周旖妮，王歡，楊景峰，于永利,2,#，董武,*

1. 內(nèi)蒙古自治區(qū)毒物監(jiān)控及毒理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，內(nèi)蒙古民族大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，通遼028000 2. 內(nèi)蒙古民族大學(xué)生命科學(xué)與食品學(xué)院，通遼 028000

硒(selenium, Se)是人和動(dòng)物正常生長(zhǎng)和發(fā)育所需的一種天然微量元素。但當(dāng)其濃度較高時(shí)，會(huì)產(chǎn)生毒性作用[1-2]。硒經(jīng)由農(nóng)業(yè)灌溉排水、采礦作業(yè)和燃煤殘留物進(jìn)入淡水環(huán)境[3]。令人擔(dān)憂的是，富硒煤灰排放到附近水域，導(dǎo)致硒積累的增加，并對(duì)居民和各種動(dòng)物產(chǎn)生負(fù)面影響。美國(guó)北卡羅來(lái)納州貝勒斯湖和薩頓湖受到含硒煤灰的污染，也造成湖內(nèi)魚(yú)類組織中的硒含量超標(biāo)，硒含量遠(yuǎn)超毒性閾值[4-5]。

硒代蛋氨酸(seleno-L-methionine,SeMet)是水生食物鏈中有機(jī)硒的主要形式，有機(jī)硒對(duì)胚胎發(fā)育作用明顯[6-7]。當(dāng)親代(F0)飲食中的SeMet在體內(nèi)積累到一定程度時(shí)會(huì)影響魚(yú)卵的發(fā)育，甚至導(dǎo)致畸形[8-9]。許多魚(yú)類的早期生命階段對(duì)環(huán)境污染物非常敏感[10]。魚(yú)類對(duì)硒的敏感性可能與其硒蛋白含量高有關(guān)[11]。在鹽度水平較高的環(huán)境下，青鳉魚(yú)(Oryziaslatipes)對(duì)SeMet毒性尤為敏感，可導(dǎo)致死亡率、孵化率和畸形率增加[12-13]。

有關(guān)硒毒性機(jī)制，有2種假說(shuō)：(1)蛋白質(zhì)組裝過(guò)程中硫被取代導(dǎo)致分子結(jié)構(gòu)和功能改變；(2)氧化應(yīng)激導(dǎo)致蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和DNA損傷[6,14]。后者最受關(guān)注。氧化應(yīng)激是有機(jī)體對(duì)外來(lái)或者內(nèi)部代謝化學(xué)物質(zhì)的應(yīng)激反應(yīng)。很多化學(xué)物質(zhì)導(dǎo)致氧自由基和脂質(zhì)過(guò)氧化物的過(guò)量產(chǎn)生，進(jìn)而有機(jī)體會(huì)應(yīng)激產(chǎn)生過(guò)量的抗氧化劑或自由基清除酶，對(duì)細(xì)胞造成損害[15-16]。有機(jī)硒是否影響超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、過(guò)氧化氫酶(catalase, CAT)等抗氧化酶，并增加活性氧(reactive oxygen species, ROS)和丙二醛(malondialdehyde, MDA)的產(chǎn)生，從而對(duì)多個(gè)器官造成氧化損傷還有待研究。ROS過(guò)量產(chǎn)生，或抗氧化劑減少，導(dǎo)致生物大分子受損，危及細(xì)胞的健康[17]。ROS激活涉及轉(zhuǎn)錄因子NF-E2相關(guān)因子2(Nrf2)，它與抗氧化反應(yīng)元件(antioxidant response element, AREs)結(jié)合，并調(diào)節(jié)對(duì)氧化劑和親電試劑的適應(yīng)性反應(yīng)[18]。宿主代謝將SeMet轉(zhuǎn)化為能夠氧化谷胱甘肽(glutathione,GSH)的硫醇等化合物以產(chǎn)生超氧化物，進(jìn)而導(dǎo)致氧化應(yīng)激[19-20]。而谷胱甘肽過(guò)氧化物酶4(glutathione peroxidase4,GPx4)是谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GPx)蛋白質(zhì)家族的成員，通過(guò)還原GSH催化過(guò)氧化氫和脂質(zhì)過(guò)氧化物的還原，從而保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷[21]。Arnold等[22]報(bào)道斑馬魚(yú)(Daniorerio)胚胎暴露于SeMet造成氧化應(yīng)激以及GSH關(guān)聯(lián)基因表達(dá)的增加。

青鳉魚(yú)作為發(fā)育生物學(xué)模式生物有著悠久的歷史[23]。研究表明青鳉魚(yú)更有利于生命早期發(fā)育階段的胚胎毒性研究[24-25]。相比于斑馬魚(yú)的發(fā)育，青鳉魚(yú)有相對(duì)較長(zhǎng)的發(fā)育時(shí)期，且早期胚胎透明，可以通過(guò)透明絨毛膜看到胚胎的發(fā)育狀態(tài)[26-27]。此外，有大量的分子工具可用于研究毒性機(jī)制，包括與氧化應(yīng)激相關(guān)的基因[28-29]。

本研究的目的是確定SeMet水溶液對(duì)青鳉胚胎生存和發(fā)育的影響，特別是SeMet造成的形態(tài)學(xué)變化。為了確定SeMet的毒性作用機(jī)制，探討了SeMet的氧化應(yīng)激機(jī)制和特定基因表達(dá)的變化。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 青鳉魚(yú)和暴露方法

青鳉魚(yú)在循環(huán)水系統(tǒng)中繁育和維護(hù)。溫度維持在24 ℃，在pH 7.2的循環(huán)水條件下飼喂，并以14 h∶10 h的光∶暗循環(huán)進(jìn)行光線調(diào)節(jié)。每天2次喂食飼料(Otohimeβ1 diet, Pentair Aquatic Eco-Systems, USA)，并補(bǔ)充豐年蝦(90% Great Lakes Strain, Pentair Aquatic Eco-Systems, USA)。在早晨喂食約1 h后收集受精卵。通過(guò)在濕潤(rùn)紙巾上輕輕滾動(dòng)來(lái)清潔和分離受精卵，當(dāng)胚胎發(fā)育至6～7 hpf(hours post-fertilization)，青鳉卵被轉(zhuǎn)移到6孔組織培養(yǎng)板(VWR, Corning)實(shí)施暴露，暴露至10 dpf (day post fertilization)，期間每24 h更換一次暴露液，每個(gè)孔10個(gè)受精卵(3～10個(gè)重復(fù))。每孔含有5 mL 0.1%(m/V)鹽水、0.1%(V/V)二甲基亞砜(DMSO, Sigma-Aldrich, USA)或者SeMet(Sigma Aldrich, USA)的水溶液(0、0.1、1、10、100、500和1 000 μmol·L-1)。

1.2 胚胎觀察和影像學(xué)

根據(jù)Iwamatsu[26]和Kinoshita等[27]的研究方法，使用尼康SMZ1500立體顯微鏡進(jìn)行檢查(Nikon Instruments, Inc., USA)，每天檢測(cè)直至10 dpf，記錄各種表型的改變[30-31,9]。通過(guò)檢測(cè)確定存活率和孵化率，并且根據(jù)改良寇式計(jì)算法計(jì)算LC50[32]。表型改變包括：心包水腫(心包腔內(nèi)有液體滯留導(dǎo)致心臟與心臟外膜之間空間變大)；腹部水腫(發(fā)育中的內(nèi)臟與卵黃囊背緣之間有清晰的空間)；顱面異常、頜部或眼睛大小和/或形狀改變；脊索畸形；脾臟顏色變化、身體表皮顏色缺乏或變化；膽囊顏色缺乏或變化；尾部血液循環(huán)遲緩，尾部血流停滯；血液顏色蒼白程度(紅色減少或缺乏)；鰾的發(fā)育和充盈程度(孵化后鰾的充氣或未充氣)；運(yùn)動(dòng)狀態(tài)的改變(活動(dòng)能力缺乏或減少)；以及上面未列出其他表型。觀察時(shí)，魚(yú)體在解剖學(xué)上被定位于右側(cè)側(cè)臥位，并盡量避免傾斜，從而使魚(yú)頭部指向左側(cè)。每天檢測(cè)拍照，直至第10天對(duì)所有圖片和數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

LC50的95%可信限=log-1(logLC50±1.96×SX50)

式中：i表示組距，即相鄰2組劑量對(duì)數(shù)劑量之差；Xm表示最大劑量對(duì)數(shù)；p表示各劑量組死亡率；pm表示最高死亡率；q表示各劑量組存活率；pn表示最低死亡率；∑p表示各劑量組死亡率之和；n表示各組動(dòng)物數(shù)；SX50表示logLC50的標(biāo)準(zhǔn)誤。

1.3 胚胎樣品前處理及硒濃度測(cè)定

為了評(píng)估硒通過(guò)絨毛膜的滲透，將青鳉魚(yú)胚胎(6～7 hpf)放置于6孔板中，并暴露于10 μmol·L-1SeMet。當(dāng)胚胎發(fā)育到6 dpf時(shí)，將整個(gè)胚胎清洗后放在預(yù)先清潔、有蓋的玻璃瓶中稱量，并添加1 mL微量金屬級(jí)濃硝酸(HNO3, Sigma-Aldrich, USA)。將小瓶放置在85 ℃的金屬浴上過(guò)夜直到內(nèi)容物消失變清。然后將小瓶從金屬浴中取出并在室溫下冷卻約15 min。冷卻后，用9 mL 2%HNO3和0.5%鹽酸(HCl, Sigma-Aldrich, USA)溶液稀釋消化液。使用6 mL·min-1的H2流速，高純度標(biāo)準(zhǔn)(High Purity Standards, USA)控制實(shí)驗(yàn)用水。采用電感耦合等離子體質(zhì)譜法(Agilent 7700X ICP-MS equipped with an Octopole Reaction System)測(cè)定硒濃度。

1.4 組織切片和蘇木精-伊紅(HE)染色

青鳉魚(yú)胚胎發(fā)育至10 dpf后收集到離心管中，用4%的多聚甲醛(PFA)固定過(guò)夜，然后用一系列濃度乙醇脫水，二甲苯透明處理后用石蠟包埋，并制作5 μm切片，放置于37 ℃恒溫箱中烘干用于HE染色。當(dāng)染色時(shí)，切片首先經(jīng)過(guò)二甲苯脫蠟10 min，接著用一系列濃度乙醇(100%、95%、90%、80%和70%)浸泡各2 min；然后進(jìn)行常規(guī)HE染色并封片鏡檢。

1.5 總RNA提取

從對(duì)照組(10 dpf)、暴露組(0.1、1、10和100 μmol·L-1)的整個(gè)胚胎中提取RNA。收集后，使用勻漿儀(Kinematica, GT10-35，瑞士)將胚胎在1mL TRIzol?RNA試劑(Life Technologies, USA)中均質(zhì)分散組織并獲取RNA。接下來(lái)，按照Dong等[30]的方法分離出總RNA。在樣品洗脫前，DNA用DNAase酶切，并根據(jù)制造商的說(shuō)明(Qiagen, USA)用無(wú)RNase和無(wú)DNase水進(jìn)行洗脫。使用NanoDropND-1000分光光度計(jì)(Thermo Fisher Scientific, Inc., USA)測(cè)定RNA含量和260 nm/280 nm的比值。

1.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

采用高容量cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Applied Biosystems, USA)，使用250 ng總RNA合成互補(bǔ)DNA(cDNA)，反應(yīng)體系為20 μL。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)檢測(cè)胚胎中Nrf2、GPx4和18S轉(zhuǎn)錄水平。使用PrimerQuest(Integrated DNA Technologies, USA)設(shè)計(jì)了青鳉特異性qPCR引物(表1)。采用96孔PCR板和ABIPlus One(Applied Biosystems)分別對(duì)Nrf2、GPx4和18ScDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。每20 μL qPCR反應(yīng)，用6 μL(0.1 ng·μL-1)first strand cDNA、2 μmol·L-1forward primer、2 μmol·L-1reverse primer和10 μL QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix擴(kuò)增cDNA(Qiagen, Inc., USA)。qPCR反應(yīng)條件為95 ℃、15 min，實(shí)施40個(gè)循環(huán)，94 ℃、15 s，60 ℃、30 s。以18S的mRNA表達(dá)量作為標(biāo)準(zhǔn)，使用2-ΔΔCt計(jì)算相對(duì)表達(dá)量[33]。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物Table 1 Primer sequences for RT-qPCR

1.7 SOD、MDA和ROS的檢測(cè)

青鳉魚(yú)胚胎從6～7 hpf暴露至10 dpf進(jìn)行SOD、MDA和ROS的檢測(cè)。SOD的檢測(cè)利用高度水溶性四唑鹽(MTT)法，其與超氧陰離子(·O2-)反應(yīng)生成一種水溶性染料，在基于黃嘌呤氧化酶偶聯(lián)反應(yīng)的基礎(chǔ)上檢測(cè)。使用鉬酸銨法檢測(cè)CAT活性，使用碘巴比妥酸技術(shù)在532 nm處測(cè)定MDA含量，通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)二氯熒光素(DCFH)的熒光強(qiáng)度來(lái)確定ROS水平，熒光發(fā)射波長(zhǎng)為485 nm，激發(fā)波長(zhǎng)為525 nm。使用BCA蛋白檢測(cè)試劑盒檢測(cè)每個(gè)樣品的總蛋白水平。

1.8 統(tǒng)計(jì)分析

所有結(jié)果的分析采用t-test、one-way ANOVA和post-hoc Tukey-Kramer測(cè)試的方法(GraphPad Software, Inc. USA)。分析采用95%(α=0.05)可信限，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果(Results)

2.1 有機(jī)硒暴露在青鳉魚(yú)胚胎中的殘留

ICP-MS分析顯示，硒的暴露造成青鳉魚(yú)胚胎中硒濃度顯著升高(P<0.05)。對(duì)照組胚胎的硒濃度為0.294 mg·kg-1(以濕質(zhì)量計(jì))，暴露于10 μmol·L-1SeMet的胚胎的硒濃度為1.17 mg·kg-1(圖1(b))。暴露胚胎絨毛膜的硒明顯高于對(duì)照組(P<0.05)。

圖1 硒代蛋氨酸(SeMet)分子式及其在青鳉魚(yú)胚胎中的殘留注：(a)有機(jī)硒分子式；(b) 10 μmol·L-1 SeMet暴露在青鳉魚(yú)胚胎中的殘留，濃度以單位濕質(zhì)量計(jì)；通過(guò)t檢驗(yàn)檢測(cè)2組之間的差異，不同字母表示暴露組與對(duì)照組之間的顯著差異(P<0.05)。Fig. 1 Seleno-L-methionine (SeMet) molecules and SeMet residues in medaka embryosNote: (a) Molecular of SeMet; (b) Effect of 10 μmol·L-1 SeMet exposure on selenium content in medaka embryos, and the content is expressed based on wet mass; differences between the two groups were detected by the t-test, and the different letters indicate significant differences between the exposure and control groups (P<0.05).

2.2 有機(jī)硒對(duì)青鳉魚(yú)胚胎死亡率和孵化率的影響

當(dāng)胚胎發(fā)育到9 dpf時(shí)，對(duì)照組生存率維持在98.6%，而當(dāng)SeMet暴露(0.1、1、10、100、500和1 000 μmol·L-1)時(shí)，隨著濃度的升高時(shí)生存率也逐漸降低，生存率分別是92.5%、90%、32.5%、41.3%、52.5%和0%)(圖2(a))。0.1 μmol·L-1和1 μmol·L-1暴露組的生存率在1～10 d時(shí)接近，沒(méi)有顯著差異(P>0.05)。有趣的是，10 μmol·L-1暴露組的生存率從6 d開(kāi)始顯著低于100 μmol·L-1和500 μmol·L-1暴露組(P<0.01)。當(dāng)染毒到9 d和10 d時(shí)，10、100、500和1 000 μmol·L-1暴露組的生存率都顯著低于對(duì)照組的(P<0.01)(圖2(a))。通過(guò)改良寇式方法得出9 dpf的LC50為11.0739 μmol·L-1，其95%置信范圍為10.3777～11.8168 μmol·L-1。孵化率也是體現(xiàn)胚胎發(fā)育狀態(tài)的重要指標(biāo)。對(duì)照組的孵化率在第10天達(dá)到88.5%，而0.1、1、10、100、500和1 000 μmol·L-1SeMet暴露組的孵化率分別為87.9%、86.9%、80%、63.8%、0%和0%(圖2(b))。與對(duì)照組相比，100、500和1 000 μmol·L-1SeMet顯著降低了青鳉魚(yú)的孵化率(P<0.05)?？紤]生存率和孵化率的原因，采用0.1、1、10和100 μmol·L-1的SeMet進(jìn)行進(jìn)一步研究。

圖2 不同濃度SeMet暴露對(duì)青鳉胚胎(幼魚(yú))生存率和孵化率的影響注：(a)存活率；(b)孵化率；6～7 hpf青鳉魚(yú)胚胎暴露SeMet的水溶液后，每天觀察胚胎，計(jì)算存活和孵化數(shù)直到10 dpf；每組包含10個(gè)胚胎，每組3個(gè)重復(fù)；(a)中*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001，與對(duì)照組相比；(b)中不同字母表示2組之間的顯著差異(P<0.05)。Fig. 2 Effect of different concentrations of SeMet exposure on survival rate and hatching rate of medaka embryos (larva)Note: (a) Survival rate; (b) Hatching rate; embryos developing 6～7 hpf were exposed to SeMet aqueous solution; embryos were observed each day and survival or hatching numbers were counted until 10 dpf; each group contains 10 embryos, with 3 replicates in each group; *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001, compared with the control in figure (a); different letters indicate significant differences (P<0.05) in figure (b).

2.3 有機(jī)硒對(duì)青鳉魚(yú)胚胎表型的影響

有機(jī)硒造成青鳉魚(yú)胚胎發(fā)生多種畸形，首先觀察到心包水腫。在對(duì)照組中只有0.71%的胚胎出現(xiàn)心包水腫，而在10 dpf時(shí)，0.1、1、10和100 μmol·L-1SeMet暴露組的心包水腫發(fā)生率分別為1.3%、7%、3.9%和5%(圖3(b)、(d)和(e))。隨著SeMet暴露濃度的增加，心包水腫率有增加的趨勢(shì)，但各組之間沒(méi)有顯著差異。但通過(guò)組織切片和HE染色進(jìn)一步確認(rèn)發(fā)生心包膜水腫的幼魚(yú)，發(fā)現(xiàn)心臟被牽拉成為細(xì)長(zhǎng)試管形狀，心臟內(nèi)壁變薄，甚至呈現(xiàn)單細(xì)胞狀態(tài)(圖3(d))。其次，在6 dpf時(shí)發(fā)現(xiàn)SeMet暴露造成血液變淡(白血)。對(duì)照組出現(xiàn)血液變淡的比例為0%，而0.1、1、10和100 μmol·L-1組分別為0%、2.5%、50%和46.8%。與對(duì)照組相比，10 μmol·L-1和100 μmol·L-1組中該表型個(gè)體百分比顯著增加(P<0.05)(圖4(d)～(g))。此外，還觀察到腹部水腫、顱面異常、脊索畸形、脾臟和膽囊顏色的改變、尾部血液循環(huán)的改變、SeMet暴露組的魚(yú)鰾改變和其他改變，并有劑量依賴性增加的趨勢(shì)。雖然沒(méi)有定量，但做了總的畸形率統(tǒng)計(jì)。對(duì)照組的總改變率為4.1%。與對(duì)照組相比，0.1、1、10和100 μmol·L-1SeMet暴露組的總變化率分別增加了1.4倍、12.5倍、28.4倍和24.9倍。0.1 μmol·L-1和1 μmol·L-1SeMet暴露組的發(fā)生率較低，與對(duì)照組相比沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。但10 μmol·L-1組和100 μmol·L-1組的總變化率明顯高于對(duì)照組(P<0.05，圖5(a))。

圖3 不同濃度SeMet暴露對(duì)青鳉胚胎(幼魚(yú))心包水腫的影響注：(a)和(c) 對(duì)照組胚胎；(b)和(d) SeMet暴露組；(c)和(d) HE染色；(e)10 dpf時(shí)心包水腫的發(fā)生率圖；(a)和(b)中的紅色箭頭表示心臟，**表示魚(yú)鰾；(c)和(d)中的雙箭頭表示心臟壁；h表示心臟；每組包含10個(gè)胚胎，每組3個(gè)重復(fù)。Fig. 3 Effect of different concentrations of SeMet exposure on pericardial edema of medaka embryos (larva)Note: (a) and (c) Control embryos; (b) and (d) SeMet exposed group; (c) and (d) HE staining; (e) Plot of the incidence of pericardial edema at 10 dpf; the red arrow indicates the heart, and **indicates the swim bladder, in (a) and (b); double arrows indicate the heart wall, and h indicates heart, in (c) and (d); each group contains 10 embryos, with 3 replicates in each group.

圖4 不同濃度SeMet暴露后青鳉胚胎(幼魚(yú))出現(xiàn)的白血表型注：(a)～(c)對(duì)照組；(d)～(f) 100 μmol·L-1 SeMet暴露組；(b)和(e)分別是(a)和(d)的高倍放大圖；(g)白血表型的發(fā)生；e表示眼睛，h表示心臟，o表示心包，s表示魚(yú)鰾，g表示鰓；每組包含10個(gè)胚胎，每組3個(gè)重復(fù)；不同字母表示2組之間的顯著差異(P<0.05)。Fig. 4 Effect of different concentrations of SeMet exposure on white blood phenotype of medaka embryos (larva)Note：(a)～(c) Control group; (d)～(f) 100 μmol·L-1 SeMet exposed group; (b) and (e) are high magnification figure of (a) and (d), respectively; (g) Occurrence of white blood phenotype; e indicates eye; h indicates heart; o indicates oil drop; s indicates swim bladder; g indicates gill; each group contains 10 embryos, with 3 replicates in each group; different letters indicate significant difference (P<0.05).

圖5 不同濃度SeMet暴露后青鳉胚胎(幼魚(yú))出現(xiàn)的表型注：(a)10 dpf時(shí)所有表型改變的比率；(b)計(jì)算游泳表現(xiàn)發(fā)生改變的比率；每組包含10個(gè)胚胎，每組3個(gè)重復(fù)；不同字母表示2組之間的顯著差異(P<0.05)。Fig. 5 Effect of different concentrations of SeMet exposure on the phenotype of medaka embryos (larva)Note: (a) The rate of all altered phenotypes at 10 dpf were counted; (a)The rate of individuals showing alterations in swimming performance were counted; each group contains 10 embryos, with 3 replicates in each group; different letters indicate significant difference (P<0.05).

2.4 有機(jī)硒對(duì)青鳉幼魚(yú)行為學(xué)的影響

觀察了孵化后個(gè)體行為學(xué)的變化。對(duì)照組幼魚(yú)魚(yú)鰾開(kāi)始發(fā)育，表現(xiàn)出快速運(yùn)動(dòng)、在水柱內(nèi)的一致位置和垂直方向。然而，當(dāng)暴露于SeMet后，一些胚胎顯示出異常改變，對(duì)照組、0.1、1、10和100 μmol·L-1組中異常改變比率分別為2.5%、2%、15%、28.7%和29.9%。暴露造成的運(yùn)動(dòng)改變顯示出不規(guī)則的劑量依賴性增加趨勢(shì)，差異不顯著(圖5(b))。

2.5 有機(jī)硒對(duì)氧化應(yīng)激關(guān)聯(lián)基因表達(dá)的影響

考察有機(jī)硒的暴露與氧化應(yīng)激相關(guān)的基因表達(dá)的變化關(guān)系，與對(duì)照組相比，Nrf2在1、10和100 μmol·L-1組中的表達(dá)量分別增加了0.96倍、0.92倍和2.1倍。100 μmol·L-1暴露組的Nrf2表達(dá)量顯著高于對(duì)照組和0.1 μmol·L-1組(P<0.05)。GXP4在1、10和100 μmol·L-1組中的表達(dá)量分別為1.5倍、2.1倍和3.7倍(圖6)。雖然沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但暴露組GPx4表達(dá)呈劑量依賴性增加趨勢(shì)。

圖6 不同濃度SeMet暴露后青鳉胚胎(幼魚(yú))氧化應(yīng)激基因表達(dá)注：(a) Nrf2；(b) Gpx4；從6～7 hpf到10 dpf，胚胎暴露于SeMet水溶液，并收集幼魚(yú)進(jìn)行RT-qPCR分析；每組包含10個(gè)胚胎，每組至少3個(gè)重復(fù)；不同字母表示2組之間的顯著差異(P<0.05)。Fig. 6 Effect of different concentrations of SeMet exposure on oxidative stress gene of medaka embryos (larva)Note:(a) Nrf2; (b) Gpx4; embryos were exposed to SeMet aqueous solution from 6～7 hpf until 10 dpf and collected the larva for the RT-qPCR analysis; each group contains 10 embryos, with 3 replicates at least in each group; different letters indicate a significant difference (P<0.05).

2.6 有機(jī)硒暴露對(duì)青鳉魚(yú)造成氧化應(yīng)激

當(dāng)胚胎發(fā)育到10 dpf時(shí)測(cè)定SOD、CAT活性和MDA、ROS含量。與對(duì)照組相比，0.1 μmol·L-1和1 μmol·L-1的有機(jī)硒沒(méi)有引起SOD活性的變化，但10 μmol·L-1和100 μmol·L-1有機(jī)硒降低了SOD活性，分別顯著降低了31.1%和32.8%(P<0.05)(圖7(a))。有機(jī)硒有引起CAT活性降低的趨勢(shì)，但沒(méi)有顯著變化(P>0.05)(圖7(b))。同樣0.1 μmol·L-1和1 μmol·L-1有機(jī)硒沒(méi)有引起MDA和ROS的變化，但10 μmol·L-1和100 μmol·L-1的有機(jī)硒暴露顯著增高了MDA含量(1.39倍，P<0.05；1.40倍，P<0.05)，也增高了ROS(1.37倍，P<0.05；1.23倍，P>0.05)含量(圖7(c)和(d))。

圖7 不同濃度SeMet暴露后青鳉胚胎(幼魚(yú))氧化應(yīng)激指標(biāo)注：(a) SOD活性；(b) CAT活性；(c) ROS含量；(d) MDA含量；胚胎在6～7 hpf至10 dpf期間暴露于SeMet水溶液；不同字母表示顯著差異(P<0.05)；每組包含10個(gè)胚胎，每組3個(gè)重復(fù)。Fig. 7 Effect of different concentrations of SeMet exposure on oxidative stress measurement of medaka embryos (larva)Note: (a) SOD activity; (b) CAT activity; (c) ROS content; (d) MDA content; embryos were exposed to a range of SeMet aqueous solution from 6～7 hpf to 10 dpf; different letters indicate significant differences (P<0.05); each group contains 10 embryos, with 3 replicates in each group.

3 討論(Discussion)

暴露于SeMet水溶液會(huì)影響青鳉魚(yú)胚胎的發(fā)育。SeMet(10～1 000 μmol·L-1)暴露造成胚胎的存活率和孵化率的降低，10 μmol·L-1和100 μmol·L-1SeMet引起的總表型變化明顯多于對(duì)照組。本研究發(fā)現(xiàn)SeMet暴露增加了異常表型，并呈現(xiàn)濃度-效應(yīng)依賴性。有趣的是，10 μmol·L-1組與最高暴露組(100 μmol·L-1)有相似的反應(yīng)，表現(xiàn)出中劑量效應(yīng)。此外，氧化應(yīng)激相關(guān)基因表達(dá)的增加可能是造成SeMet毒性作用的起因。

青鳉魚(yú)的絨毛膜只有輕微的滲透性，可對(duì)水溶性外源毒性物質(zhì)造成一定程度的阻隔[31,34]。ICP-MS能夠確定胚胎暴露的硒的量，并確定絨毛膜的保護(hù)作用。研究認(rèn)為，在對(duì)照組胚胎中檢測(cè)到的硒在微量營(yíng)養(yǎng)素水平，胚胎中的硒被認(rèn)為是從母體飲食獲得[35]。在暴露胚胎中觀察到硒含量的升高，表明SeMet穿過(guò)絨毛膜到達(dá)胚胎并影響其發(fā)育。

本研究觀察到有機(jī)硒造成青鳉胚胎存活率的下降，并有一定的濃度依賴性，在10 μmol·L-1SeMet時(shí)具有中劑量效應(yīng)。Arnold等[22]發(fā)現(xiàn)100 μg·L-1和400 μg·L-1SeMet暴露造成斑馬魚(yú)胚胎死亡率的增加。Kupsco和Schlenk[12-13]也報(bào)道，在5～6 hpf時(shí)5 μmol·L-1SeMet暴露會(huì)造成青鳉胚胎存活率下降，即使在胚胎的1～8 dpf時(shí)暴露也會(huì)造成存活率的下降。本研究也發(fā)現(xiàn)存活率的降低，并通過(guò)改良寇式方法得出9 dpf的LC50為11.0739 μmol·L-1。而5～6 dpf后觀察到的存活率下降可能是由于孵化前絨毛膜通透性增加，允許SeMet的額外流入[22,34]。然而，本研究結(jié)果還不能解釋為什么在10 μmol·L-1時(shí)觀察到如此高的死亡率。SeMet暴露由3位不同的研究人員實(shí)施重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果相同。同時(shí)還觀察到，SeMet也造成10 dpf青鳉胚胎孵化率下降的總體趨勢(shì)，同樣，Villalobos等[31]也有報(bào)道，持續(xù)暴露SeMet導(dǎo)致孵化減少。確定孵化延遲或缺失的確切原因需要探討包括宿主的生理過(guò)程和/或酶活性與硒相關(guān)的特定變化，這在未來(lái)有必要深入研究。

本研究對(duì)6～7 hpf胚胎的暴露顯示出與Kupsco和Schlenk[12-13]在5～6 hpf暴露時(shí)相似的表型變化，他們觀察到了更大的心臟和顱面畸形，并且硒組織濃度為5～6 μg·g-1時(shí)孵化率降低。雖然沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但本研究早在3 dpf時(shí)就觀察到心包水腫，直到胚胎發(fā)育到5～9 dpf(結(jié)果未展示)。在早期階段，水腫的出現(xiàn)與心臟生長(zhǎng)和分化的主要發(fā)育相一致[26]。在斑馬魚(yú)胚胎的硒暴露實(shí)驗(yàn)中也出現(xiàn)心包水腫，包括納米硒、四氯化硒(SeCl4)和亞硒酸鈉(Na2SeO3)[36-38]。

本研究首次發(fā)現(xiàn)有機(jī)硒造成血液顏色變淺的表型。硬骨魚(yú)的造血功能已經(jīng)非常明確，血液參數(shù)(即離子濃度、血紅蛋白和紅細(xì)胞壓積)也已被用作污染物引起生理反應(yīng)的指標(biāo)[39]。硒可以與血紅蛋白結(jié)合，使其不能攜帶氧氣，導(dǎo)致紅細(xì)胞死亡和呼吸能力下降[40]。已有研究表明，成魚(yú)以及胚胎硒暴露會(huì)造成血液的變化[38-39]；在斑馬魚(yú)體內(nèi)，硒蛋白在胚胎中胚層和血細(xì)胞中特異性的表達(dá)[41]。已有研究證實(shí)了GPx在血液中的重要性，它被GSH還原為硒化物，然后運(yùn)輸?shù)窖獫{，選擇性地與白蛋白結(jié)合，最后轉(zhuǎn)移到肝臟[42]。本研究雖不能將觀察到的血液體顏色變淺的表型歸因于特定的血液學(xué)指標(biāo)異常，但這可能與GSH和氧化應(yīng)激相關(guān)，未來(lái)有必要深入探索青鳉造血的機(jī)制[43]。

本研究還觀察了SeMet暴露對(duì)幼魚(yú)運(yùn)動(dòng)的影響。成年斑馬魚(yú)飼喂含硒飼料可造成其后代的臨界游泳速度(Ucrit)、尾波振幅和運(yùn)動(dòng)活動(dòng)的降低[44]。本研究未直接測(cè)試游泳指標(biāo)，而是觀察了幼魚(yú)在水中移動(dòng)和定位的能力。魚(yú)鰾完全或部分缺失可能是游泳活動(dòng)減少的主要原因。這些變化意味著青鳉幼魚(yú)必須不斷移動(dòng)以保持在水中的位置，從而增加其氧氣和能量消耗，導(dǎo)致青鳉魚(yú)幼魚(yú)的下沉和極度消瘦，甚至死亡[45]。

在魚(yú)類中，硒的毒性機(jī)制仍不清楚。氧化應(yīng)激是這2種機(jī)制假說(shuō)中研究最多的一種。在本實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)青鳉胚胎暴露于SeMet時(shí)，Nrf2和GPx4均增加。已知多種化學(xué)物質(zhì)和環(huán)境制劑可以通過(guò)Nrf2誘導(dǎo)抗氧化反應(yīng)元件(AREs)基因[46]。在斑馬魚(yú)胚胎中，SeMet暴露導(dǎo)致的畸形與超氧化物歧化酶(sod2)和谷氨酸半胱氨酸連接酶催化亞基(gclc)基因表達(dá)以及總谷胱甘肽(TGSH)、還原谷胱甘肽(RGSH)和TGSH/氧化谷胱甘肽(GSSG)比率有關(guān)[21]。Penglase等[44]報(bào)道稱，經(jīng)膳食暴露硒的親代斑馬魚(yú)所產(chǎn)子代(F1)增加了GPx蛋白(GPx1a、GPx1b、SEPP1a和SEPP1b)表達(dá)，可能是對(duì)硒產(chǎn)生的超氧陰離子的抗氧化反應(yīng)。GPx4是一種抗氧化酶，可以直接還原磷脂和膽固醇的氫過(guò)氧化物，將有毒的過(guò)氧化物修飾為無(wú)毒的羥基化合物，以保護(hù)膜的結(jié)構(gòu)和功能[47]。研究表明，氫過(guò)氧化物可觸發(fā)細(xì)胞凋亡，在細(xì)胞增殖和分化中發(fā)揮作用，并促進(jìn)紅細(xì)胞成熟，維護(hù)氧化還原的平衡[48]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示硒誘導(dǎo)Nrf2表達(dá)的增高，這種增高可能是由于斑馬魚(yú)胚胎對(duì)抗氧化應(yīng)激反應(yīng)的一種保護(hù)作用。未來(lái)的工作有必要檢測(cè)細(xì)胞凋亡和其他關(guān)聯(lián)GPx蛋白的表達(dá)。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)SeMet水溶液暴露會(huì)導(dǎo)致生命早期青鳉胚胎的發(fā)育毒性，并呈濃度依賴性。在10 μmol·L-1和100 μmol·L-1SeMet暴露組中，暴露導(dǎo)致存活率和孵化率下降，包括心包水腫、血液顏色和運(yùn)動(dòng)行為的改變。有趣的是，在眾多表型類別中，10 μmol·L-1暴露組造成的影響最大，這表明有機(jī)硒存在中劑量效應(yīng)。此外，有機(jī)硒造成氧化應(yīng)激關(guān)聯(lián)指標(biāo)的增加可能是造成青鳉胚胎毒性的作用機(jī)制。未來(lái)有必要與其他種類硒的暴露進(jìn)行比較，加強(qiáng)對(duì)硒所引起胚胎毒性的認(rèn)識(shí)。此外，延長(zhǎng)低濃度有機(jī)硒持續(xù)暴露時(shí)間，可進(jìn)一步了解早期暴露對(duì)青春期或者成年的影響。