熊曼瓊，覃淦，王梨竹，黃少康，李江紅，段辛樂(lè),*

1. 福建農(nóng)林大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院(蜂學(xué)學(xué)院)，福州 350002 2. 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部福建蜜蜂生物學(xué)科學(xué)觀測(cè)站，福州 350002

蜜蜂是自然界最重要的授粉昆蟲，全球80%的經(jīng)濟(jì)作物依賴蜜蜂授粉，其對(duì)促進(jìn)植物遺傳多樣性和維持生態(tài)平衡具有重要的作用[1]。在我國(guó)，每年有約500多萬(wàn)群流動(dòng)蜂群在生產(chǎn)蜂產(chǎn)品的同時(shí)可為大宗農(nóng)作物授粉[2]；據(jù)測(cè)算，蜜蜂授粉對(duì)我國(guó)36種主要作物的年均價(jià)值貢獻(xiàn)高達(dá)3 042.20億元，占我國(guó)農(nóng)業(yè)總產(chǎn)值的12.30%[3]。

隨著農(nóng)業(yè)集約化、規(guī)?；彤a(chǎn)業(yè)化的發(fā)展，生態(tài)環(huán)境受到破壞，生物多樣性下降，野生授粉昆蟲數(shù)量銳減，使得家養(yǎng)蜜蜂對(duì)生態(tài)環(huán)境的作用更加突出，其在生物多樣性和生態(tài)平衡等生態(tài)貢獻(xiàn)遠(yuǎn)大于其授粉所產(chǎn)生的經(jīng)濟(jì)價(jià)值[4-5]。如果授粉昆蟲持續(xù)減少，必定會(huì)引發(fā)農(nóng)作物授粉危機(jī)，進(jìn)而影響全球的作物產(chǎn)量及生態(tài)環(huán)境[6]，威脅糧食安全和生態(tài)安全。影響蜜蜂生存的因素有多種，如氣候變化、遺傳特性、農(nóng)藥使用、寄生蟲和病毒疾病暴發(fā)等[7]，其中農(nóng)藥中毒導(dǎo)致蜜蜂死亡、蜂群數(shù)量驟減的現(xiàn)象已成為全球普遍關(guān)注的環(huán)境污染與生物安全問(wèn)題[8-10]。

殺菌劑是作物病害防治的重要農(nóng)業(yè)物資，我國(guó)注冊(cè)登記可用于蜜粉源植物病害防治的殺菌劑有128種，多為唑類、無(wú)機(jī)類及金屬類、苯胺及酰胺類(表1)[10]。因蜜源植物病害防治的需要，生產(chǎn)上經(jīng)常會(huì)在其開花期進(jìn)行噴藥，蜜蜂在采集過(guò)程中可直接接觸到殺菌劑[11]；同時(shí)殺菌劑被植物吸收后會(huì)出現(xiàn)在花蜜、花粉和露水中，被蜜蜂采集后帶回蜂巢，導(dǎo)致蜂群內(nèi)蜂蜜、花粉和巢脾被污染，進(jìn)而影響其幼蟲和成蜂的生長(zhǎng)發(fā)育和生理狀態(tài)[12]。殺菌劑的作用機(jī)制主要是通過(guò)影響核酸和蛋白質(zhì)的合成、呼吸作用、信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞分裂和細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能，以達(dá)到抑菌或殺菌效果[13]；因此殺菌劑的田間推薦使用劑量不會(huì)導(dǎo)致蜜蜂急性死亡，但其田間殘留仍會(huì)對(duì)蜜蜂行為、生長(zhǎng)發(fā)育、繁殖、學(xué)習(xí)記憶和免疫產(chǎn)生影響[12-17]。

本文綜述了殺菌劑對(duì)蜜蜂生長(zhǎng)發(fā)育、生理和行為等健康方面影響的研究進(jìn)展，探究殺菌劑對(duì)蜜蜂的脅迫效應(yīng)，以期尋求減少或降低蜜蜂中毒的方法，更好地保護(hù)蜜蜂，使其更好地應(yīng)用于授粉生產(chǎn)實(shí)踐，也為進(jìn)一步協(xié)調(diào)蜜蜂授粉與綠色防控技術(shù)體系的應(yīng)用，為農(nóng)作物授粉安全和我國(guó)農(nóng)藥使用安全性評(píng)價(jià)提供理論指導(dǎo)。

1 殺菌劑對(duì)蜜蜂的毒性作用(Toxic effects of fungicides to bees)

目前，評(píng)價(jià)殺菌劑對(duì)蜜蜂的毒性主要是依據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評(píng)價(jià)試驗(yàn)準(zhǔn)則》第10部分，即“蜜蜂急性毒性試驗(yàn)[18]”。該標(biāo)準(zhǔn)提出通過(guò)測(cè)定藥劑的急性經(jīng)口毒性和急性接觸毒性，確定藥劑對(duì)蜜蜂的致死中劑量(LD50)，根據(jù)致死中劑量將農(nóng)藥對(duì)蜜蜂毒性劃分為4個(gè)等級(jí)：LD50>11.0 μg·蜂-1時(shí)，該殺菌劑對(duì)蜜蜂的毒性為低毒；2.0 μg·蜂-1

趙帥等[19]分析了59種殺菌劑對(duì)意大利蜜蜂(Apismellifera)的急性經(jīng)口毒性，發(fā)現(xiàn)51種殺菌劑對(duì)意大利蜜蜂的毒性均表現(xiàn)低毒，8種殺菌劑為中毒及中毒以上毒性。蒼濤等[20]研究發(fā)現(xiàn)，多菌靈、噻嗪酮、腐霉利、異菌脲和百菌清對(duì)意大利蜜蜂的急性經(jīng)口毒性屬于低毒，乙蒜素、咪鮮胺對(duì)意大利蜜蜂為中毒。賈變桃等[21]研究發(fā)現(xiàn)，丙森鋅、苯醚甲環(huán)唑、石硫合劑、甲基硫菌靈、烯酰嗎啉、氟菌唑和三環(huán)唑?qū)σ獯罄鄯涞募毙越?jīng)口和接觸毒性均為低毒；而氟硅唑?qū)σ獯罄鄯涞慕佑|毒性為高毒，丙環(huán)唑和咪鮮胺的接觸毒性為中毒，丙環(huán)唑和抑霉唑?qū)σ獯罄鄯涞慕?jīng)口毒性為中毒。王雅珺等[22]評(píng)估結(jié)果顯示，代森錳鋅、啶酰菌胺、腐霉利、烯酰嗎啉、氰霜唑、葉枯唑和春雷毒素等對(duì)中華蜜蜂(Apiscerana)的急性毒性均為低毒；腈菌唑和丙環(huán)唑?qū)ζ涞募毙越?jīng)口和急性接觸毒性均為中毒，咪鮮胺對(duì)中華蜜蜂的急性經(jīng)口毒性為高毒，急性接觸毒性為中毒。Simon-Delso等[23]發(fā)現(xiàn)，啶酰菌胺在24 h和48 h對(duì)意大利蜜蜂無(wú)明顯的急性毒性，但在10～17 d出現(xiàn)累積毒性。譚麗超等[24]測(cè)定發(fā)現(xiàn)，250 g·L-1嘧菌酯懸浮劑、50%醚菌酯可濕性粉劑、15%吡唑醚菌酯懸浮劑和22.5%啶氧菌酯懸浮劑對(duì)意大利蜜蜂的經(jīng)口毒性和接觸毒性均>100 μg (a.i.)·蜂-1，為低毒。因有效成分含量、助劑種類、劑型及加工工藝等的不同，導(dǎo)致相同有效成分的不同制劑對(duì)蜜蜂的毒性也各不相同[19,25]。趙帥等[19]測(cè)定發(fā)現(xiàn)，在6個(gè)不同的戊唑醇制劑中，25%戊唑醇乳油(emulsifiable concentrate, EC)和25%戊唑醇可濕性粉劑(wettable powder, WP)對(duì)意大利蜜蜂的毒性為劇毒，相同含量相同劑型的2個(gè)25%戊唑醇EC產(chǎn)品對(duì)意大利蜜蜂的毒性也存在差異。葉萱[25]發(fā)現(xiàn)助劑中的促滲透劑N-甲基-2-吡咯烷酮(N-methyl-2-pyrrolidone, NMP)對(duì)意大利蜜蜂成蜂為中毒，對(duì)幼蟲為高毒。

2 殺菌劑對(duì)蜜蜂的影響(Influence of fungicides to bees)

2.1 殺菌劑對(duì)蜜蜂的生長(zhǎng)發(fā)育的影響

作為典型的社會(huì)性昆蟲，蜜蜂個(gè)體的生長(zhǎng)發(fā)育與蜂群的群勢(shì)相互影響。蜜蜂個(gè)體的生長(zhǎng)發(fā)育決定了蜂群群勢(shì)的強(qiáng)弱；蜂群群勢(shì)越強(qiáng)，越有利于個(gè)體的生長(zhǎng)發(fā)育[26]。蜜蜂可通過(guò)多種途徑直接或間接地接觸到殺菌劑，并將含有殺菌劑殘留的花粉和花蜜帶入蜂群中，進(jìn)而對(duì)幼蟲和成蜂的壽命、發(fā)育歷期、化蛹率和羽化率等產(chǎn)生負(fù)面影響[16-17,27-29]。與對(duì)照相比，Eduardo da Costa Domingues等[30]發(fā)現(xiàn)吡唑醚菌酯高濃度處理(25 mg·L-1和125 mg·L-1)可導(dǎo)致意大利蜜蜂成蜂壽命顯著縮短；而低濃度處理5 mg·L-1對(duì)其幼蟲和蛹存活率、化蛹率和羽化率均無(wú)顯著影響[31]。丙環(huán)唑?qū)σ獯罄鄯溆紫x的羽化率無(wú)顯著影響，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，各處理組花粉消耗量顯著下降，蜂王的產(chǎn)卵量下降；且隨著處理濃度的升高，蜂子的存活率和壽命顯著下降[32-33]。Dai等[34]研究發(fā)現(xiàn)百菌清處理(30 mg·L-1和100 mg·L-1)對(duì)意大利蜜蜂幼蟲具有慢性毒性和累積效應(yīng)，導(dǎo)致幼蟲和蛹死亡率增加，幼蟲發(fā)育速率減緩，其中對(duì)6日齡幼蟲影響最大，死亡率高于50%[35]；同時(shí)處理組采集蜂的數(shù)量顯著增多，且內(nèi)勤蜂與采集蜂體質(zhì)量、頭寬和翅膀長(zhǎng)度均顯著低于對(duì)照[36]。Tomé等[37]發(fā)現(xiàn)，蜂蠟和花粉中的殘留的百菌清能顯著降低意大利蜜蜂工蜂的存活率，發(fā)育歷期延長(zhǎng)，體質(zhì)量下降，同時(shí)還可導(dǎo)致蜂王的產(chǎn)卵量下降[38]。王康等[15]的研究表明，亞致死劑量的多菌靈脅迫對(duì)意大利蜜蜂的蛹質(zhì)量、化蛹率和羽化率無(wú)顯著影響，但可導(dǎo)致幼蟲的保幼激素滴度上升，蛻皮激素滴度顯著下降，進(jìn)而影響幼蟲生長(zhǎng)發(fā)育，造成幼蟲化蛹的發(fā)育遲緩。多菌靈(5 mg·mL-1和10 mg·mL-1)可增加蜜蜂對(duì)糖水的攝入量，減少花粉的消耗，顯著降低意大利蜜蜂的存活率[39]。

殺菌劑的復(fù)配劑或混合使用對(duì)蜜蜂的影響更為嚴(yán)重。Fisher等[29]研究發(fā)現(xiàn)，Pristine?(吡唑醚菌酯與啶酰菌胺的復(fù)配劑)可引起意大利蜜蜂蛋白質(zhì)缺乏，營(yíng)養(yǎng)不良，導(dǎo)致蜂群中工蜂壽命縮短，工蜂數(shù)量下降15%，影響蜂群越冬[40]。Johnson和Percel[41]研究認(rèn)為，Pristine?對(duì)意大利蜜蜂蜂王的存活率和生長(zhǎng)發(fā)育無(wú)顯著影響，但其可以降低蜂王體內(nèi)的營(yíng)養(yǎng)水平和免疫力，導(dǎo)致病毒滴度增加[42]。Milone等[43]通過(guò)室內(nèi)測(cè)定發(fā)現(xiàn)，嘧菌酯對(duì)意大利蜜蜂蜂王幼蟲的存活率和體質(zhì)量無(wú)顯著影響，其與腈苯唑、丙硫菌唑的混合處理可導(dǎo)致工蜂采集能力顯著下降43%。Tamburini等[44]通過(guò)田間實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，按照使用說(shuō)明中的使用濃度和方法，嘧菌酯不會(huì)對(duì)意大利蜜蜂個(gè)體和蜂群的發(fā)展(成蜂數(shù)、蜂子數(shù)和蜂群質(zhì)量等)及采集蜂的數(shù)量、采集飛行次數(shù)等行為無(wú)影響，結(jié)果表明安全濃度范圍內(nèi)的殺菌劑對(duì)意大利蜜蜂短期發(fā)育影響不大，但長(zhǎng)期接觸該藥后導(dǎo)致的累積效應(yīng)以及不同農(nóng)藥間是否對(duì)意大利蜜蜂個(gè)體和群體的存在協(xié)同或拮抗作用還需要進(jìn)一步研究。

2.2 殺菌劑對(duì)蜜蜂生理的影響

2.2.1 殺菌劑對(duì)蜜蜂解毒酶和保護(hù)酶活性的影響

作為外源有毒物質(zhì)，殺菌劑進(jìn)入蜜蜂體內(nèi)后必定會(huì)引起其保護(hù)酶和解毒酶的應(yīng)激反應(yīng)[16]。菌核凈、咪鮮胺和異菌脲可誘導(dǎo)意大利蜜蜂保護(hù)酶超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)和過(guò)氧化物酶(peroxidase, POD)活性，而對(duì)保護(hù)酶過(guò)氧化氫酶(catalase, CAT)和解毒酶羧酸酯酶(carboxylesterases, CarE)、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(glutathione S-transferase, GST)活性表現(xiàn)為低濃度誘導(dǎo)，高濃度抑制；而咪鮮胺對(duì)意大利蜜蜂細(xì)胞色素P450(cytochromeP450, CYP450)表現(xiàn)出顯著的抑制作用。在不同處理時(shí)間段內(nèi)，意大利蜜蜂保護(hù)酶和解毒酶處于協(xié)調(diào)變化狀態(tài)，從而降低菌劑對(duì)蜜蜂生理的負(fù)面影響[16]。多菌靈低濃度處理可激活意大利蜜蜂體內(nèi)CYP450和CarE酶的活性，但隨著處理濃度增加，多菌靈處理組中的激活效應(yīng)消失。亞致死劑量的腈菌唑、丙環(huán)唑和咪鮮胺處理中華蜜蜂內(nèi)勤蜂48 h后，其GST活性顯著提高，而CYP450活性顯著降低[22]。不同濃度百菌清處理中意大利蜜蜂6日齡幼蟲后，其體內(nèi)CYP9Q1、CYP9Q2和GSTD1的基因表達(dá)量均顯著下調(diào)，但可誘導(dǎo)新出房成蜂CYP9Q2、CYP9Q3、CYP9S1、GSTD1和PKAC1的基因表達(dá)量，這表明意大利蜜蜂的幼蟲和成蜂抵御外界殺菌劑脅迫的方式存在一定的差異[37]。

2.2.2 殺菌劑對(duì)蜜蜂消化與循環(huán)系統(tǒng)的影響

殺菌劑進(jìn)入蜜蜂的消化道和血淋巴后，影響中腸細(xì)胞和血淋巴中的血細(xì)胞及其細(xì)胞器的正常結(jié)構(gòu)和生理功能，導(dǎo)致蜜蜂對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收和代謝能力下降[13]。嘧菌酯處理(100 g·L-1和200 g·L-1)可抑制意大利蜜蜂堿性磷酸酶和溶菌酶活性，引起血淋巴中漿血細(xì)胞數(shù)量下降及細(xì)胞核核異型比例增加[45]。Tadei等[46]發(fā)現(xiàn)，吡菌酯可導(dǎo)致意大利蜜蜂成蜂中腸細(xì)胞DNA片段化和Hsp70表達(dá)量增加；而吡唑醚菌酯和啶氧菌酯均可導(dǎo)致其中腸消化細(xì)胞和再生細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)空泡化、分泌量增加和形態(tài)異常的現(xiàn)象，高濃度吡唑醚菌酯處理導(dǎo)致意大利蜜蜂腸道總蛋白含量下降[30]；啶氧菌酯對(duì)意大利蜜蜂馬氏管及其細(xì)胞的結(jié)構(gòu)無(wú)明顯的影響，但導(dǎo)致細(xì)胞凋亡信號(hào)增加[47]。異菌脲處理意大利蜜蜂24 h和48 h后，其中腸消化細(xì)胞的atg1基因表達(dá)量增加，且有較多的溶酶體；同時(shí)消化細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)退化、空泡化增加、頂端細(xì)胞異常突起、細(xì)胞核碎裂和染色質(zhì)凝聚，Carneiro等[48]通過(guò)分析認(rèn)為，異菌脲可抑制意大利蜜蜂谷胱甘肽的合成，導(dǎo)致活性氧的產(chǎn)生，進(jìn)而誘導(dǎo)不同類型的細(xì)胞死亡。除中腸柱狀細(xì)胞外，腈菌唑和百菌清還可引起意大利蜜蜂唾液腺和卵巢細(xì)胞的凋亡，其中對(duì)柱狀細(xì)胞的影響最大，2種殺菌劑處理的平均細(xì)胞凋亡率分別為69%和55%[49]。

2.2.3 殺菌劑對(duì)蜜蜂線粒體與呼吸代謝的影響

殺菌劑影響蜜蜂細(xì)胞內(nèi)的線粒體的功能，導(dǎo)致其體內(nèi)三磷酸腺苷(adenosine triphosphate, ATP)含量降低及運(yùn)動(dòng)和飛行能力下降，影響采集效率。吡唑醚菌酯處理意大利蜜蜂后，會(huì)導(dǎo)致其體內(nèi)參與碳水化合物和能量代謝酶基因表達(dá)量降低，如果糖-二磷酸醛縮酶、磷酸丙糖異構(gòu)酶、蘋果酸酶、6-磷酸葡萄糖異構(gòu)酶、精氨酸激酶和無(wú)機(jī)焦磷酸酶等[50]，同時(shí)吡唑醚菌酯可影響線粒體呼吸過(guò)程中的膜電位(在5 μmol·L-1及以上劑量)、琥珀磷酸化(10 μmol·L-1及以上的劑量)以及ATP的合成(15 μmol·L-1及以上劑量)，且隨著處理濃度的增加抑制效果越顯著，意大利蜜蜂線粒體的功能受到擾亂，ATP合成速率降低，內(nèi)勤蜂蛋白合成能力下降，采集蜂飛行活動(dòng)受到影響[51]。Prado等[52]發(fā)現(xiàn)6種常用殺菌劑的混合物可使意大利蜜蜂腹部線粒體的核基因(mrpl-15、mrpl-49、ndufb7、tim8和tim9)表達(dá)量及采集效率顯著下降。Mao等[53]發(fā)現(xiàn)腈菌唑可損害意大利蜜蜂細(xì)胞內(nèi)線粒體的功能，降低其體內(nèi)ATP的產(chǎn)生，導(dǎo)致其飛行能力下降，同時(shí)腈菌唑也可使中華蜜蜂的呼吸速率顯著下降，且呼吸速率下降程度與處理時(shí)間成正相關(guān)[54]。百菌清可影響意大利蜜蜂呼吸代謝中的氧化磷酸化，新陳代謝以及內(nèi)分泌相關(guān)基因的表達(dá)量和轉(zhuǎn)錄本發(fā)生變化，如CYP9q1、CYP9q2、CYP9q3、hbg-3和ilp-1等，導(dǎo)致越冬蜂大量死亡[55]。

2.2.4 殺菌劑對(duì)蜜蜂免疫系統(tǒng)的影響

蜜蜂自身的免疫能力決定了其應(yīng)對(duì)外界病原物等不良的影響的能力，而殺菌劑可引起蜜蜂免疫能力下降，與病原物協(xié)同影響蜜蜂健康。Degrandi-Hoffman等[56]分別用啶酰菌胺和吡唑醚菌酯處理3日齡和7日齡的意大利蜜蜂工蜂后，發(fā)現(xiàn)其對(duì)殘翅病毒(deformed wing virus, DWV)和黑蜂王臺(tái)病毒(black queen cell virus, BQCV)免疫力下降，2種病毒的滴度增加。作為蜜蜂體液免疫的重要組成部分，溶菌酶、凝集素和酚氧化酶(phenoloxidase, PO)系統(tǒng)和抗菌肽等免疫因子可幫助蜜蜂應(yīng)對(duì)外界不良因素的影響。苯菌靈處理意大利蜜蜂后，共有5 759個(gè)差異表達(dá)基因(differentially expressed genes, DEGs)表達(dá)上調(diào)，其中77個(gè)極其顯著的DEGs主要與免疫、解毒、生物代謝和調(diào)控功能相關(guān)，如免疫基因abaecin、Def1和SP2等均顯著上調(diào)；免疫信號(hào)Toll的Toll-1、Toll-6、Toll-8、Toll-10和信號(hào)傳導(dǎo)蛋白MyD88均表達(dá)上調(diào)被激活[57]。陳恒[39]發(fā)現(xiàn)多菌靈和微孢子蟲(Nosemaceranae)對(duì)意大利蜜蜂存活率無(wú)協(xié)同作用，但二者共同脅迫可影響其免疫應(yīng)答，使抗菌肽基因abaecin和degensing-1表達(dá)量下調(diào)，而AmEaster和hymen表達(dá)量則顯著上調(diào)。咪鮮胺可激活意大利蜜蜂剛出房成蜂的Toll、JAK/STAT和JNK等免疫通路基因，使其體內(nèi)抗菌肽基因(defensing-1和defensin-2)和解毒基因PKA-1的表達(dá)量增加[58]。百菌清可降低意大利蜜蜂體內(nèi)氧化酶活性，導(dǎo)致意大利蜜蜂對(duì)獸棚病毒(flock house virus, FHV)抵抗力下降[36]。通過(guò)田間實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，田間殘留的多菌靈能顯著降低意大利蜜蜂采集蜂的免疫基因(hymenoptaecin和apidaecin)的表達(dá)量，并導(dǎo)致其P450酶活性顯著下降[59]；通過(guò)室內(nèi)測(cè)定分析發(fā)現(xiàn)，多菌靈可引起意大利蜜蜂幼蟲和成蜂體內(nèi)多個(gè)DEGs表達(dá)量發(fā)生變化，其中免疫基因abaecin、defensin-1、Hymenoptaecin，酚氧化酶A3亞基(phenoloxidase subunit A3)和溶菌酶(lysozyme)的表達(dá)量均顯著上調(diào)[60-61]。這些研究結(jié)果表明殺菌劑可以直接對(duì)意大利蜜蜂的免疫基因產(chǎn)生影響，同時(shí)蜜蜂可協(xié)調(diào)體內(nèi)其他免疫途徑來(lái)減輕殺菌劑對(duì)其免疫能力帶來(lái)壓力。

2.3 殺菌劑對(duì)蜜蜂的腸道微生物的影響

蜜蜂的腸道微生物具有構(gòu)成簡(jiǎn)單、組成穩(wěn)定等特點(diǎn)，其對(duì)寄主的生長(zhǎng)發(fā)育、營(yíng)養(yǎng)代謝、提高免疫力和降解有毒物質(zhì)等方面至關(guān)重要[62]。蜜蜂在取食含有殺菌劑的食物后，其體內(nèi)穩(wěn)定的腸道微生物多樣性、豐度和組成均能產(chǎn)生不同程度變化等失調(diào)現(xiàn)象，進(jìn)而影響蜜蜂對(duì)食物營(yíng)養(yǎng)的攝入以及免疫系統(tǒng)的破壞，導(dǎo)致蜜蜂個(gè)體死亡和蜂群崩潰[27]。代君君等[17]利用PCR-DGGE分析方法研究發(fā)現(xiàn)，5 mg·mL-1苯菌靈可導(dǎo)致意大利蜜蜂腸道真菌的種類和數(shù)量均顯著下降，造成其腸道微生態(tài)平衡失調(diào)，破壞了蜜蜂機(jī)體正常的生理功能，嚴(yán)重影響蜜蜂的健康。范榮莉[27]研究發(fā)現(xiàn)，不同濃度多菌靈處理(5、50、500和5 000 mg·kg-1)可擾亂意大利蜜蜂腸道微生物結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，如厚壁菌門(Firmicutes)的Frischella屬和變形菌門(Proteobacteria)的Gilliamella屬的多樣性與豐富度均有不同程度的改變；與對(duì)照相比，多菌靈500 mg kg-1處理組的乳桿菌屬(Lactobacillus)豐度顯著降低，而變形菌門豐度增加。復(fù)配劑Pristine?的低濃度處理(1.99 mg·L-1)可導(dǎo)致意大利蜜蜂腸道內(nèi)γ-變形菌綱Gilliamellasp.相對(duì)豐度降低，且細(xì)菌種類數(shù)量下降；而高濃度處理(11.41 mg·L-1)可致乳桿菌屬類群(Lactobacillussp.)、Firm-4和Firm-5的豐度增加[40]。百菌清可引起意大利蜜蜂腸道細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生變化，如乳桿菌科(Lactobacillaceae)的相對(duì)豐度下降，而腸桿菌科(Enterobacteriaceae)和柄桿菌科(Caulobacteraceae)相對(duì)豐度提高，這導(dǎo)致處理組意大利蜜蜂的糖代謝過(guò)程中的氧化磷酸化增強(qiáng)，但腸道中肽酶的氧化磷酸化下降，進(jìn)而影響蜜蜂對(duì)蛋白質(zhì)的消化吸收，導(dǎo)致其營(yíng)養(yǎng)不良[63]。

此外，殺菌劑和蜜蜂的病原物對(duì)其腸道微生物具有協(xié)同作用，啶酰菌胺可導(dǎo)致感染東方蜜蜂微孢子蟲(Nosemaceranae)意大利蜜蜂的死亡率增加，Paris等[64]研究發(fā)現(xiàn)啶酰菌胺田間施用濃度與微孢子蟲協(xié)同作用可改變意大利蜜蜂體內(nèi)腸道微生物的多樣性，導(dǎo)致α-變形菌(Alphaproteobacteria)豐度降低，變形菌(Gammaproteobacteria)豐度增加，進(jìn)而引起蜜蜂腸道菌群的紊亂。通過(guò)在意大利蜜蜂飼料中添加乳酸片球菌(Pediococcusacidilacticii)降低微孢子蟲和啶酰菌胺對(duì)其發(fā)育(卵黃原蛋白)、免疫(絲氨酸蛋白酶-40、防御素)和解毒(谷胱甘肽過(guò)氧化物酶-2、過(guò)氧化氫酶)等基因的負(fù)面影響[65]。

2.4 殺菌劑對(duì)蜜蜂行為的影響

為應(yīng)對(duì)復(fù)雜的外界環(huán)境，蜜蜂形成了完善的勞動(dòng)分工體系和多樣的行為表現(xiàn)，如訪花、采集、舞蹈、防御、衛(wèi)生、學(xué)習(xí)和記憶等，這些行為對(duì)蜜蜂個(gè)體和群體的發(fā)展至關(guān)重要[66]。復(fù)配劑Pristine?可促進(jìn)蜂群中的負(fù)責(zé)照顧蜂王和幼蟲的內(nèi)勤蜂提早轉(zhuǎn)換為采集蜂，使其行為發(fā)生根本性的改變[29]。Liao等[32]研究發(fā)現(xiàn)，啶酰菌胺可使意大利蜜蜂振翅時(shí)間延長(zhǎng)、振動(dòng)次數(shù)減少，影響其飛行和采集能力下降，而吡唑醚菌酯可抑制3～4日齡成蜂體內(nèi)ATP的合成，導(dǎo)致其活動(dòng)能力(運(yùn)動(dòng)距離和速率)顯著下降[31]。丙環(huán)唑可使意大利蜜蜂過(guò)度興奮和腹部彎曲等異常行為，但隨著處理時(shí)間延長(zhǎng)，癥狀逐漸消失[67]，而王銅和福美雙能提高意大利蜜蜂采集活動(dòng)的積極性和對(duì)外的攻擊性[68]。

花蜜和花粉中殘留的殺菌劑可影響蜜蜂視覺、嗅覺、味覺和定位等能力，導(dǎo)致其行為的精確度和準(zhǔn)確度出現(xiàn)偏差，這些行為尤其是學(xué)習(xí)記憶能力決定了蜜蜂的采集效率，一旦受到不良影響可導(dǎo)致蜂群中食物缺乏[69-72]。DesJardins等[69]利用不同濃度的Pristine?處理意大利蜜蜂后發(fā)現(xiàn)，處理組意大利蜜蜂對(duì)蔗糖的反應(yīng)與對(duì)照組無(wú)差異；但處理組(23 mg·L-1和230 mg·L-1)的學(xué)習(xí)效果顯著下降，僅有80%個(gè)體能進(jìn)行聯(lián)想學(xué)習(xí)，且處理組意大利蜜蜂對(duì)氣味的反應(yīng)頻率也顯著低于對(duì)照。咪鮮胺不同濃度處理組(35.7、75和150 mg·L-1)意大利蜜蜂對(duì)糖水反應(yīng)的靈敏度與對(duì)照組無(wú)差異，但處理組意大利蜜蜂的學(xué)習(xí)記憶能力下降[70]。部分殺菌劑還可以通過(guò)影響蜜蜂的正常生理狀態(tài)進(jìn)而使其行為出現(xiàn)異常，殺菌劑Pristine?(230 mg·L-1)長(zhǎng)期處理才能對(duì)其聯(lián)想學(xué)習(xí)行為有顯著影響，同時(shí)亦可導(dǎo)致意大利蜜蜂飛行能力及代謝率顯著下降，降低采集蜂的授粉效率和效果[71]。蜂蠟中的百菌清殘留可使意大利蜜蜂蜂王下顎腺分泌的信息素下降，導(dǎo)致其對(duì)蜂群中工蜂的吸引力和蜂群控制力下降[38]。除室內(nèi)試驗(yàn)外，大量的田間試驗(yàn)也證實(shí)了殺菌劑對(duì)蜜蜂行為具有負(fù)面影響，Tschoeke等[72]發(fā)現(xiàn)，隨著甲基硫菌靈和百菌清使用次數(shù)的增加，意大利蜜蜂訪花頻率也會(huì)隨之下降；而嘧菌酯、腈苯唑和丙硫菌唑也對(duì)蜜蜂的有不同程度驅(qū)避作用。與對(duì)照相比，殺菌劑混合使用導(dǎo)致采粉蜂的數(shù)量下降43%[73]。商品藥劑Horizon(有效成分為戊唑醇)不同濃度處理(250、125和62.5 g·L-1)對(duì)意大利蜜蜂具有一定的驅(qū)避作用，驅(qū)避率均高于90%[74]。

3 殺菌劑與其他農(nóng)藥對(duì)蜜蜂的聯(lián)合毒性效應(yīng)(Combined toxic effects of fungicides with other pesticides to bees)

大多數(shù)殺菌劑單獨(dú)使用對(duì)蜜蜂低毒或無(wú)毒，但殺菌劑可以通過(guò)影響蜜蜂解毒酶活性，能量代謝等正常的生理代謝，提高農(nóng)藥對(duì)蜜蜂毒性，其中殺菌劑對(duì)殺蟲劑的增效作用的研究較多，二者聯(lián)合暴露后會(huì)提高殺蟲劑的毒性，導(dǎo)致蜜蜂死亡率增加。氟醚唑可使聯(lián)苯菊酯、l-氯氟氰菊酯、β-氯氟氰菊酯、z-氯氟氰菊酯、氯氰菊酯、γ-氯氰菊酯、氯菊酯和氰戊菊酯等8種菊酯類殺蟲劑對(duì)意大利蜜蜂急性毒性提高1.61倍～5.45倍[61]。丙環(huán)唑可提高氯蟲苯甲酰胺、除蟲脲和甲氧蟲酰肼對(duì)意大利蜜蜂的毒性，還可導(dǎo)致蜂蛹羽化率顯著下降[75-76]。甲基硫菌靈、百菌清及二者混合物可使吡蟲啉對(duì)意大利蜜蜂急性毒性提高了23.9倍、126倍和1 589.8倍[77]。咪鮮胺可提高氟胺氰菊酯(1 980倍)、蠅毒磷(70.9倍)和唑螨酯(26.6倍)對(duì)意大利蜜蜂的毒性[78]。殺菌劑和其他農(nóng)藥的混合物也會(huì)對(duì)蜜蜂個(gè)體和蜂群產(chǎn)生累積和聯(lián)合作用，嚴(yán)重威脅蜜蜂個(gè)體和群體的健康。苯醚甲環(huán)唑與吡蟲啉、草甘膦的混合物可導(dǎo)致越冬意大利蜜蜂食物消耗量增加，但蜂群存活率卻顯著下降[79]。Han等[80]研究發(fā)現(xiàn)丙環(huán)唑可提高啶蟲脒對(duì)中華蜜蜂的毒性，還可使剛出房中華蜜蜂和采集蜂的體質(zhì)量顯著下降、P450和GST酶活改變，二者對(duì)中華蜜蜂成蜂具有顯著的協(xié)同增效作用。多菌靈與噻蟲嗪混合處理可導(dǎo)致意大利蜜蜂的嗅覺能力下降，不能區(qū)分花香，對(duì)蜜粉源植物定位時(shí)間有所延長(zhǎng)，導(dǎo)致采集蜂工作效率下降[81]。Zhu等[82]研究發(fā)現(xiàn)四氟醚唑和吡蟲啉混合處理意大利蜜蜂，處理組成蜂CarE、GST、乙酰膽堿酯酶(acetylcholinesterase, AChE)和酚氧化酶(PO)的活性增強(qiáng)。與單獨(dú)唑菌胺酯處理相比，唑菌胺酯與氟蟲腈的混合物連續(xù)處理意大利蜜蜂內(nèi)勤蜂6 d，可導(dǎo)致其上顎腺分泌細(xì)胞體積和咽下腺腺泡數(shù)量下降，進(jìn)而影響蜂王漿的分泌量[83]。Domingues等[84]通過(guò)對(duì)血淋巴內(nèi)的血細(xì)胞檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，啶氧菌酯與噻蟲嗪混合處理可使意大利蜜蜂成蜂絳色細(xì)胞的形狀和大小及心包細(xì)胞活動(dòng)出現(xiàn)異常，影響意大利蜜蜂的正常營(yíng)養(yǎng)吸收，且處理組血淋巴中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量下降，成蜂壽命縮短、死亡率增加。咪鮮胺和蠅毒磷混合處理可顯著降低意大利蜜蜂的預(yù)蛹的體內(nèi)病原識(shí)別蛋白(PGRP-SC、PGRPSC 4300和PGRPLC 710)和免疫基因(defensing-1和abaecin)的表達(dá)量，而白眼蛹的JNK(basket)、Toll(cactus和toll)和AMP(abaecin、defensin-1和defensin-2)等相關(guān)免疫基因的表達(dá)量增加[85]。

4 總結(jié)與展望(Summary and prospect)

據(jù)國(guó)際殺菌劑抗藥性行動(dòng)委員會(huì)(Fungicide Resistance Action Committee, FRAC)報(bào)道，殺菌劑的作用機(jī)理涉及到病原菌生理、生化及相關(guān)代謝各方面，如：物質(zhì)(核酸、氨基酸、蛋白質(zhì)、脂類和甾醇等)合成、呼吸作用、酶的活性、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和物質(zhì)運(yùn)輸?shù)?；這些作用靶點(diǎn)亦普遍存在各類生物體內(nèi)(表1)[13]。對(duì)于非靶標(biāo)生物蜜蜂而言，殺菌劑施用后會(huì)直接或間接進(jìn)入其體內(nèi)，在解毒保護(hù)機(jī)制(解毒酶和保護(hù)酶)的作用下被降解并排除體外，所以大多數(shù)的殺菌劑對(duì)蜜蜂的急性經(jīng)口毒性均為低毒[19]，如甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑。該類殺菌劑作用機(jī)理是影響病原菌線粒體復(fù)合物Ⅲ輔酶Q的氧化位點(diǎn)(Qo)結(jié)合，阻斷細(xì)胞色素b和c1間的電子傳遞，從而干擾細(xì)胞正常的ATP的合成[86]；但意大利蜜蜂長(zhǎng)期接觸后會(huì)影響其線粒體呼吸過(guò)程中的膜電位、琥珀磷酸化及ATP的合成，導(dǎo)致蜜蜂的活動(dòng)能力下降，且隨著處理濃度的增加抑制效果越顯著[31,51]；同時(shí)還會(huì)導(dǎo)致工蜂腸道總蛋白含量下降，中腸消化細(xì)胞和再生細(xì)胞形態(tài)異常，細(xì)胞質(zhì)空泡化增加的現(xiàn)象。此外，該類殺菌劑對(duì)非靶標(biāo)水生生物斑馬魚具有較高的毒性，導(dǎo)致其畸形率增加并影響能量合成、氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡及內(nèi)分泌干擾相關(guān)基因的表達(dá)[86-87]。因此長(zhǎng)期在低濃度殺菌劑暴露亦會(huì)對(duì)非靶標(biāo)生物產(chǎn)生慢性毒性，對(duì)其生長(zhǎng)發(fā)育、生理和行為等方面產(chǎn)生毒性效應(yīng)[86]。在生產(chǎn)實(shí)踐中，應(yīng)加強(qiáng)對(duì)殺菌劑施用的監(jiān)管，并通過(guò)限制其施用劑量、施用范圍等措施以降低其對(duì)非靶標(biāo)生物和環(huán)境的影響。

目前，多數(shù)研究均基于殺菌劑對(duì)蜜蜂的致死中濃度(median lethal concentration, LC50)或致死中劑量(median lethal dose, LD50)，評(píng)估其對(duì)蜜蜂的毒性，并測(cè)定此殺菌劑濃度或者劑量對(duì)蜜蜂存活率、食物消耗、飛行、定向歸巢、學(xué)習(xí)記憶、繁殖、生理功能、與病原互作等諸多方面有影響。在實(shí)際生產(chǎn)中，殺菌劑的田間施用濃度或者劑量遠(yuǎn)低于其對(duì)蜜蜂的致死中濃度(LC50)或致死中劑量(LD50)，蜜蜂接觸殺菌劑后對(duì)其存活率無(wú)顯著影響，但亞致死劑量或濃度的殺菌劑對(duì)蜜蜂等傳粉昆蟲的生長(zhǎng)發(fā)育、生理和行為等方面仍具有潛在的威脅，這方面研究應(yīng)是今后蜜蜂毒理學(xué)研究的重點(diǎn)之一。為更精確地評(píng)估殺菌劑對(duì)蜜蜂的影響，應(yīng)當(dāng)在室內(nèi)測(cè)定殺菌劑對(duì)蜜蜂急性毒性(經(jīng)口和接觸)的基礎(chǔ)上，注重半田間或田間實(shí)驗(yàn)以及幼蟲飼喂試驗(yàn)，通過(guò)初級(jí)評(píng)估(風(fēng)險(xiǎn)商值，RQ)和高級(jí)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估進(jìn)行殺菌劑特征描述，以確保殺菌劑使用不會(huì)對(duì)蜜蜂個(gè)體和種群造成長(zhǎng)期的不良影響[88]。此外，在殺菌劑對(duì)蜜蜂影響研究中的研究對(duì)象多為意大利蜜蜂，而中華蜜蜂、熊蜂(Bombusterrestris、B.impatiens)、壁蜂(Osmiacornifrons、O.bicornis、O.lignaria)、切葉蜂(Megachilerotundata)以及其

表1 我國(guó)蜜粉源植物上登記使用的殺菌劑的種類、通用名及作用機(jī)理Table 1 Classification, common name and action mechanism of registered fungicides on nectar and pollen plants in China

他野生傳粉蜂的研究相對(duì)較少。未來(lái)應(yīng)該注重開展常用殺菌劑對(duì)這些蜂類的毒性、作用機(jī)理和亞致死效應(yīng)方面的研究，這對(duì)于我國(guó)授粉蜂類種質(zhì)資源和多樣性保護(hù)策略的制定具有重要的參考價(jià)值。此外，在制定作物的綜合防控策略時(shí)，應(yīng)該考慮防治措施對(duì)傳粉昆蟲，天敵昆蟲等有益生物的影響，使用對(duì)環(huán)境友好的生物農(nóng)藥，合理使用化學(xué)農(nóng)藥；建立并推廣蜜蜂授粉與綠色防控技術(shù)體系，保障蜜蜂等授粉昆蟲的福利，將有害生物綜合治理(integrated pest management, IPM)轉(zhuǎn)換為有害生物和授粉昆蟲的綜合管理(integrated pest and pollinator management, IPPM)[89]，促進(jìn)我國(guó)養(yǎng)蜂業(yè)、授粉業(yè)和農(nóng)業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展。