arginase 1、CD206的mRNA表達(dá)上調(diào)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，見圖6A。

圖6 刺五加對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞M1/M2極化標(biāo)志物的mRNA(A)和蛋白(B)水平的影響

使用蛋白免疫印跡法檢測(cè)小膠質(zhì)細(xì)胞M1/M2極化標(biāo)志物的蛋白水平，其中與對(duì)照組比較，CD16、CD32、CD86的表達(dá)下調(diào)，而Arginase1、CD206表達(dá)上調(diào)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，見圖6C。

3 討論

本研究以CV患者的臨床血液樣本為基礎(chǔ)，通過檢測(cè)刺五加對(duì)體內(nèi)DRD2甲基化率變化以及刺五加對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞的極性影響，探討了刺五加對(duì)CV治療的內(nèi)在機(jī)制。本研究結(jié)果表明，刺五加可能通過抑制CV患者DRD2的CpG位點(diǎn)甲基化促進(jìn)DRD2表達(dá)，此外,刺五加可以正向調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞的M2型極化特征，為探明刺五加治療CV疾病的內(nèi)在機(jī)制提供部分證據(jù)。

CV是一種源于頸椎病變引起腦供血不足導(dǎo)致的頭暈、頭痛、頸部疼痛為特征的疾病[11]。近年來，CV的發(fā)病率持續(xù)升高，發(fā)病人群明顯趨向于青年，對(duì)患者的生活質(zhì)量造成嚴(yán)重影響[12]，然而,CV存在誤診率高，且缺乏有效的診斷和治療策略。目前存在4種假說從不同方面解釋CV，包括本體感受性頸性眩暈、Barré-Lieou綜合征、椎動(dòng)脈旋轉(zhuǎn)性眩暈、偏頭痛相關(guān)性CV[13]。機(jī)制研究表明，頸椎退變是導(dǎo)致頸部結(jié)構(gòu)改變的關(guān)鍵因素，并引起頸部神經(jīng)壓迫、頸性疼痛合并肌張力障礙[13]。臨床研究報(bào)道，刺五加注射液對(duì)CV的臨床癥狀具有緩解作用，主要是通過放松過度緊張的頸部肌肉、通過頸神經(jīng)減壓、改善血液循環(huán)、緩解疼痛等方式從而達(dá)到緩解癥狀的作用[5]。本研究中納入的30例刺五加治療后療效為顯效的患者，其體內(nèi)DRD2基因CpG位點(diǎn)甲基化和表達(dá)有改變，并且我們?cè)隗w外水平同樣驗(yàn)證了刺五加對(duì)DRD2甲基化和表達(dá)的影響，這表明DRD2甲基化可能是刺五加調(diào)節(jié)CV的機(jī)制之一。

研究表明，刺五加提取物通過調(diào)節(jié)帕金森病小鼠的多巴胺受體從而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[6]。多巴胺是內(nèi)源性兒茶酚胺類物質(zhì)，直接通過調(diào)節(jié)多巴胺受體調(diào)控血管的收縮[14]。DRD2與腦、腎、腸系膜血管的舒張均有關(guān)[15]。研究表明，DRD2在肌張力異常及神經(jīng)損傷導(dǎo)致的疼痛中發(fā)揮重要作用[16]。而且在偏頭痛的研究中同樣發(fā)現(xiàn)偏頭痛患者的DRD2存在高度敏感性。既往對(duì)DRD2與炎性疼痛和神經(jīng)病理性疼痛的研究較多。Del Zompo等[17]研究表明，DRD2在不同類型的偏頭痛中的表達(dá)模式不同，甚至具有保護(hù)作用[18]。表觀遺傳學(xué)改變是提高疾病診斷效率的關(guān)鍵，本研究納入經(jīng)刺五加注射液治療后顯效的CV患者和未進(jìn)行治療的CV患者，檢測(cè)了血液中DRD2的表達(dá)和甲基化改變，從體內(nèi)和體外均觀察到刺五加對(duì)DRD2 CpG位點(diǎn)甲基化的負(fù)調(diào)節(jié)和對(duì)表達(dá)的正向調(diào)節(jié)。我們?cè)隗w外通過免疫熒光法直接觀察到80 μg刺五加上調(diào)DRD2表達(dá)的結(jié)果。因此，以上證據(jù)均支持刺五加可能通過對(duì)DRD2的甲基化和表達(dá)的調(diào)節(jié)從而改善CV癥狀。以上研究表明，DRD2的表觀遺傳學(xué)檢測(cè)是CV診斷和治療的潛在標(biāo)志物。

刺五加是我國(guó)東北地區(qū)常見的傳統(tǒng)草藥，常用于治療神經(jīng)退行性疾病，如腦缺血和抑郁[19]。已證實(shí)刺五加通過調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞的活化發(fā)揮對(duì)神經(jīng)的保護(hù)作用[7]。促炎(M1)表型和抗炎(M2)表型是小膠質(zhì)細(xì)胞活化的2種不同表型[20]，根據(jù)研究，刺五加通過調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的CD163、CD11b、CD80、CD64，從而促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M2型極化發(fā)展[21]。本研究數(shù)據(jù)也顯示刺五加下調(diào)小膠質(zhì)細(xì)胞的M1表型CD16、CD32、CD86，但上調(diào)M2表型Arginase 1、CD206的mRNA和蛋白水平。這表明刺五加可能通過促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞的抗炎表型的激活從而對(duì)CV疾病發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，可能是刺五加改善CV的另一個(gè)關(guān)鍵機(jī)制。

本研究仍存在樣本量的限制，因此需要更大的患者樣本；此外，需進(jìn)一步設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)確定刺五加對(duì)DRD2基因表達(dá)調(diào)節(jié)的下游機(jī)制及對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞M1/M2極化調(diào)節(jié)的機(jī)制。

綜上所述，本研究初步證實(shí)CV患者經(jīng)刺五加治療后DRD2啟動(dòng)子區(qū)域呈現(xiàn)低甲基化率，且刺五加可促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞向M2型極化發(fā)展，我們的研究為CV疾病的診斷靶點(diǎn)探索及對(duì)刺五加治療CV的機(jī)制研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。