連 婷，張瑞君，熊曉蘭，張小雅，余 濤，張世忠

(三峽大學(xué)醫(yī)學(xué)院 生理與病理學(xué)系，湖北 宜昌 443002)

鋅是人體中重要且必不可少的微量元素，在生化、免疫和臨床功能中均起著重要作用[1]。鋅缺乏是一個(gè)世界性的醫(yī)學(xué)問題，特別在發(fā)展中國家鋅缺乏尤為嚴(yán)重，鋅缺乏可使消化系統(tǒng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)和生殖系統(tǒng)等功能受損[2]。在心血管系統(tǒng)中，鋅缺乏還與心臟相關(guān)疾病有關(guān)，例如動(dòng)脈粥樣硬化、心力衰竭[3]。研究表明，心肌缺血/再灌注(ischemia-reperfusion，I/R)可損害心臟中鋅穩(wěn)態(tài)[4]，缺血性心肌病患者的鋅水平較低[5]。這些研究結(jié)果提示鋅缺乏與心肌I/R損傷密切相關(guān)。但是，目前現(xiàn)尚不清楚鋅缺乏導(dǎo)致心肌I/R損傷的確切機(jī)制。

線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(mitochondrial perme-ability transition pore，mPTP)位于線粒體內(nèi)膜中，其開放會(huì)導(dǎo)致線粒體腫脹、破裂，細(xì)胞色素C釋放，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡[6]，大量研究報(bào)道了mPTP在心肌I/R損傷中發(fā)揮重要作用[7-8]，但是mPTP是否也參與鋅缺乏相關(guān)的心肌I/R損傷，現(xiàn)尚不清楚。

本實(shí)驗(yàn)建立大鼠心肌I/R損傷模型，觀察mPTP開放在缺鋅大鼠心肌I/R損傷中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：清潔級(jí)雄性SD大鼠，體質(zhì)量(250±5)g[三峽大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào)：SCXK(鄂)2017-0012]，大鼠在實(shí)驗(yàn)過程中的處理符合動(dòng)物倫理學(xué)的要求。

1.1.2 主要試劑：缺鋅飼料和標(biāo)準(zhǔn)飼料(南通特洛菲飼料科技有限公司)；Masson染色試劑盒(武漢賽維爾生物科技有限公司)；氯化三苯四氮唑(2,3,5-triphenyl-tetrazolium，TTC)(Sigma-Aldrich公司)；乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)試劑盒(南京建成生物有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 缺鋅動(dòng)物模型的建立：將大鼠隨機(jī)分為2組：對(duì)照組(control)：飼喂含100 mg/(kg·d)鋅的標(biāo)準(zhǔn)飼料；缺鋅組(zinc deficiency)：飼喂含1.2 mg/(kg·d)鋅的缺鋅飼料，連續(xù)喂養(yǎng)6周。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中定時(shí)監(jiān)測每只大鼠的行為和體質(zhì)量變化。

1.2.2 血漿鋅含量的測量：用肝素作為抗凝劑采集大鼠血樣，在4 ℃、3 500 r/min離心10 min，獲得血漿，血漿鋅水平用原子吸收分光光度計(jì)測量，鋅水平以mg/L表示。

1.2.3 Masson染色觀察心肌纖維化：參照Masson染色試劑盒進(jìn)行染色。正常心肌組織染成紅色，膠原纖維染成藍(lán)色，顯微鏡下采集圖像。

1.2.4 Langendorff灌流離體心臟準(zhǔn)備及各組大鼠心臟灌流方案：給大鼠腹膜注射10%水合氯醛(3.5 mL/kg)麻醉后迅速取出心臟，經(jīng)主動(dòng)脈逆行插管固定在Langendorff裝置上，以恒壓5.59 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)、恒溫37 ℃的條件下用K-H緩沖液(以95% O2及5% CO2混合氣體飽和，pH為7.3～7.4)灌注。連續(xù)監(jiān)測左心室發(fā)展壓力(Left ventricular developed pressure，LVDP)、左心室舒張末期壓力(left ventricular end-diastolic pressure，LVEDP)、左心室壓力的最大上升/下降速度(±dp/dtmax)。冠脈流量通過使用校準(zhǔn)管按固定間隔定時(shí)收集流出液進(jìn)行測量，并以mL/min表示。各組大鼠心臟具體灌流方案為：1)對(duì)照組大鼠離體心臟灌流平衡20 min，全心缺血30 min，然后再灌注120 min；2)缺鋅組方法同對(duì)照組；3)zinc deficiency+CsA組在再灌注開始時(shí)先用0.2 μmol/L mPTP特異性抑制劑環(huán)孢霉素A(cyclosporin A，CsA)灌流10 min，其余同對(duì)照組；4)control+CsA組方法同(zinc deficiency+CsA)組。

1.2.5 測量梗死面積：心臟再灌注120 min后，在-20 ℃冷凍后橫向切成2 mm厚的切片，1% TTC的溶液中孵育(2～5)min，然后固定在10%甲醛10 min心臟切片經(jīng)TTC染色后，未梗死危險(xiǎn)區(qū)域，活組織被染成紅色，梗死組織為白色。使用Image/J(NIH)軟件測定梗死區(qū)域和危險(xiǎn)區(qū)域。以梗死區(qū)占危險(xiǎn)區(qū)的百分比表示心肌梗死程度。

1.2.6 冠脈流出物中LDH的測定：在再灌注5 min時(shí)收集來自離體灌注心臟的冠狀流出物，并用分光光度法測定LDH活性，以U/L表示。

1.2.7 線粒體的準(zhǔn)備：用含有160 mmol/L KCl、10 mmol/L EGTA(乙二醇-雙四乙酸，pH 7.4)和0.5%不含脂肪酸的BSA緩沖液對(duì)心臟組織進(jìn)行勻漿，將勻漿液在2 ℃、1 000×g離心10 min，取上清液在2 ℃、8 000×g離心10 min，將沉淀重懸于懸浮緩沖液(320 mmol/L蔗糖和10 mmol/L Tris-HCl，pH 7.4)中，并在2 ℃、8 000×g離心10 min，獲得純化的線粒體，并用考馬斯亮藍(lán)對(duì)線粒體蛋白進(jìn)行了定量。

1.2.8 電鏡檢測線粒體：將分離的線粒體固定在1%四氧化鋨的0.1 mol/L甲藻酸酯緩沖液中，于(0～4)℃固定120 min。然后，將樣品沖洗、脫水并包埋在Epon 812中。在超薄切片機(jī)上切下切片，用乙酸鈾酰和檸檬酸鉛染色，并在H-600透射電子顯微鏡下檢查確定。

1.2.9 mPTP開放的測量：為了測量mPTP的開放度，將分離的心臟線粒體重懸于溶脹緩沖液(含有120 mmol/L KCl、10 mmol/L Tris-HCl、20 mmol/L MOPS、5 mmol/L KH2PO4，pH 7.4)中，使其最終濃度為0.25 g/L，加入CaCl2(200 μmol/L)引發(fā)線粒體腫脹，于520 nm處檢測線粒體吸光度(A)來確定mPTP的開放度，mPTP開放程度以線粒體最大溶脹率表示。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 血漿中的鋅水平

與對(duì)照組相比，大鼠缺鋅飲食喂養(yǎng)3及6周后，缺鋅大鼠的血漿鋅含量明顯降低(P<0.01)(表1)。

表1 血漿鋅含量

2.2 鋅缺乏癥狀

缺鋅組大鼠的體質(zhì)量和心臟增重明顯低于對(duì)照組(P<0.05)(圖1A，B)。缺鋅組大鼠背部、腹部和口腔均出現(xiàn)嚴(yán)重的脫毛潰爛，大鼠活動(dòng)明顯減少，精神狀態(tài)較差(圖1C)。

*P<0.05 compared with control

2.3 心臟組織的病理變化

Masson染色結(jié)果所示，對(duì)照組大鼠心肌纖維排列整齊，細(xì)胞之間只有少量藍(lán)色膠原纖維，而缺鋅組大鼠心肌纖維斷裂且排列混亂，細(xì)胞間有大量膠原纖維沉積(圖2)。

圖2 大鼠心肌組織Masson染色圖

2.4 心功能變化

與對(duì)照組相比，缺鋅大鼠心肌缺血/再灌注30 min時(shí)，LVDP、±dp/dtmax顯著降低(P<0.01)，LVEDP明顯升高(P<0.05)。mPTP特異性抑制劑CsA(0.2 μmol/L)可以減輕鋅缺乏大鼠心肌缺血/再灌注引起的LVDP、±dp/dtmax降低(P<0.05)和LVEDP升高(P<0.05)(表2)。

表2 心功能各個(gè)指標(biāo)的改變

2.5 心肌梗死面積和LDH

與對(duì)照組相比，缺鋅大鼠心肌缺血/再灌注損傷引起的梗死面積和冠狀流出物中LDH釋放明顯增加(P<0.05)。CsA可減小缺鋅缺乏大鼠心肌缺血/再灌注損傷的梗死面積以及心肌冠脈流出液LDH含量(P<0.05)(圖3)。

*P<0.05 compared with control; 0.05 compared with zinc deficiency

2.6 線粒體的形態(tài)

在電子顯微鏡下，線粒體在腫脹(mPTP開放)之前顯示完整的膜和致密的基質(zhì)空間(圖4A)，但是在Ca2+引起的腫脹(mPTP開放)之后，外膜的破壞和嵴的消失很明顯(圖4B)。

A.fixation was performed following isolation; B.following exposure to 200 μmol/L CaCl2; the mitochondia were swollen(indicated by arrows)

2.7 鋅缺乏對(duì)mPTP開放的影響

與對(duì)照組相比，缺鋅大鼠缺血前心臟線粒體的mPTP開放顯著降低(P<0.05)，但是在缺血30 min后，mPTP開放顯著增加(P<0.05)(圖5)。

A.mPTP opening in mitochondrial was measured by spectrophotometric monitoring of the decrease in absorbance at 520 nm(A520)after addition of CaCl2(200 μmol/L); B.maximal swelling rates of mitochondria; *P<0.05 compared with control(before isc); #P<0.05 compared with zinc deficiency(before isc); isc.ischemia

3 討論

鋅在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、細(xì)胞功能調(diào)節(jié)中起著重要作用，在心血管系統(tǒng)的病理生理過程中發(fā)揮重要作用[2-3]。心臟I/R導(dǎo)致心肌組織中鋅的流失，并且在再灌注期間補(bǔ)充鋅可減輕心臟損傷[9]。缺血性心肌病患者的鋅水平也較低[5]。但是，現(xiàn)尚不清楚鋅缺乏時(shí)，鋅缺乏癥患者在發(fā)生心肌I/R時(shí)是否會(huì)遭受更嚴(yán)重的心臟損傷。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，缺鋅6周后大鼠具有明顯的缺鋅癥狀，且體質(zhì)量和心臟重量明顯降低，此時(shí)心肌纖維排列紊亂，膠原纖維大量沉積，鋅缺乏嚴(yán)重。與鋅水平正常的大鼠相比，鋅缺乏大鼠心肌I/R損傷更加嚴(yán)重，提示低鋅水平的患者可能更容易遭受更嚴(yán)重的心肌I/R損傷。

mPTP是位于線粒體內(nèi)膜上的非特異性孔，其開放會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞色素C的釋放，從而引起心肌細(xì)胞的凋亡，而鋅的添加會(huì)減少mPTP的開放[6]。已有研究發(fā)現(xiàn)，mPTP參與了心肌I/R損傷[8]。為了驗(yàn)證mPTP是否與鋅缺乏相關(guān)的心肌I/R損傷有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)在心臟缺血前線粒體中，發(fā)現(xiàn)缺鋅大鼠的mPTP開放比對(duì)照大鼠明顯減少，提示mPTP開放的減少可能是預(yù)防缺鋅所致傷害的補(bǔ)償，但其潛在機(jī)制有待于進(jìn)一步闡明。為了進(jìn)一步觀察mPTP在心肌I/R過程中的作用，本實(shí)驗(yàn)檢查了心臟缺血30 min后mPTP的開放程度，結(jié)果表明mPTP開放度在缺血后顯著高于缺血前，這表明mPTP的開放增強(qiáng)可能是導(dǎo)致缺鋅大鼠心臟I/R損傷增加的主要原因。為了進(jìn)一步證實(shí)這一推測，本實(shí)驗(yàn)使用了mPTP特異性抑制劑CsA來抑制再灌注期間mPTP的開放，結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，心肌I/R損傷明顯減輕，這很好地解釋了本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果，即為什么缺鋅大鼠在心肌缺血復(fù)灌后比正常鋅水平的大鼠有更嚴(yán)重的心臟損傷?；钚匝踉谛募/R損傷的發(fā)病機(jī)制中起著關(guān)鍵作用，即可觸發(fā)mPTP的開放[10]，而鋅是超氧化物歧化酶的組成部分，可提供抗氧化作用，穩(wěn)定細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)[11]。因此，本實(shí)驗(yàn)推測缺鋅可能會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞抗氧化能力的降低，增加了mPTP開放，進(jìn)一步導(dǎo)致心肌I/R損傷的加重。

本研究表明鋅缺乏可通過誘發(fā)心肌I/R期間mPTP的開放增加，從而介導(dǎo)鋅缺乏大鼠心臟I/R損傷。