阮港，許萍萍，殷旭旺，張春梅，宋高飛，米武娟，畢永紅,*

1. 大連海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，大連 116023 2. 中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所，淡水生態(tài)與生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430072

鎘是一種生物半衰期相對(duì)較長(zhǎng)的非必需重金屬元素，容易在生物體中積累并行使生理功能[1]，具有高致毒性[2]；如鎘與巰基緊密結(jié)合，是一種酶抑制劑[3]，破壞細(xì)胞內(nèi)部離子平衡并與蛋白質(zhì)中的金屬離子發(fā)生置換反應(yīng)導(dǎo)致其失去活性[4]；鎘激發(fā)細(xì)胞的氧化應(yīng)激造成脂質(zhì)過(guò)氧化、引起蛋白質(zhì)/DNA損傷[5]；鎘還可通過(guò)干擾DNA合成與修復(fù)，破壞細(xì)胞的增殖和分化、細(xì)胞周期進(jìn)程和細(xì)胞凋亡等[6]。即使在較低濃度下，鎘也能通過(guò)誘導(dǎo)氧化應(yīng)激和影響生長(zhǎng)、代謝、營(yíng)養(yǎng)吸收、光合作用和呼吸作用對(duì)光合生物產(chǎn)生毒害效應(yīng)[7-9]。鎘對(duì)藻類(lèi)的毒性試驗(yàn)表明，鎘脅迫能顯著抑制柵藻生長(zhǎng)并破壞細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)[2]；鎘對(duì)藻類(lèi)光合系統(tǒng)具有毒性效應(yīng)，破壞葉綠素合成[10-12]，競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合放氧復(fù)合體(OEC)上Ca2+位點(diǎn)和葉綠素a的Mg2+等[13]。長(zhǎng)期以來(lái)，鎘被認(rèn)為是沒(méi)有任何有益功能的有毒重金屬。但最近研究表明，植物需要微量Cd2+才能達(dá)到最佳生長(zhǎng)狀態(tài)[14]；在硅藻中，金屬鎘、鈷和鋅可以在功能上互相替換，以保持最佳的生長(zhǎng)速度[15]?？梢?jiàn)，鎘的確切生物效應(yīng)仍不甚明了，需要深入研究。

藍(lán)藻作為水生生態(tài)系統(tǒng)總初級(jí)生產(chǎn)力的重要貢獻(xiàn)者，是重金屬進(jìn)入食物鏈的主要途徑之一；暴露在環(huán)境中的藍(lán)藻細(xì)胞對(duì)重金屬脅迫敏感，集胞藻作為光合作用研究的模式生物，是研究水體重金屬潛在生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)的重要模型[16]。盡管Cd2+對(duì)藻細(xì)胞光合系統(tǒng)影響的研究已非常深入，但此前的研究主要集中在藻細(xì)胞對(duì)重金屬脅迫的生理響應(yīng)和生物吸附能力[17-21]，Cd2+的毒性機(jī)制仍不明確，且Cd2+的急性毒性脅迫影響光合系統(tǒng)中的位點(diǎn)存在一些相互矛盾的結(jié)果[10, 22]，例如，PSⅠ和PSⅡ?qū)︽k的敏感性存在爭(zhēng)議；Cd2+的脅迫位點(diǎn)位于電子傳遞鏈的確切部位存在分歧。本文選擇集胞藻PCC 6803為對(duì)象，探究不同濃度Cd2+對(duì)細(xì)胞抗氧化酶系統(tǒng)和光合活性的毒性效應(yīng)，以期尋找Cd2+作用于藍(lán)藻細(xì)胞的靶標(biāo)位點(diǎn)，進(jìn)一步認(rèn)識(shí)重金屬對(duì)淡水藍(lán)藻的毒性作用及其急性致毒機(jī)理、評(píng)估重金屬的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 材料和培養(yǎng)條件

集胞藻(Synechocystissp.)PCC 6803來(lái)自中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所淡水藻種庫(kù)(FACHB-collection)。以改良BG11培養(yǎng)基(不含EDTA)為培養(yǎng)液，在(30±1) ℃、30～40 μmol·m-2·s-1持續(xù)光照條件下，以130 r·min-1轉(zhuǎn)速進(jìn)行搖床培養(yǎng)，采用紫外分光光度計(jì)(UV1701，日本島津)測(cè)定培養(yǎng)物在730 nm的吸光值，通過(guò)A730 nm監(jiān)測(cè)其生長(zhǎng)。初始接種濃度A730 nm=0.1接入250 mL三角瓶，收集處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(A730 nm=0.8～1.0)的藻細(xì)胞用于本研究。

3 000 r·min-1轉(zhuǎn)速離心5 min收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的藻細(xì)胞，無(wú)菌水沖洗3次后，置于BG11培養(yǎng)基中，接種量少于培養(yǎng)基的1%，接入含有100 mL BG11的三角瓶。分析純的試劑CdCl2·2.5H2O購(gòu)于中國(guó)國(guó)藥有限公司。設(shè)置各處理組中Cd2+濃度分別為0.05、0.25、0.50和1.00 mg·L-1，以0 mg·L-1作為對(duì)照組。每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)重復(fù)，試驗(yàn)周期為24 h。

1.2 指標(biāo)測(cè)定

1.2.1 光合色素含量的測(cè)定

光合色素含量的測(cè)定如前人[23]描述，取5 mL培養(yǎng)物4 000 r·min-1離心10 min，棄去上清液，加入5 mL預(yù)冷的90%的甲醇，混勻后在4 ℃冰箱避光提取24 h，4 000 r·min-1離心10 min后，取上清液，采用紫外分光光度計(jì)測(cè)定665、652和470 nm波長(zhǎng)的吸光值，參照公式計(jì)算葉綠素a(Chla)和類(lèi)胡蘿卜素(Car)的含量：

Chla(mg·L-1)=16.82A665-9.28A652

Car (mg·L-1)=(1000A470-1.91Chla)/225

1.2.2 活性氧(ROS)含量測(cè)定

集胞藻細(xì)胞內(nèi)的ROS用二氯二氫熒光素雙醋酸鹽(DCFH-DA)檢測(cè)。DCFH-DA能進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，被酯酶分解為DCFH，DCFH與H2O2等小分子過(guò)氧化物結(jié)合而被氧化成具有熒光性的DCF。在24 h取樣，離心，重懸于100 mmol·L-1PBS (pH 7.2)緩沖液中，再使用PBS緩沖液洗滌細(xì)胞2次，200 mL培養(yǎng)物加入96孔板用酶標(biāo)儀(PerkinElmer VICTOR Nivo，美國(guó))檢測(cè)DCF熒光強(qiáng)度(激發(fā)波長(zhǎng)485 nm和發(fā)射波長(zhǎng)530 nm)和葉綠素?zé)晒?激發(fā)波長(zhǎng)485 nm和發(fā)射波長(zhǎng)670 nm)。使用葉綠素?zé)晒夥w一化單個(gè)細(xì)胞ROS含量，使用公式FDCF/FChl計(jì)算相對(duì)ROS豐度。

1.2.3 超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)活性測(cè)定

取適量藻液4 000 r·min-1離心10 min后，將藻泥懸浮于1 mL生理鹽水(0.9% NaCl)，加入適量鋯珠，4 ℃冷凍破碎，4 ℃、1 800 r·min-1離心10 min，取上清用于蛋白含量與酶活測(cè)定。SOD的測(cè)定使用試劑盒(南京建成)，蛋白質(zhì)測(cè)定使用微孔BCA蛋白試劑盒WST-1法(康為世紀(jì))，使用蛋白量歸一化SOD含量。

1.2.4 快速熒光誘導(dǎo)動(dòng)力學(xué)曲線(OJIP)和PSⅡ最大光化學(xué)效率(Fv/Fm)的檢測(cè)

OJIP曲線和Fv/Fm使用AquaPen-C AP-C 100熒光儀 (Photon Systems Instruments，Brno，捷克)測(cè)定，其中Fv=Fm-F0，F(xiàn)0和Fm分別是藻細(xì)胞在暗適應(yīng)狀態(tài)下的最小和最大熒光產(chǎn)量[24-25]。調(diào)節(jié)合適的細(xì)胞濃度，室溫暗適應(yīng)10 min，藍(lán)藻F0的測(cè)定使用弱藍(lán)色測(cè)量光(450 nm，<0.1 μmol·m-2·s-1)，該光強(qiáng)不足以引起光化學(xué)電子傳遞，F(xiàn)m采用飽和脈沖光(1 800 μmol·m-2s-1)照射800 ms測(cè)得。以照射時(shí)間為橫坐標(biāo)，熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)，對(duì)快速葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)動(dòng)力學(xué)曲線作圖，為了更好地觀察J點(diǎn)和I點(diǎn)，把橫坐標(biāo)改為對(duì)數(shù)坐標(biāo)，結(jié)果得到OJIP誘導(dǎo)曲線。

Ft=A1exp(-t/T1)+A2exp(-t/T2)+A3exp(-t/T3)+A0

式中：Ft代表可變熒光產(chǎn)量，A0～A3指幅度，T1～T3是時(shí)間常數(shù)，半衰期由時(shí)間常數(shù)T計(jì)算得來(lái)，公式t1/2=ln 2T。

1.2.6 S-state檢測(cè)

取3 mL待測(cè)樣品放入樣品室，打開(kāi)測(cè)量光測(cè)定F0，測(cè)量光照射時(shí)間是1 ms。隨后打開(kāi)光化光閃光照射樣品，光化光閃光次數(shù)為10次，每次閃光時(shí)間間隔為100 ms。以照射時(shí)間為橫坐標(biāo)，熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)作圖即為S-state曲線[29]。根據(jù)S-state曲線，無(wú)活性PSⅡ反應(yīng)中心(PSⅡX)比例可通過(guò)F0第4次光化光閃光后100 ms處熒光值的差值進(jìn)行估算，具體計(jì)算公式為：ΔF4=F400 ms/F0-1。由于本試驗(yàn)中相對(duì)可變熒光強(qiáng)度降低，使用修改后公式[30]來(lái)計(jì)算PSⅡX的比例：PSⅡx(%)=ΔF4×100(F300 ms/F0-1)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

本試驗(yàn)各組均設(shè)置3個(gè)平行。統(tǒng)計(jì)軟件使用SPSS25.0(IBM，USA)，處理組和對(duì)照組間采用單因素方差(One-way ANOVA)分析檢驗(yàn)，若差異顯著進(jìn)行最小顯著差異(LSD)多重比較檢驗(yàn)組間差異顯著性。繪圖和數(shù)據(jù)處理使用R語(yǔ)言中的tidyverse包。

2 結(jié)果(Results)

2.1 光合色素含量變化

不同濃度Cd2+對(duì)葉綠素a含量影響如圖1所示。0.05 mg·L-1濃度處理后，葉綠素a與對(duì)照組相比呈現(xiàn)上升趨勢(shì)；以0.25、0.50和1.00 mg·L-1處理集胞藻后，葉綠素a含量與對(duì)照組相比顯著下降(P<0.01)。

圖1 不同濃度鎘離子處理24 h對(duì)集胞藻光合色素含量的影響注：*表示與對(duì)照組相比存在顯著性差異。Fig. 1 Effect on the pigment content in Synechocystis sp. after exposure to different concentrations of cadmium for 24 hNote: *indicates significant difference compared with the control group.

2.2 ROS含量和SOD活性變化

如圖2所示，處理24 h后，Cd2+濃度0.05 mg·L-1處理組與對(duì)照組相比ROS含量顯著上升(P<0.01)，Cd2+濃度為0.25、0.50和1.00 mg·L-1的處理組ROS含量分別是對(duì)照組的1.47倍、2.58倍和2.69倍。

圖2 不同濃度鎘離子處理24 h集胞藻活性氧(ROS)含量和超氧化物歧化酶(SOD)活性的變化注：*表示與對(duì)照組相比存在顯著性差異。Fig. 2 Change of reactive oxygen species (ROS) content and superoxide dismutase (SOD) activity in Synechocystis sp. after exposure to different concentrations of cadmium for 24 hNote: *indicates significant difference compared with the control group.

與對(duì)照組相比，Cd2+濃度為0.05、0.25和0.50 mg·L-1的處理組藻細(xì)胞中SOD活性顯著上升(P<0.05)；Cd2+濃度為1.00 mg·L-1的處理組藻細(xì)胞中SOD活性與對(duì)照組差異不顯著(P>0.05)。

2.3 葉綠素?zé)晒饣钚缘淖兓?/h3>

集胞藻在不同Cd2+環(huán)境中，葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)曲線和PSⅡ最大光化學(xué)效率(Fv/Fm)如圖3和圖4所示。由圖3可知，Cd2+濃度為1.00 mg·L-1，P峰消失。歸一化的OJIP曲線可以更好比較各峰之間的變化；Cd2+濃度0.50 mg·L-1，J峰顯著上升(P<0.01)。由圖4可知，Cd2+濃度為0.50 mg·L-1和1.00 mg·L-1，處理組Fv/Fm相對(duì)于對(duì)照組顯著下降(P<0.01)。

圖3 不同濃度鎘離子處理24 h集胞藻的OJIP曲線注：相對(duì)可變熒光計(jì)算公式為Vt=(Ft-F0)/(Fm-F0)。Fig. 3 OJIP fluorescence transients of Synechocystis sp. after exposure to different concentrations of cadmium for 24 hNote: Relative variable fluorescence is calculated by Vt=(Ft-F0)/(Fm-F0).

圖4 不同濃度鎘離子處理24 h集胞藻的PSⅡ最大光化學(xué)效率(Fv/Fm)變化注：*表示與對(duì)照組相比存在顯著性差異。Fig. 4 Change of PSⅡ maximum photochemical efficiency (Fv/Fm) in Synechocystis sp. after exposure to different concentrations of cadmium for 24 hNote: *indicates significant difference compared with the control group.

2.4 Cd2+對(duì)再氧化的影響

圖5 不同濃度鎘離子處理24 h集胞藻再氧化曲線注：熒光強(qiáng)度計(jì)算公式為Ft-F0。Fig. reoxidation kinetic curves of Synechocystis sp. after exposure to different concentrations of cadmium for 24 hNote: Fluorescence intensity is calculated by Ft-F0.

表1 不同濃度鎘離子處理24 h集胞藻的再氧化曲線參數(shù)Table 1 Parameters of reoxidation kinetics in Synechocystis sp. after exposure to different concentrations of cadmium for 24 h

2.5 Cd2+對(duì)無(wú)活性PSⅡ反應(yīng)中心(PSⅡX)的影響

不同濃度Cd2+作用下連續(xù)單飽和反轉(zhuǎn)閃光激發(fā)后S-state曲線如圖6(a)所示。PS Ⅱ反應(yīng)中心的一部分不能將電子從初級(jí)受體QA傳遞給次級(jí)受體QB，成為PSⅡX。據(jù)此計(jì)算細(xì)胞內(nèi)的PSⅡX的比例的結(jié)果如圖6(b)所示，Cd2+濃度為0.50 mg·L-1和1.00 mg·L-1，集胞藻PSⅡX比例顯著上升。

圖6 不同濃度鎘離子處理24 h集胞藻熒光衰減曲線(a)和無(wú)活性PSⅡ反應(yīng)中心(PSⅡX)比例(b)的變化注：*表示與對(duì)照組相比存在顯著性差異，熒光強(qiáng)度計(jì)算公式為Ft/F0。Fig. 6 Fluorescence decay curves (a) and the proportion of inactive PSⅡ reaction center (PSⅡX) (b) of Synechocystis sp. after exposure to different concentrations of cadmium for 24 hNote: *indicates significant difference compared with the control group, and fluorescence intensity is calculated by Ft/F0.

3 討論(Discussion)

盡管地殼中鎘元素含量很低，但人類(lèi)通過(guò)采礦、有色金屬冶煉和肥料生產(chǎn)使其濃度在局部環(huán)境中增加到有毒水平，如化工園區(qū)或密集種植區(qū)土壤中的Cd2+濃度達(dá)到100 mg·kg-1以上。這些Cd2+最終匯集到江河湖海中，威脅水域生態(tài)系統(tǒng)的安全與健康。藍(lán)藻作為水域生態(tài)系統(tǒng)的重要成員，對(duì)鎘具有較強(qiáng)的吸附/吸收能力；研究表明藍(lán)藻細(xì)胞能在30 min吸附70%以上Cd2+，胞內(nèi)聚集的Cd2+抑制葉綠素合成并破壞類(lèi)囊體膜蛋白結(jié)構(gòu)，可直接或間接損傷電子傳遞系統(tǒng)、酶活和光合系統(tǒng)，進(jìn)而降低藍(lán)藻細(xì)胞的光合能力；可見(jiàn)，藍(lán)藻細(xì)胞對(duì)Cd2+的脅迫極為敏感[22]。不高于0.50 mg·L-1的低劑量鎘濃度能夠激發(fā)集胞藻細(xì)胞的氧化應(yīng)激和抗氧化酶系統(tǒng)，該結(jié)果與曲殼藻[31]暴露在鎘脅迫中的表現(xiàn)基本一致。本試驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，鎘脅迫對(duì)細(xì)胞光合系統(tǒng)造成損傷，破壞光合電子傳遞鏈導(dǎo)致電子外溢，胞內(nèi)的氧與外溢電子結(jié)合產(chǎn)生ROS[32]；鎘離子含量的增加會(huì)導(dǎo)致ROS的產(chǎn)生量持續(xù)增加，引起胞內(nèi)ROS聚集；過(guò)量的ROS導(dǎo)致亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的破壞，并使其他酶失活，破壞色素和光合系統(tǒng)，導(dǎo)致藻細(xì)胞光合作用和其他代謝過(guò)程發(fā)生紊亂[33-34]。為了應(yīng)對(duì)鎘脅迫產(chǎn)生的ROS氧化壓力，細(xì)胞合成SOD消除ROS的毒性效應(yīng)；這使得SOD酶活性應(yīng)激性增強(qiáng)。

Cd2+會(huì)直接影響藻細(xì)胞的色素成分和生長(zhǎng)增殖[7, 37-40]，本研究發(fā)現(xiàn)，0.25、0.50和1.00 mg·L-1Cd2+處理集胞藻時(shí)，其葉綠素含量受到顯著抑制。該結(jié)果與已有文獻(xiàn)的研究結(jié)果類(lèi)似[26, 41]。另一方面，本試驗(yàn)0.05 mg·L-1的Cd2+能促進(jìn)集胞藻葉綠素的合成。與之前的研究結(jié)果“低濃度Cd2+(0.1 mmol·L-1)能促進(jìn)集胞藻生長(zhǎng)和葉綠素合成”[38]，導(dǎo)致蛋白質(zhì)合成以及細(xì)胞中可溶性糖含量增多[23]等類(lèi)似；這些結(jié)果均表明集胞藻能夠耐受一定濃度的Cd2+。推測(cè)該現(xiàn)象為“毒性興奮效應(yīng)”，低毒性能激發(fā)藻細(xì)胞的代謝能力，促進(jìn)藻細(xì)胞大分子的合成。綜合以上分析，集胞藻能耐受不高于0.25 mg·L-1的Cd2+濃度脅迫，高濃度的Cd2+對(duì)集胞藻生長(zhǎng)具有顯著抑制作用。